专业文献综述
目:
名:
院:
业:
级:
号:
导教师: CDC3敲出载体构建 逄崇洋 植物保护学院 植物保护 植保104班 12110424 陈长军 职称: 教授
2014 年 3 月 10 日
南京农业大学教务处制 题 姓 学 专 班学 指
氰基丙烯酸酯类氰烯菌酯杀菌剂毒理学研究进展
CDC3敲出载体构建
植物保护专业学生 逄崇洋
指导教师 陈长军
摘要：禾谷镰孢菌是我国引起小麦赤霉病的主要病原菌。氰烯菌酯是一种新型的杀菌剂，化学结构新颖，作用机制独特，与现有的杀菌剂无交互抗性。该药剂在离体条件下，对小麦赤霉病菌的抑菌活性是苯并咪唑类杀菌剂多菌灵的4倍。目前，已经完成农业部的相关登记，已经成为防治小麦赤霉病主要药剂之一，并能够有效治理小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性。但是，本实验室的前期研究表明：该药剂在离体条件下容易获得小麦赤霉病菌对氰烯菌酯的抗药性，因此认为其具有中等—高等的潜在抗药性风险。为此，进行小麦赤霉病菌对氰烯菌酯的抗药性机制的研究迫在眉睫，为科学制定该杀菌剂的应用策略，延缓抗药性的产生和建立抗药性群体检测技术具有重要意义。
FGSG-05315是野生型禾谷镰孢菌2021经氰烯菌酯处理一定时间后表达量发生上调/下调的两个基因。为了揭示禾谷镰孢菌对氰烯菌酯抗药性中的作用，以氰烯菌酯表现高抗的菌株（JS399-19HR）Y2021A为出发菌株，采用Double-joint PCR方法，构建含hph-hsv基因的载体。
关键词：氰烯菌酯；禾谷镰孢菌；基因载体
The Analysis of the Mechanism of the JS399-19 to
Fusarium graminearum
Student majoring in Plant Protection Chongyang Pang
Tutor Changjun chen
Abstrack:Fusarium head blight (FHB), caused by Fusarium graminearum, is one of the most devastating fungal diseases in wheat in China. JS399-19 is a novel cyanoacrylate fungicide with unique chemical structure with specific mode of action against Fusarium spp. In vitro, JS399-19-resistant mutants were obtained easily by ultra-violet（UV）irradiating and fungicide training and the fitness of JS399-19 resistant mutants was not decreased significantly. Potential resistance risk of F. graminearum to JS399-19 can be divided intothe level of moderate-high. In order to develop a sound recommendation for the use of a new crop fungicide and detection technique for resistance, the resistance mechanism of F. graminearum to JS399-19 should be studied before the resistance appears in the field.
FGSG-05315 was expressed differently during the sensitive strain 2021 treated with JS399-19 for 0~36 hours in vitro. To evaluate the role of the two genes in the resistance of F.graminearum against JS399-19, F.graminearum isolate Y2021A (high-resistant to JS399-19(JS399-19HR) was used for the analysis of functions of FGSG-05315. FGSG-05315 was １
knocked out respectively by using a double-joint polymerase chain reaction (PCR). The hph-hsv fragment was transferred into F. graminearum via homologous double crossover at the site where the FGSG-05315gene of F. graminearum are normally located (the FGSG-05315 gene of F. graminearum had been deleted).
Key words: JS399-19；Fusarium graminearum；Genetic vector
由禾谷镰抱菌引起的赤霉病是危害小麦,燕麦等多种禾谷类作物上的重要病害,它广泛分布于世界各个温暖潮湿的地区。近些年来,随着地球气候的变暖以及轮作和免耕等耕作制度的变化,小麦赤霉病己经成为我国小麦生产中最重要的病害之一[1-3]。在我国,赤霉病发生区域过去主要集中在长江中下游地区、华南冬麦区和东北春麦区,在黄河流域及其附近区域也时有发生,并逐渐向北方扩展蔓延。小麦赤霉病的发生区域面积已达7x106hm2,约占全国小麦种植总面积的1/4,每年因赤霉病危害损失产量约200万t~300万t。禾谷镰抱菌可侵染寄主植物的整个生长周期,引起种腐、苗腐、茎腐和穗腐,其中以穗腐带来的危害和损失最大,据统计,赤霉病中度流行年份病穗率20%一40%,可减产5%一巧%;严重流行年份病穗率达40%一50%,严重地块可达100%,减产10%一40%,甚至颗粒无收。而且,赤霉病菌产生的多种衍生真菌毒素及次生代谢物质能污染粮食作物种子,引起人畜呕吐、腹痛、头昏等急性中毒现象,并可在食物链中长期存留,还可能产生致癌物质,严重威胁着人和动物的健康。
从上世纪80年代开始,国外公司对2-氰基-3-取代苯基丙烯酸酷和它们的衍生物进行了化学合成和生物活性的研究,这些化合物均具有2-氰基-3-取代氨基丙烯酸醋或2-氰基-3-取代氨基丙烯酞胺的主体结构。其中Stauffer化学公司专利报道了2-氰基-(N-甲基苯胺基)丙烯酞胺类的化合物和2-氰基-3-(N-甲基-N-取代苯甲胺基)丙烯酞胺类的化合物具有除草活性。日产化学工业株式会社专利报道了2-氰基-3-(N-取代苯胺基)丙烯酸酷类的化合物具有杀菌活性。
氰烯菌酯属2-氰基丙烯酸酯类,是一种结构新颖、作用方式独特的、具有自主知识产权的新型杀菌剂[4]。该杀菌剂是由江苏省农药研究所于19xx年合成,于20xx年进入田间试验阶段,目前已获得中国发明专利,并于20xx年在中国完成了农药的临时登记。
1、氰烯菌酯毒理学研究
形态毒理学：
通过前期的研究证明,氰烯菌酷的专化性强、杀菌活性高,对植物病害具有良好的预 ２
防作用和治疗作用。对由镰抱菌菌引起的多种植物病害具有良好的防治效果[5-9]。能有效控制小麦赤霉病、水稻恶苗病和西瓜枯萎病。陈雨等研究了氰烯菌酯能够有效抑制禾谷镰孢菌野生敏感菌株分生孢子萌发，但是不能抑制抗药性菌株的分生孢子萌发。研究表明：野生菌株和抗性菌株在用氰烯菌酯处理12小时后的萌发率没有显著性差异，都可以正常萌发。但是敏感菌株和抗性菌株的萌发情况会随着药剂浓度的不同而不同。敏感菌株在高剂量药剂浓度下，分生孢子的萌发速率显著降低，处理6小时后仅有少量孢子萌发；但对于抗性菌株，低剂量反而会促进抗性菌株的萌发速率，高剂量在抑制萌发几小时后，又恢复萌发速率，尤其在8小时 后，抗性菌株的萌发率和对照差异无显著性差异 [10]。说明氰烯菌酯可以减慢禾谷镰孢菌分生孢子的萌发速率，但药剂处理8 小时后孢子的萌发速率却恢复正常，不受抑制。
生化机制
虽然氰烯菌酯处理一定时间后不影响禾谷镰孢菌的分生孢子的萌发率，但该药剂能够强烈抑制萌发的分生孢子的芽管的伸长。对于敏感菌株，处理药剂的剂量越大，敏感菌株芽管的伸长受到的抑制就越大；对于抗性菌株，低计剂量的药剂不但不抑制分生孢子芽管的伸长，反而会起到促进作用。 说明氰烯菌酯能够强烈抑制敏感菌株的芽管伸长，但对抗性菌株的芽管则没有强烈的抑制作用。
氰烯菌酯影响禾谷镰孢菌分生孢子的萌发方式。非胁迫条件下，分生孢子从顶端开始萌发概率高，从中间或基部萌发的概率很低 [11]。以上的实验数据虽然表明，敏感菌株和抗性菌株在经过氰烯菌酯处理12 h后都可以正常萌发，甚至萌发率接近100% 。但是，随着氰烯菌酯处理的剂量的加大，敏感菌株和抗性菌株的分生孢子出现非正常的萌发状态，即从基部和中间位置萌发的概率增加，其中敏感菌株比抗性菌株表现的更为显著[12]。这说明氰烯菌酯能够影响禾谷镰孢菌分生孢子的萌发方式。
氰烯菌酯不仅影响禾谷镰孢菌敏感菌株分生孢子的萌发方式，还影响其分生孢子的形态，当用氰烯菌酯处理敏感菌株的分生孢子时候，分生孢子会出现肿胀扭曲的畸形，甚至萌发的芽管也呈现上述畸形现象[12]。但是氰烯菌酯对抗性菌株的分生孢子和萌发芽管的致畸作用不明显。
以上所有实验结果表明，在供试药剂浓度下，氰烯菌酯虽然不能够杀死敏感菌株的分生孢子，但是在一定程度上减缓了其萌发速率，而且改变分生孢子的萌发方式，扭曲畸形了分生孢子和芽管的细胞形态，进而降低了病菌对麦类作物等寄主的侵染能力，达到了小麦赤霉病的防治要求。
氰烯菌酯不能抑制禾谷镰孢菌菌体的呼吸作用[13]。
李恒奎等在室内通过紫外线照射和药剂驯化的方法获得了14个禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗药性突变体，将这些抗性突变体分为低抗、中抗、高抗3种类型[14]。
３
抗氰烯菌酯的禾谷镰孢菌对所测定的苯并咪唑类、有机硫类、麦角甾醇生物合成抑制剂类、甲氧基丙烯酸酯类和取代苯类5种类不同作用机制的杀菌剂等都表现为敏感，说明氰烯菌酯的作用机理和这些杀菌剂的不同，有自己独特的作用方式，与常用的杀菌剂不存在交互抗性 [14,15]。
2、氰烯菌酯抗药性机制研究进展
将获得的抗性菌株在不含氰烯菌酯的马铃薯培养基上连续培养，8代以后，抗性菌株对氰烯菌酯的抗药性特征稳定，说明氰烯菌酯抗性突变体的抗性能够通过无性繁殖稳定遗传 [14,15]。
氰烯菌酯抗性突变体在PDA平板生长速率以及PD液体摇培条件下的菌丝干重与敏感菌株相比没有一致规律，实验结果表明抗性突变体UV-2021-4、Y-2021-E和Y-2021-F的线性生长速率与其亲本菌株2021相比显著降低,，但是它们的菌丝干重和亲本菌株相比却没显著差异。这说明，这三个抗性菌株的平板生长速率虽然减慢，但是平板菌落气生菌丝比敏感亲本菌株2021致密；其他供试抗性菌株的菌丝生长速率和菌丝干重未出现这样的一致规律 [14,15]。抗性突变体致病力测验结果表明，与亲本菌株2021相比，抗药突变体致病力差异不显著；但产分生孢子数量，与2021相比，抗性突变体的分生孢子繁殖量显著下降。抗性突变体产子囊壳能力与敏感菌株相比存在显著性差异；所有供试抗性菌株和同一抗性水平的菌株也存在显著性差异[14,15]。
陈雨等发现禾谷镰孢菌对氰烯菌酯抗药性是由单个基因控制，当该基因的不同碱基位点发生突变或者同一碱基点发生不同的突变时都可能会导致不同的抗性水平（MR和HR），这种抗性机理不受修饰基因或者胞质遗传因素的影响[13]。
侯毅平通过蛋白质双向电泳技术，研究了氰烯菌酯对野生型敏感菌株2021和药剂训化菌株Y2021A（JS399-19HR）蛋白质组学的影响。用EC90（0.5μg/mL）浓度的氰烯菌酯处理2021和Y2021A（JS399-19HR），不加药的处理作为对照，12 h后测定各自蛋白差异。与抗性菌株相比，敏感菌株2021经氰烯菌酯处理后共有38个特异蛋白点的表达量表现出显著性差异，其中有37个点被成功鉴定出来。结果表明，与氰烯菌酯抗性相关的蛋白分为代谢相关蛋白、运动相关蛋白、调控相关蛋白、细胞信号传导相关蛋白以及其他蛋白。分析结果表明，氰烯菌酯对禾谷镰孢菌的氨基酸代谢系统、调控系统和信号传导系统影响较大，而对能量代谢系统影响较小。由此可以推测禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗药性可能是由调控相关蛋白或信号传导相关蛋白的表达变化引起的[16]。
侯毅平经过对原来存在的原生质体转化技术进行改进，建设立了更加高效的转化平台。以氰烯菌酯驯化的高抗菌株Y2021A为出发菌株，将hph和正负筛选标记基因（hph-hsv）两个基因分别转化到出发菌株中，获得随机插入突变体文库，并从中筛选氰烯菌酯敏感突变体。以筛选到的氰烯菌酯敏感性突变体为研究材料，对随机插入的片段进行定位发现：正负筛选标记替换了β2-tub的编码区。选择不同抗性水平的诱导菌株驯服突变体，并设计 ４
引物扩增它们的β2-tub，与敏感亲本菌株比对发现，抗药性突变体β2-微管蛋白第12、17、21、22、41和74位的6个氨基酸均发生不同的突变。
通过原生质体转化技术，分别构建了以氰烯菌酯野生敏感菌株2021和氰烯菌酯高抗菌株JT04-4的β2-tub敲除体/回复体。以氰烯菌酯药剂诱导菌株Y2021A的随机插入敏感性突变体为供试研究对象，结果表明：氰烯菌酯对野生型敏感菌株β2-tub敲除体和敏感性突变体的最低抑制抑制低浓度值下降了4倍；但与2021相比，EC50值生长抑制中浓度没有显著差异。氰烯菌酯高抗菌株JT04-4 β2-tub敲除突变体变为中抗菌株。与野生型敏感菌株相比，β2-tub 敲除突变体和随机插入敏感性突变体的菌丝生长速率、无性生殖能力、有性生殖能力及对麦穗的侵染力均显著下降；所有敲除突变体回复体对氰烯菌酯表现出与出发菌株相同表型。因此，侯毅平推断：β2-tub基因是禾谷镰孢菌对氰烯菌酯抗药性相关基因[16]。
Septin家族的蛋白是作为组织信号参与细胞的有丝分裂及胞质分裂过程的，这一家族的蛋白具有将各种关键蛋白募集至细胞生长部位或分裂部位的功能，从而调控隔的形成，菌丝的分枝以及分生孢子的形成，目前在Fusarium graminearum中被发现的有7种septin基因。目前在A.nidulans中已经发现了5种Septin基因，其中的AspB影响胞质分裂、分枝以及分生孢子的形成。在隔的形成初期，首先在分裂部位出现一个肌动蛋白环，而后AspB环定位于肌动蛋白环上，AspB环不内陷，而是裂开为双环，分别定位于隔的两侧。在隔的形成后期，位于其朝基部一面的AspB环消失，只余朝顶端一面的AspB环。在成熟的隔中，不存在肌动蛋白环和AspB环。蛋白AspB在隔上的定位也是需要SepA、 SepG和SepH蛋白，而且在隔上的定位发生在有丝分裂后[17].
根据前人研究结果，推测氰烯菌酯的作用位点与细胞骨架相关，而细胞骨架主要由微管蛋白、胞质分裂蛋白、肌动蛋白组成，所以本文利用基因敲出的方法对包裂蛋白基因家族的1个主要基因进行敲出，测定其敲出突变体对氰烯菌酯的敏感性，从而确定其是否为氰烯菌酯的作用靶标。
参考文献
[1] 余桂容, 张敏, 叶华智. 小麦赤霉病的生物防治研究（I. 拮抗芽袍杆菌的分离、筛选、鉴定和防病效果）[J]. 四川农业大学学报, 1998, 16(3): 314-318.
[2] 戴富明, 周世明. 防治小麦赤每病微生物菌株的筛选与利用[J]. 植物保护学报, 1995, 22(2): 112-116.
[3] 戴富明, 周世明, 周蓓琪, 等. 4个细菌菌株对小麦赤霉病的防治效果[J]. 上海农业学报, 1994, 10(4):
59-63.
[4] Yuan S K, Zhou M G. A major gene for resistance to carbendazim, in field isolates of Gibberella zeae[J]. Canadian Journal of Plant Pathology, 2005, 27: 58–63.
[5] 王龙根, 倪珏萍, 王凤云, 刁亚梅, 韦萍. 新杀菌剂JS399-19的生物活性研究[J]. 农药, 2004, 43(8): ５
380–383.
[6] Li H, Diao Y, Wang J, et al. JS399-19, a new fungicide against wheat scab[J]. Crop Protection, 2008, 27:
90-95.
[7] 李恒奎, 周明国. 氰烯菌酯对禾谷镰孢菌的生物活性及其内吸输导性研究[J]. 农药学学报, 2006,
8(1): 30-35.
[8] 李恒奎, 陈长军, 王建新, 等. 禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的敏感性基线及室内抗药性风险 初步评估
[J]. 植物病理学报, 2006, 36(3): 273-278.
[9] 李恒奎, 周明国, 王建新, 等. 氰烯菌酯防治小麦赤霉病及治理多菌灵抗药性研究[J]. 农药,
2006, 45(2): 92-94.
[10] 陈雨, 张文芝, 周明国. 氰烯菌酯对禾谷镰孢菌分生孢子萌发和菌丝生长的影响[J]. 农药学学报,
2007, 9(3): 235-239.
[11] Jelitto T C, Page H A, Read N D. Role of external signals in regulating the pre-penetration phase of
infection by the rice blast fungus Magnaporthe grisea [J]. Planta, 1994, 194: 471-477.
[12] 李恒奎, 陈长军, 王建新, 等. 禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的敏感性基线及室内抗药性风险初步评估
[J]. 植物病理学报, 2006, 36(3): 273-278.
[13] 陈雨. 新型杀菌剂氰烯菌酯对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的作用方式及抗药性遗传研究
[D]. 南京: 南京农业大学, 2009.
[14] 李恒奎, 陈长军, 王建新, 等. 禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的敏感性基线及室内抗药性风险初步评估
[J]. 植物病理学报, 2006, 36(3): 273-278.
[15] Chen Y, Li H, Chen C, et al. Sensitivity of Fusarium graminearum to fungicide JS399-19: in vitro
determination of baseline sensitivity and the risk of developing fungicide resistance[J]. Phytoparasitica,
2008, 36(4): 326-337.
[16] 侯毅平. 新型杀菌剂氰烯菌酯对禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)的作用方式及抗药性遗传研究
[D]. 南京: 南京农业大学, 2011.
[17] MomanyM,ZhaoJ,LindseyR,etal.CharacterizationoftheAspergillusnidulansseptin（asp）genefamily ［J］.Genetics,2001,157（3）：969-977.
６
专业文献综述成绩评阅表
７
８
