实验十八 淀粉酶活力的测定

一、目的

学习和掌握测定淀粉酶（包括α-淀粉酶和β-淀粉酶）活力的原理和方法。

二、原理

淀粉是植物最主要的贮藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。淀粉经淀粉酶作用后生成葡萄糖、麦芽糖等小分子物质而被机体利用。淀粉酶主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶两种。α-淀粉酶可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又称为液化酶。β-淀粉酶可从淀粉的非还原性末端进行水解，每次水解下一分子麦芽糖，又被称为糖化酶。淀粉酶催化产生的这些还原糖能使3,5-二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，其反应如下：

淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。用标准浓度的麦芽糖溶液制作标准曲线，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。

淀粉酶存在于几乎所有植物中，特别是萌发后的禾谷类种子，淀粉酶活力最强，其中主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。两种淀粉酶特性不同，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化。β-淀粉酶不耐热，在70℃15min钝化。根据它们的这种特性，在测定活力时钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。本实验采用加热的方法钝化β-淀粉酶，测出α-淀粉酶的活力。在非钝化条件下测定淀粉酶总活力（α-淀粉酶活力+β-淀粉酶活力），再减去α-淀粉酶的活力，就可求出β-淀粉酶的活力。

三、实验材料、主要仪器和试剂

1．实验材料

萌发的小麦种子（芽长约1cm）

2．仪器

（1）离心机

（2）离心管

（3）研钵

（4）电炉

（5）容量瓶：50mL×1, 100mL×1

（6）恒温水浴

（7）20mL具塞刻度试管×13

（8）试管架

（9）刻度吸管：2mL×3, 1mL×2, 10mL×1

（10）分光光度计

3．试剂（均为分析纯）

（1）标准麦芽糖溶液（1mg/mL）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100mL。

（2）3,5-二硝基水杨酸试剂：精确称取3,5-二硝基水杨酸1g，溶于20mL 2mol/L NaOH溶液中，加入50mL蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100mL。盖紧瓶塞，勿使CO₂进入。若溶液混浊可过滤后使用。

（3）0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液 

A液：（0.1mol/L 柠檬酸）：称取C₆H₈O₇·H₂O 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

B液：（0.1mol/L柠檬酸钠）：称取Na₃C₆H₅O₇·2H₂O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。

取A液55mL与B液145mL混匀，既为0.1mol/LpH5.6的柠檬酸缓冲液。

（4）1%淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100mL 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。

四、操作步骤

1．麦芽糖标准曲线的制作

取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：

表1  麦芽糖标准曲线制作

摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20mL。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

2．淀粉酶液的制备

称取1g萌发3天的小麦种子（芽长约1cm），置于研钵中，加入少量石英砂和2mL蒸馏水，研磨匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6mL蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数分钟搅动1次，使其充分提取。然后在3 000r/min转速下离心10min，将上清液倒入100mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液，用于α-淀粉酶活力测定。

吸取上述淀粉酶原液10mL，放入50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于淀粉酶总活力的测定。

2． 酶活力的测定：取6支干净的试管，编号，按表2进行操作。

表2  酶活力测定取样表

将各试管摇匀，显色后进行比色测定光密度，记录测定结果，操作同标准曲线。

五、结果计算

计算Ⅰ- 2、Ⅰ- 3光密度平均值与Ⅰ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下列公式计算α- 淀粉酶的活力。

计算Ⅱ- 2、Ⅱ- 3光密度平均值与Ⅱ- 1光密度之差，在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg），按下式计算（α＋β）淀粉酶总活力。

β-淀粉酶活力＝（α＋β）淀粉酶总活力－α-淀粉酶活力

六、附  注

（1）样品提取液的定容体积和酶液稀释倍数可根据不同材料酶活性的大小而定。

（2）为了确保酶促反应时间的准确性，在进行保温这一步骤时，可以将各试管每隔一定时间依次放入恒温水浴，准确记录时间，到达5min时取出试管，立即加入3,5-二硝基水杨酸以终止酶反应，以便尽量减小因各试管保温时间不同而引起的误差。同时恒温水浴温度变化应不超过±0.5℃。

（3）如果条件允许，各实验小组可采用不同材料，例如萌发1d、2d、3d、4d的小麦种子，比较测定结果，以了解萌发过程中这两种淀粉酶活性的变化。

七、思考题

1．为什么要将Ⅰ- 1、Ⅰ- 2、Ⅰ- 3号试管中的淀粉酶原液置70℃水浴中保温15min？

2．为什么要将各试管中的淀粉酶原液和1%淀粉溶液分别置于40℃水浴中保温？

参考答案

1．由于β-淀粉酶不耐热，70℃15min被钝化，所以将此3个试管中的溶液在70℃保温15min使其钝化，从而测得的淀粉酶活性即为α-淀粉酶活性。

2．酶反应需要适当的温度，只有在一定的温度条件下才表现出最大活性，40℃是淀粉酶的最适温度，所以应将酶液和底物（淀粉液）先分别保温至最适温度，然后再进行酶反应，这样才能使测得的数据更加准确。

（唐 咏）

http://www.scuta.edu.cn/yuanxi/bylw/syzd/srdsyzdsy18.htm

实验五 双缩脲法测定蛋白质含量（考核实验）

一、 教学目的与要求：

① 加强对蛋白质的有关性质的认识；

②掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；

③对学生所学进行综合的测试。

二、 教学实验原理：

蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu²⁺形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。

在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。

除-CONH-有此反应外，-CONH₂-，-CH₂-，NH₂-，-CS-CS-NH₂，等基团亦有此反应。

三、 考核主要内容

1、  标准曲线的制作

取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以管为空白，在550nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标线。

2、  样品测定：取样品液1.0 ml，同法进行，测其OD值，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。

3、  分光光度计的使用：规定每组在10min以内全部完成操作（共测6支管）；同时注意操作是否规范。

4、  成绩的计算：此次的实验占30%（包括平时的表现及实验报告的完成情况和完成质量），平时的五次实验共占70%，每次实验按总分为5分为满分进行打分，总评折合成百分制。

四、 实验注意事项：

①     标准样品的浓度为：10μg/ml；

②     实验过程中不得过问他人，同组人可以配合进行；

③     实验报告在课堂上独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他人数据，一旦发现以零分处理；

④     实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做；

⑤     对实验结果进行简单的分析。

http://www.scuta.edu.cn/yuanxi/bylw/syzd/syzdsy5.htm

3.5 氨基酸态氮的测定(酸度计法)
开始操作同总酸的测定，然后加入甲醛10ml，摇匀，继续用0.0500N氢氧化钠标准溶
液滴定至PH9.2，记下加入甲醛后耗用0.0500N氢氧化钠标准溶液毫升数V。
用同一条件做一空白对照，记下耗用数V0。
按式(6)计算：

　 　　                 (V-V₀)×N×0.014
氨基酸态氮(g/100g)= 　━━━━━━━━━━×100 .......................(6)
　　 　　　　　　　　　　　　　　　W
　　 　　　　　　　　　　　　10×━━
　　 　 　　　　　　　　　　　　　　S

式中：V——样品加入甲醛后，耗用0.0500氢氧化钠标准溶液毫升数；
V₀——空白加入甲醛后，耗用0.0500N氢氧化钠标准溶液毫升数；
N——氢氧化钠标准溶液当量浓度；
0.014——氮的毫克当量；
W——样品重量；
S——样品稀释液体积，ml。

http://www.foodmate.net/cgi-bin/topic.cgi?forum=12&topic=627&show=0

2.8.4  氨基酸态氮测定（酸度计法）

2.8.4.1  氨基酸是蛋白质分解出来的产物，酱油中氨基酸有18种，其中以谷氨酸占比例最多。因此氨基酸态氮的含量高低可表示鲜味的程度，是决定酱油质量及营养价值的重要指标。一般含量在0.4——0.8%之间。当酱油掺伪时，氨基酸态氮含量明显降低。伪造酱油中根本不含氨基酸态氮。

2.8.4.2  原理  利用氨基酸的两性作用，加甲醛固定氨基的碱性，使羧基的酸性显示，用氢氧化钠标准溶液滴定后定量，以酸度计测定终点。

2.8.4.3  试剂是36%甲醛溶液；0.05N氢氧化钠标准溶液。

2.8.4.4  仪器  酸度计；磁力搅拌器；微量滴定管。

2.8.4.5  操作  取样品5.0ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中，加水60ml，开动磁力搅拌器，用0.05N氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示_PH8.2时加入10.0ml甲醛溶液，混匀后继续滴定至_PH9.2，记下消耗0.05N氢氧化钠标准溶液的ml数。同时取水80ml做试剂空白试验。

    （V₁—V₂）×N×0.014

X= ——————————×100

      5×Ｖ₃

         100

Ｘ－样品中氨基酸态氮含量，g/100ml。

Ｖ_１－测定用样品稀释液加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml。

Ｖ_２－试剂空白试验加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml。

Ｖ_３－样品稀释液取用量，ml。

Ｎ－氢氧化钠标准溶液的当量浓度。

0．14－１ml１Ｎ氢氧化钠标准溶液相当氮的数。

2.8.4.6  判断  如酱油中氨基酸态氮低于正常值，可认为酿造酱油中掺入水或盐水。如氨基酸态氮检不出，可能是伪造酱油。

http://shyux.go.nease.net/ziliao/jiancff/jiancc.htm

氨基态氮测定

中国食品产业网 （20##年10月30日09:55）

5.20.1 原理：

氨基酸为两性电解质。在接近中性的水溶液中，全部解离为双极离子。

当甲醛溶液加入后，与中性的氨基酸中的非解离型氨基反应，生成单羟

甲基和二羟甲基诱导体。此反应完全定量进行。此时放出氢离子可用标

准碱液滴定。根据碱液的消耗量，计算出氨基态氮的含量。

5.20.2 试剂：

所用试剂均为分析纯，使用的水为蒸馏水或同等纯度的水。

5.20.2.1 0.1MOL/L 氢氧化钠标准溶液：按GB601配制与标定。

5.20.2.2 0.05MOL/L 氢氧化钠标准滴定溶液：用0.1MOL/L的氢氧化钠标准溶

液当天稀释。

5.20.2.3 中性甲醛溶液：量取200ML甲醛溶液（GB685）于400ML烧杯中，置

于电磁搅拌器上，边搅拌边用0.05MOL/L氢氧化钠溶液调至PH8.1。

5.20.2.4 30%过氧化氢（HG3-1082）

5.20.2.5 PH7.00、4.01缓冲溶液。

5.20.3 仪器设备：

实验室常用玻璃仪器及下列各项：

5.20.3.1 PH计：直接读数，测量范围0-14PH，精度±0.1PH。

5.20.3.2 电磁搅拌器。

5.20.3.3 玻璃电极

5.20.4 试样的制备：

5.20.4.1 浓缩果蔬汁

在浓缩果蔬汁中，加入与在浓缩过程中失去的天然水分等量的水，使

其成为果汁，并充分混匀，供测试用。

5.20.4.2 果蔬原汁及果蔬汁饮料

将试样充分混匀，直接测定。

5.20.5 测定步骤：

5.20.5.1 PH计校正：按W-PBB-4303中“PH值测定作业规范”校正步骤校正。

5.20.5.2 吸取试样M克(毫升)(氨基态氮的含量为1-5毫克)于烧杯中，加5滴

30%过氧化氢，将烧杯置于电磁搅拌器上，电极插入烧杯内试样中适当

位置。如需要加适量蒸馏水。

5.20.5.3 开动电磁搅拌器，先用0.1MOL/L氢氧化钠溶液慢慢中和试样中的有机

酸。当PH达到7.5左右时，再用0.05MOL/L氢氧化钠溶液调至PH8.1，

并保持1分钟不变。然后慢慢加入10-15ML中性甲醛溶液。1分钟后

用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至PH8.1。记录消耗0.05MOL/L氢氧化

钠标准滴定溶液的毫升数。

5.20.6 结果表示：

--------------------------------------------------------------------------------

测定结果表示见公式： X=

X：每100克（或100毫升）试样中氨基态氮的毫克数，（mg/100g或

mg/100ml）

C：氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，MOL/L

V：加入中性甲醛溶液后，滴定试样消耗0.05MOL/L氢氧化钠标准滴定溶

液的体积，ML

M：试样的重量，G（或体积ML）

K：稀释倍数

14：1ML1N氢氧化钠标准滴定溶液相当于氮的毫克数

同一样品以两次测定结果的算术平均值作为结果，精确到小数点后第一位。

http://mzr3228.foodqs.com/news/spsb03/2004103095527.htm

第二篇：《第一节降低化学反应活化能的酶》说课稿

《第一节降低化学反应活化能的酶》说课稿

一、说教材

《降低化学反应活化能的酶》是人教版必修一第五章第一节的内容，本节课以实验设计为载体、联系生活实际，帮助学生认识酶，包括酶在细胞代谢中的作用，酶的本质以及酶的3个特性。通过实验探究，使学生建立酶的概念、知道酶的特征，并能初步用酶的知识解释生活中的现象；在探究中学习科学解决问题的方法步骤，体会设计对照实验的原则，学习由“特殊到一般”的思想方法。 本章的学习即帮助学生建立“生物学实验设计原则”的思想，又为后面学习新陈代谢打好基础，尤其是〈第三节呼吸作用〉、〈第四节光合作用〉的学习，无论在知识上还是在方法上都具有积极的意义。

1、教学目标

1）.知识目标： ①说明酶在细胞代谢中的作用；说出酶的化学本质。

②说明酶的催化作用具有高效性的原因。

③解释酶的作用条件较温和、催化作用具有专一性、高效性

对于生命活动的意义。

④设计“影响酶活性的条件”的实验方案和步骤，撰写实验

探究性活动的实验报告，总结成功的经验、分析失败的原因。

2）.技能目标：学会控制变量，设计对照实验

3）.情感目标：①评价自己的方案和别组同学的方案，②参与交流，听取别

人的正确意见，维护或修改自己的方案和意见。

2、教学重点、难点分析：

1）、教学重点

（1）酶在细胞代谢中的作用

（2）通过实验探究酶的高效性

（3）酶的高效性

2）、教学难点

（1）酶能够降低化学反应的活化能；

（2）控制变量的科学方法

探究性活动有利于培养学生的创新精神和实践能力，有利于学生主动建构知识、发展能力、形成正确的情感态度与价值观。这一活动具有相当的难度，首先，需要学生自己决定和判断的因素很多，如：设计探究的方向，设计实验的步骤，选择实验的材料，如何控制变量，如何检验结果??等等，无疑，这对于学生来

说是非常具有挑战性的。这应该成为本节教学活动的重点和难点。

学习酶的特性，不能只局限于了解的层次，应该通过分析和引导，将学生的知识上升到理解的层次，才能达到理解生命活动中物质的变化所伴随着的能量转换，领悟细胞的代谢活动是细胞进行其他生命活动的基础的水准，达到课标的要求。这需要从感性上升到理性，因此，这也是本节教材的一个重点和难点。

二、说学生

本节授课对象为高一的学生：

1）他们对细胞内的化学反应了解很少，但对无机化学反应却接触较多，对加快化学反应的速率的方法有一定的了解。

2）他们思维活跃、求知欲强，具有一定的分析问题的能力，但缺乏探究经验，习惯演绎式教学模式。

三、说教法

根据上述对教材和学生的分析，本节采用以下教法：

1）启发式教学法——以设问和疑问层层引导，激发学生动机，启发学生积极思考，逐步从常识走向科学，将感性认识提升到理性认识，培养和发展学生的抽象思维能力。

2）实验探究教学法——从反应物、反应条件、实验原理、实验步骤、现象记录和分析、归纳得出结论等方面，引导学生理解实验设计，进行实验操作并尝试改良实验设计，从具体到抽象、从实践到理论来深化科学探究思想，培养学生的小组协作能力和科学探究能力。

3）直观教学法——教材中活化能概念的文字叙述很抽象，虽然加入了卡通式插图和图解，但仍然是平面的、静止的，很难实现知识迁移。而Flash动画是立体的、直观的、动静结合的，并且能够展示不同条件下的反应情况，突出重点，易化难点

教具准备：多媒体课

四、说学法

学习方法指导：

1）、跟随老师的问题，积极思考，将原有的知识应用到新知识的学习中，完成知识的迁移。

2）、通过资料分析认识酶的化学本质，指导学生阅读资料，分组讨论，筛选有用信息并归纳总结。

3）、结合书本的文字叙述、图片和老师展示的动画，提高分析、归纳能力。 课时安排：3课时，

第一课时 酶在细胞中的作用和酶的本质

第二课时 高中生物学实验设计

第三课时 酶的特性

设计理念

实验是学习生物的手段和基础，是培养学生分析问题、解决问题的能力及创造能力的载体。新课程倡导：强调过程，强调学生探索新知识的经历和获得新知的体验，不能在让教学脱离学生的内心感受，必须让学生追求过程的体验。并且每年高考都有对生物学实验的考查，而且比例越来越重，而学生的失分比例大，主要在于他们没有完整的生物实验设计模式，考虑问题欠缺，本节安排在第二课时完整讲述高中生物学实验设计，是以学生在第一课时和前面探究实验接触的前提下，完整体验生物实验设计模式，为后面学习探究实验打下基础，也为培养学生分析问题、解决问题从一开始就打好基础。

五、说教学过程：

1）教学流程图

第一课时

联系生活，导入新课，激发学生学习兴趣→细胞代谢→问题探究，酶在代谢中的作用，掌握科学实验方法→酶的本质，运用方法，自主归纳获取新知→小结练习，突出重点易化难点

第二课时

情景导入新课→实验设计的类型→实验方案的内容→实验设计的一般程序→实验设计应遵循的原则→设计实验方案的一般思路→实验设计的常用方法→练习巩固。

第三课时

复习导入→酶的高效性→酶的专一性→酶的作用条件温和→练习巩固

2）作业布置 1、给你一份某种酶的结晶，你能设计实验鉴定它是不是蛋白质吗？请简略写出实验步骤。想一想，在萨姆纳之前，为什么很难鉴定酶的本质？

2、通过学习关于酶的作用和本质的探索写一篇短文，谈谈对科学发展过程的认识。

3、请设计一则加酶洗衣粉的商业广告。要求注意广告用语的科学性，同时给人以美的感受，反映出科技含量，符合广告法。

3）板书设计

一 酶的作用

细胞代谢 酶在代谢中的作用

活化能 酶的催化作用

二 酶的本质

1、酶本质的发现过程：

巴斯德 李比西

毕希纳

萨姆纳

切赫.奥特曼

2、酶的本质：酶是活细胞产生的具有催化作用的有机物，其中绝大多数酶是蛋白质

三 酶的特性

酶的高效性、专一性

酶的作用条件：较温和

六、教学评价

实验记录和评价表、课堂小结和练习、课后实验设计。 教学反思：生物科学史展现了科学家曲折而艰辛的探究过程，引导学生分析科学史，不仅能促进学生更好的理解基本概念和原理，而且能培养学生继承、创新和勇于实践的科学精神和科学态度。所以，生物科学史是落实情感态度价值观目标的生动材料。生物科学史的教学既不能简单带过，又不必让学生将科学史本身作为基础知识来记忆，而应将科学史当作供学生分析和讨论的材料，并及时对原理和结论进行归纳，让学生踏着科学家的足迹感受科学研究的过程。

关于“降低化学反应活化能的酶”，教师可以先提出精心设置的问题，然后引导学生带着问题自己阅读并分析资料，逐步揭示科学家的探究历程，体会科学就是在不断探究和不断争论中前进发展的。