中性粒细胞淋球菌感染模型的建立
来源:医学论文发表——创新医学网/ 作者:陈嵘,陈 蕾,张国学,樊翌明,吴志华 作者单位:(广东医学院附属医院皮肤科,广东湛江 524001)
【摘要】 目的 研究诱导型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)在中性粒细胞淋球菌感染模型中的表达。方法 分离正常人外周血中性粒细胞,在10%胎牛血清DMEM培养液上培养3 h,A组加入空白培养基,B组加入淋球菌菌液,随后在0、3、8、12 h分别以实时定量荧光PCR测定iNOS mRNA表达,用镉还原法检测NO浓度。结果 B组中iNOS mRNA表达和NO水平均较A组升高(P<0.01),NO浓度在8 h达到高峰。结论 中性粒细胞淋球菌感染模型可成功模拟该菌体内微氧感染环境,可用于研究淋球菌致病机制。
【关键词】 淋球菌;中性粒细胞;一氧化氮
Establishment of gonococcusinduced neutrophil infection model
CHEN Rongyi, ZHANG Guoxue, CHEN Lei, FAN Yiming, WU Zhihua (Department of Dermatology, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)
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Abstract:Objective To investigate the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and nitric oxide (NO) in gonococcusinduced neutrophil infection model. Methods Peripheral blood neutrophils were islolated from health men, and then cultured in DMEM medium containing 10% fetal calf serum for 3 h. Blank medium or gonococcal inocula was added into group A or group B. NO concentration and iNOS mRNA expression at 0, 3, 8 and 12 h were determined by cadmium reduction method and realtime quantitative fluorescent PCR, respectively.Results Compared with group A, iNOS mRNA expression and NO level increased obviously in group B (P<0.01), and NO content peaked at 8 h.Conclusion The gonococcusinduced neutrophil infection model can simulate the microoxygen infection circumstance in vivo, and is suitable for studying the pathogenic mechanism of gonococcus.
Key words: gonococcus; neutrophil; nitric oxide
淋球菌为兼性厌氧的革兰阴性双球菌,可引起生殖系统急性化脓性炎症,脓性分泌物中存在大量中性粒细胞[1]。中性粒细胞是一种专职吞噬细胞,感染初期可在炎症介质的介导下聚集在病灶处,通过吞噬摄入致病菌[2]。中性粒细胞杀伤吞噬微生物的机制包括活性氧簇、抗菌蛋白、一氧化氮(NO)等[3]。尽管中性粒细胞在淋球菌感染初期可迅速聚集到病灶,但淋病的迁延不愈表明中性粒细胞引起的炎
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症反应不足以彻底清除淋球菌。中性粒细胞可杀灭大部分吞噬的细菌(如大肠杆菌),但部分淋球菌可在中性粒细胞内生存甚至繁殖[45]。淋球菌是如何实现免疫逃逸并得以在中性粒细胞内生存的问题目前尚未完全阐明。本研究拟建立中性粒细胞淋球菌感染模型,观察NO和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达,旨在将其用于研究淋球菌致病机制。
1 材料与方法
1.1 淋球菌菌株
淋球菌株ST2951用WGC淋球菌专用培养基培养(购自中国科学院武汉生物制品研究所)制备成OD600值为0.15的细菌悬液。
1.2 外周血中性粒细胞的分离
6名健康成年男性分别抽取2 mL肝素抗凝静脉血,取抗凝血与Hank液混匀后小心加入到人中性粒细胞分离液中(天津灏洋生物制品科技有限公司,LTS1087),18℃、2000 r/min离心20 min,待离心管由上至下分4层;吸取第3层(中性粒细胞)加入到含Hank液15 mL的试管中,充分混匀,2000 r/min离心10 min,弃上清,沉淀反复洗涤2次,再用含10%胎牛血清DMEM培养液重新悬浮细胞(1×
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107/mL);充分混匀后滴入细胞培养板中,置5%CO2培养箱37℃培养3 h备用。取少量细胞液涂片,作台盼蓝拒染实验,鉴定其存活率。
1.3 中性粒细胞淋球菌感染模型的建立
取出培养板,A组每孔加入含10%胎牛血清DMEM 培养液150μL,B组每孔滴入淋球菌悬液150μL;加样完毕后继续孵育,按0、3、8、12 h时间点在培养孔中吸出培养液作相应检测,每组设3个复孔。
1.4 实时荧光定量PCR检测iNOS mRNA含量
用Trizol溶液(美国GIBCO公司)提取中性粒细胞总RNA,经紫外分光光度计检测符合纯度后逆转录为cDNA,再进行实时荧光定量PCR检测。根据GeneBank序列设计iNOS、βactin引物,序列见表1。反应条件:94℃预变性3 min,94℃变性5 s,60℃退火10 s,72℃ 延伸20 s,共40个循环。应用SYBR GreenⅠ荧光染料(美国Biotium公司)技术行实时定量PCR反应,获取各组标本的标准曲线,计算机分析Ct值(每个反应管内荧光强度达到系统认为有目的DNA合成时的循环数,以阴性对照作参考)。表1 引物序列
1.5 NO浓度检测
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收集细胞培养液-70℃保存,用镉还原法测定亚硝酸盐浓度。培养液以3000 r/min离心5 min,用NaOH和硫酸锌作蛋白沉淀处理,3000 r/min离心5min,取上清液1.5 mL依次加入0.08 mmol/L 甘氨酸NaOH缓冲液1.0 mL、活化镉3.0 g,摇匀后放置90 min;取1 mL加入新试管,依次加入1% 磺胺0.5 mL、0.1% N1萘基乙二胺盐酸0.5 mL,摇匀后静置20 min,用721分光光度计测OD值(λ=546 nm,灵敏度=1,空白调0),根据该值计算亚硝酸盐浓度。
1.6 统计学处理
数据以(±s)表示,采用SPSS12.0统计软件进行单因素方差分析及q检验、t和t'检验。
2 结果
2.1 中性粒细胞中iNOS mRNA含量
实时荧光定量PCR显示:淋球菌刺激后B组中性粒细胞中iNOS mRNA含量均升高,而A组变化不明显(图1,表2);同一时间点相比,B组的iNOS mRNA表达显著高于A组(F=51.87,P<0.01)。
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2.2 细胞培养液中NO水平
A组NO水平明显低于B组(P<0.01)。A组各时间点NO浓度差异无统计学意义(F=0.865,P>表2 两组NO与iNOS mRNA表达同一时间点两组间比较,*P<0.01;同组不同时间点间比较,#P<0.01。
0.05);B组不同时间点NO浓度差异有统计学意义(F=106.79,P<0.01),8 h时最高(表2)。
2.3 iNOS mRNA与NO表达的关系
Spearman相关分析表明,B组中性粒细胞iNOS mRNA表达与细胞培养液中NO水平呈高度正相关(r=0.87,P<0.01)。
3 讨论
淋球菌侵犯黏膜单层柱状上皮细胞(如尿道、子宫颈)后,借助菌毛、蛋白Ⅱ、IgA1分解酶与细胞黏附,然后被吞饮进入细胞并大量繁殖,导致细胞损伤、裂解和死亡,释放出的淋球菌又可感染更多的黏膜上皮细胞。淋球菌感染时,LOS(lipooligosaccharide,脂寡糖)激活单核巨噬细胞,通过TLR4(模式识别受体)使NFκB转至细胞核内,导致炎性细胞因子的合成和释放[6]。IKB释放出活性成分P56、
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P60,其与DNA结合后促进炎症因子转录,如IL1β、TNFα、IL6、IL8、MHCⅡ、ICAMI、iNOS、COX2表达。IL1β、TNFα诱导多种黏附分子(VCAM1、ICAM1)表达,促进中性粒细胞黏附、渗出、趋化,引起化脓性炎症反应[2]。
中性粒细胞是抵抗淋球菌感染的主要炎症细胞,但淋球菌可通过某些机制逃逸免疫攻击。研究表明淋球菌可在中性粒细胞内生存甚至繁殖,这是引起淋病迁延不愈的原因。因此,有必要对淋球菌与中性粒细胞相互作用机制进行研究。我们将分离的正常人外周血中性粒细胞作体外培养,3 h后台盼蓝拒染实验显示中性粒细胞存活率达90%以上;培养的中性粒细胞中加入淋球菌悬液,孵育2h后可见淋球菌粘附于中性粒细胞表面或被吞入细胞内。用淋球菌刺激后,中性粒细胞iNOS mRNA表达和培养液中NO水平明显升高,8 h时NO浓度最高,iNOS与NO表达呈正相关;提示淋球菌感染可诱导中性粒细胞表达iNOS、合成NO。已有研究证实NO对炎症反应的作用依赖于其浓度改变,低浓度NO起抗炎作用,高浓度NO(如细菌脂多糖刺激iNOS所产生的NO)有促炎作用[7]。Householders等[8]通过对淋球菌norB基因的测定认为,淋球菌可产生和还原NO,并可通过控制NO产生来调节宿主的炎症反应,这种炎症调节机制将导致机体发生有症状或无症状感染。此外,Rock等[9]发现NO可诱导脑膜炎双球菌norB基因表达。
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本研究成功建立了中性粒细胞淋球菌感染模型,可模拟体内微氧感染环境,为进一步阐明淋球菌致病机制提供了可靠的研究方法。我们将利用此模型了解淋球菌norB、aniA等基因表达情况,深入探讨淋球菌的免疫逃逸机制。
【参考文献】
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卤米松乳膏治疗儿童面颈部白癜风22例临床观察
来源:医学论文发表——创新医学网/ 作者:梅长松 作者单位:河南省信阳市中心医院皮肤科,河南信阳 464000
【摘要】目的 观察卤米松乳膏治疗儿童面颈部白癜风的疗效。方法 选取于我院门诊就诊的43例面颈部白癜风患儿,随机分为2组,治疗组(22例)用卤米松乳膏局部涂搽患处,对照组(21例)外用丙酸氯培他索乳膏,均每天2次,疗程为3个月,每月复查1次。结果 治疗组痊愈4例,显效8例,有效9例,无效1例,总有效率为54.5%;对照组痊愈2例,显效9例,有效8例,无效1例,总有效率52.4%。两组疗效比较差异无统计学意义(Hc=0.066,P>0.05)。治疗组的副作用发生率为9.1%,明显低于对照组的76.2%(χ2=19.88,P<0.01)。结论 卤米松乳膏是治疗儿童面颈部白癜风的有效药物,且副作用较少。
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【关键词】 卤米松乳膏 白癜风 儿童
白癜风是一种原发性局限性或泛发性的皮肤色素脱失症,发病率为0.5%~1%。白癜风好发于颜面、四肢等暴露部位, 容易引起人们注意,患者常遭受非议甚或受到歧视, 造成极大的精神痛苦[1]。儿童也有发生,易造成心理损伤,影响人际交往。目前治疗白癜风手段多样,但疗效不尽人意,尤其是儿童白癜风的治疗更为困难。我科用0.05%卤米松乳膏治疗儿童面颈部白癜风22例,取得良好疗效,现报道如下。
1 资料和方法
1.1 病例与分组
43例面颈部白癜风患儿均为我院20xx年6月至20xx年6月间门诊就诊确诊的患者,将患儿随机分治疗组和对照组。治疗组22例,其中男15例,女7例,年龄2~12岁;病程2个月至3a,平均(12.2±0.3)个月;静止期17例,进展期5例。对照组21例,其中男13例,女9例,年龄3~12岁;病程3个月至3年半,平均(12.1±0.5)个月;静止期16例,进展期6例。所有患儿均无系统性疾病,2月内均未接受系统治疗,3个月内未接受糖皮质激素、紫外线以及其他外用药
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物治疗。两组患儿在年龄、性别、病程、病情方面无明显差别,具有可比性。
1.2 治疗方法
治疗组用卤米松乳膏(澳能乳膏,香港澳美制药有限公司生产)搽涂于皮损处,对照组外用丙酸氯培他索乳膏(恩肤霜,广东顺峰药业有限公司),轻揉5min使药物尽量吸收,每天2次,均不加用其他药物,3个月为1疗程。每月复查1次,记录疗效及副作用。所有患儿均完成并观察全过程。
1.3 疗效判定标准
参照中国中西医结合学会制定的标准[2]。痊愈:色素脱失斑全部消失,恢复正常肤色;显效:色素脱失斑部分消退或缩小,恢复正常肤色的面积为50%~90%;有效:色素脱失斑为部分消退或缩小,恢复正常肤色的面积<50%;无效:色素脱失斑无色素再生或范围扩大。
1.4 统计学处理
采用卡方检验、t检验及秩和检验对数据进行处理。
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2 结果
治疗组痊愈4例,显效8例,有效9例,无效1例,总有效率为54.5%;对照组痊愈2例,显效9例,有效8例,无效1例,总有效率52.4%。两组疗效比较差异无统计学意义(Hc=0.066,P>0.05)。
不良反应:治疗组有2例(9.1%)发生皮肤毛囊性丘疹及皮肤红斑,均出现在用药第3个月。对照组共有16例(76.2%)发生不良反应,其中3例出现毛囊性丘疹,5例出现皮肤红斑及毛细血管扩张,3例出现皮肤萎缩,5例出现不同程度的色素沉着。不良反应发生时间:5例出现在第1个月,10例出现在第2个月,1例出现在第3个月,未作特殊处理。经统计学分析,两组在副作用发生方面的差异有统计学意义(χ2=19.88,P<0.01)。
3 讨论
白癜风是一种特发性色素性脱失性疾病,有关其病因有三种假说:自身破坏学说、神经学说、自身免疫学说[3]。该病是具有遗传素质的个体在多种内外因子的激发下表现为免疫功能、神经精神及内分泌、代谢功能等各方面紊乱,导致酶系统的抑制或黑素细胞的破坏,或使黑素体的生成、黑化过程障碍,终至色素脱失[4]。其中免疫学说得到了越来越多的试验结果的支持。
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卤米松是一种含有三个卤族基团的强效皮质类固醇外用药,具有良好的抗炎、抗过敏、抗表皮增生等作用,其通过与甾体受体结合,可改变与病因有关的蛋白质合成,或作用于炎症细胞和溶酶体而调节炎症反应,常用于皮炎、湿疹、银屑病等病的治疗。卤米松乳膏副作用的发生率较小,耐受性较好。本组治疗组有效率为54.5%,与对照组比较,两者差异无统计学意义(P>0.05);但卤米松副作用少而轻,且发生较晚,在观察期第3个月才出现。对照组有16例出现不良反应,发生率为76.2%,与治疗组比较差异有统计学意义(P<0.01),且副作用发生较早,多出现在观察期治疗第1、2个月。由于儿童皮肤较薄,药物吸收较多,所以用药不宜超过3个月[5]。
综上所述,卤米松乳膏是治疗儿童面颈部白癜风疗效好、副作用少的药物之一,值得临床推广应用。
【参考文献】
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中药配合针灸治疗中老年人带状疱疹后遗神经痛的临床观察 来源:医学论文发表——创新医学网/ 作者:赖新平 作者单位:广东省兴宁市慢性病防治院皮肤科,广东 兴宁 514500
【摘要】目的:探讨中药配合针灸治疗老年带状疱疹后遗神经痛的疗效。方法:将166例患者随机分为中药口服加穴位针灸治疗组(A组)72例;针灸组(B组)56例;西药口服组(C组)38例,比较3组临床疗效。结果:A组与B组及C组总有效率比较差异均有统计学意义
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(P<0.05~0.01)。结论:口服中药配合针灸治疗带状疱疹后遗神经痛疗效显著,且无明显不良反应,易被患者接受。
【关键词】 带状疱疹;神经痛;后遗症;中药;针灸
Effect of combined therapy of traditional Chineses medicine and acupuncture on post herpetic neuralgia after zoster in the middleaged and elders
LAI Xinping
(Dermatology Department, Preventive and Treatment Hospital for Chronic Diseases in Xingning, Xingning 514500, China)
[ABSTRACT] Objective: To explore the effects of combined therapy of traditional Chineses medicine and acupuncture on post herpetic neuralgia after zoster in the middleaged and elders. Methods:
A total of 166 cases were randomly divided into combined therapy group (Group A, 72 cases) , acupuncture group (Group B, 56 cases), and western medicine group (Group C, 38 cases), and clinic effects in three groups were compared. Results: There were significant differences of total effective rate among three groups (P<0.05~0.01). Conclusions:
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Combined therapy of traditional Chineses medicine and acupuncture is effective on post herpetic neuralgia after zoster without inducing side effect, and is acceptable for patients.
[KEY WORDS] Zoster; Neuralgia; Sequela; Traditional Chinese medicine; Acupuncture
带状疱疹是由水痘带状疱疹病毒引起的累及神经及皮肤的常见病,临床以身体一侧出现带状分布的成簇小水疱,并伴有局部神经痛为特征。好发于老年患者。20xx年3月~20xx年5月我科采用中药口服加穴位针灸治疗该病,疗效满意,现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
搜集20xx年3月~20xx年5月我院门诊及住院的166例带状疱疹患者。年龄45~78岁,平均63.28岁,排除严重心、肝、肾功能损害者;严重高血压、糖尿病患者;长期使用皮质类固醇者及各种原因中断治疗者。将166例患者随机分为中药口服加穴位针灸组(A组)72例,针灸组(B组)56例,西药组(C组)38例。A组男性37例,女性35例,病程20d~18个月;B组男性32例,女性24例,病程24d~
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20个月;C组男性19例,女性19例,病程18 d~18个月。
1.2 方法
A组患者采用中药内服以理气活血,疏肝止痛为主,方药以柴胡疏肝散与活络效灵丹加减,基本处方:柴胡15g、枳壳15g、当归15g、赤芍15g、陈皮15g、甘草10g、丹参30g、乳香5g、没药5g、元胡15g、郁金15g,余邪未尽加黄芩15g、栀子10g,正气不足加黄芪30g,气阴两伤加党参15g、当归15g,头部加川芎10g,下肢加牛膝15g,夜寐不安加远志15g、合欢皮15g,水煎服,每日1付。穴位治疗:根据西医神经解剖定位取穴,确定支配疼区的神经节段,取其患侧夹脊穴:发于面颊部者,取颈2~颈4夹脊穴;发于胸背部者,取胸4~胸11夹脊穴;发于腰腹部者,取胸10~腰2夹脊穴;发于上肢者,取颈5~胸2夹背穴;发于下肢者,取腰1~腰5夹脊穴。有明显痛点者,可配合阿是穴,采用围刺法,即视疼痛局部范围大小,每次在痛区内取阿是穴3~8个,由痛区中心开始,依次向外围取穴,穴间上下左右间隔3cm左右,均匀分布。不同患者手法不同。(1)实证、急性痛症患者则用提插捻转,用泻法,留针20~30min,每日2次,用毫针刺,局部卧针横刺;(2)实证、急性病症患者可用三棱针于龙眼穴放血2~3滴,每日或隔日1次;(3)皮肤针或梅花针于疱疹周围浅刺,每日1~2次。
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B组患者口服维生素B1、维生素B6各10mg每日3次,每日肌肉注射维生素B12 1mL,同时配合针灸(针灸方法同上)。C组口服药物同B组,再配合曲安奈得注射液10mg、2%利多卡因注射液4 mL局部注射。
1.3 疗效判定标准
痊愈为疼痛基本消失,功能恢复;显效为疼痛明显减轻,偶有疼痛;有效为疼痛较前减轻,但仍有疼痛;无效为疼痛无改善,仍明显疼痛。总有效率以痊愈+有效+显效计算。
1.4 统计学处理
采用χ2检验,检验水准α=0.05。
2 结果
3组疗效见表1。A组总有效率(95.8%)明显高于B组(91.1%)和C组(65.8%)(P<0.05~0.01)。表1 3组临床疗效比较(略)
3 讨论
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带状疱疹是由水痘带状疱疹病毒引起累及神经及皮肤的病毒性皮肤病,病因传统医学描述为:(1)多因情志不遂、饮食失调,以致脾失健运,湿浊内停,郁而化热,湿热搏结,兼感毒邪而发。(2)以针灸言,带状疱疹病常为心经火旺、脾肺湿热与肝胆火旺所引发。再者带状疱疹后遗神经痛为“络”病,“久病入络”、“久痛入络”。络病,系指毒邪(病毒),侵入脉络、孙络、浮络等而导致的病变,毒邪的入侵破坏了神经细胞,使之发炎、出血、坏死,再加患者多是年老体弱,久病不愈,气血虚衰,不养脉络,造成了“至虚之处,便是留邪之地”;这些细小万亿数计的孙络、浮络被破坏而且还滞留了一些毒邪的残余,使其不能行使网络循环作用,孙络、浮络处于“绌急”状态(即络脉的收引挛缩状态),故疼痛不休。络病多属久病痼疾,正虚邪实。所以在治疗上重在理气活血,以柴胡疏肝散疏肝理气,使气行则血行;根据中医“久病必瘀”,“久病入络”的理论,以活络效灵丹起到活血化瘀的作用,理气与活血并用,共同起到宣疏经络之气,活血通络止痛的作用。再结合经络辨证,局部针刺与背俞穴针刺配合使用共同达到调畅全身气机,疏通经络之气而止痛的目的。而且应用中药口服以柴胡疏肝散与活络效灵丹加减制成丹药,该方剂疏肝解郁,理气活血,祛瘀止痛;中药熏蒸渗透性好,可以促进血液及淋巴液循环,改善局部组织营养,同时刺激皮肤的末梢感受器,形成新的反射,抑制或消除原有的病理反射,更好地发挥药物活血祛瘀止痛之功,二者结合使用,为治疗带状疱疹后遗神经痛提供了一个有效方法,经临床观察口服中药配合针灸治疗带状疱疹后遗神经痛疗效显著,总
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有效率达95.8%,能明显地减轻疼痛,缩短疼痛时间,且无不良反应,易被患者接受。
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