实验六 水中细菌总数和大肠菌群的检测

摘 要：本实验以测定公园河流水的细菌总数和大肠菌群的数量，来测定特定地点的水质情况。初步介绍了一种通用的方法来检测水源的健康指标，判定水体的质量。对该实验点的水源作出了定性的评价，以及关于试验中如何提高梯度重复的精度的分析。

关键字：河流水；细菌总数测定；大肠菌群；EMB培养

前言

各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中细菌总数往往同水体受有机污染程度呈正相关，因而是评价水质污染程度的重要指标之一。细菌总数是指1mL水样中所含细菌菌落的总数[cfu/g(mL)]，可用稀释平板计数法检测。水中大肠菌群的数量可用来判断水源是否被粪便污染，并可间接推测水源受肠道病原菌污染的可能。

特征：G-无芽孢杆菌，兼性厌氧、在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气。

多管发酵法

初发酵：适当稀释样品，乳糖发酵培养，产酸产气；

分离培养：伊红美蓝（EMB）平板上划线分离，出现紫色、粉红色特征性菌落； 复发酵验证：挑取特征性菌落进行乳酸复发酵验证。

材料和方法

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于水中细菌总数测定

牛肉膏5g，蛋白胨10g， NaCl 5.0 g，琼脂8g， 蒸馏水1000ml； pH 7.0

乳糖胆盐蛋白胨培养基：用于初发酵

1×：蛋白胨 20g、牛胆盐 5g、乳糖 10g、0.04%溴甲酚紫水溶液 25mL（调pH值后加）、水 1000mL、pH 7.2－7.4

三倍浓缩液（3×）：除水以外，其余成分取三倍用量

分装：1×的培养基分装9ml/管， 3×的培养基分装5ml/管或50ml/瓶，均装上德汉氏小管。 灭菌条件：115℃ ，15min。

EMB培养基：用于大肠菌群菌落鉴定

脱水培养基，按说明书操作，水用量为90%。

水源：紫竹院河水

仪器： 高压灭菌锅、无菌培养皿、试管、吸管、接种环 、德汉氏小管、温箱、载玻片、酒精灯、显微镜等。

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实验九 菌落总数的测定

一、目的要求

学习掌握菌落总数测定的基本原理和方法，了解食品上微生物的分布和繁殖动态。

二、实验说明

菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。

菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质等）去满足其要求才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作。细菌菌落总数的测定，所得结果，只包括一君能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧菌的菌落总数。

三、实验材料

（1）培养箱 36±1℃

（2）恒温水浴 46±1℃

（3）天平。

（4）可调式电炉。

（5）吸管 1.0ml、10.0ml,标有0.1ml单位刻度。

（6）广口瓶 500ml，有盖。

（7）玻璃珠 直径5mm。

（8）平皿 皿底直径9.0cm。

（9）试管 18×200mm。

（10）酒精灯。

（11）试管架。

（12）研钵。

（13）灭菌刀和剪刀。

（14）灭菌镊子。

（15）酒精棉球。

（16）玻璃蜡笔。

（17）营养琼脂培养基。

（18）灭菌生理盐水、分装于试管中，每管9.0ml。

（19）食品检样。

四、检验程序（图9-1）

五、方法步骤

（一）检验稀释和培养

1、以无菌操作，将检样25g（或25ml）剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水的广口瓶内（瓶内置有适量玻璃珠）或灭菌研钵内，经充分振摇或研磨用成1：10的均匀稀释液。

2、用1.0ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1.0ml，沿管壁徐徐注入含有9.0ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内液面），振摇试管混合均匀，作成1：100的稀释液。

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食品中菌落总数的测定实验

一、  实验目的：

了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放射菌、霉菌、的菌落特征。

二、原理

平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(colony-forming units，cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测

三、试剂和材料

1.仪器

恒温培养箱：（36 ℃±1 ℃，30 ℃±1 ℃。）

均质器或振荡器

无菌吸管：1 ml（0.01 ml 刻度）、10 ml（0.1 ml 刻度）或微量移液器及吸头

无菌锥形瓶：容量 250 ml、500 ml、

无菌培养皿：直径 90 mm

菌落计数器

 2.样品

     1）平板计数琼脂（plate count agar，PCA）培养基：蛋白胨5.0 g 、酵母浸膏2.5 g 、葡萄糖1.0 g 、琼 脂15.0 g、蒸馏水1 000 ml、pH 7.0±0.2。

将所有成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH。分装试管或锥形瓶，121 ℃高压灭菌15 min。

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实验八 水中菌落总数的测定及染色观察

一、实验目的

掌握国标中关于水中细菌总数的测定基本原理和方法；熟悉水体中细菌总数的检验方法、检验原理、检验依据、数据处理和报告方法。

二、实验原理

本实验应用平板计数技术测定污水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

三、实验试剂与器材

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，灭菌水；

灭菌三角烧瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管，培养箱等。

四、实验步骤

(1) 水样的准备

河水，已采集。

(2) 细菌总数测定

[1]. 稀释水样取3个灭菌空试管，分别加入9ml灭菌水。取1ml水样注入第一管9 ml灭菌水内，摇匀，再自第一管取1ml至下一管灭菌水内，如此稀释到第五管，稀释度分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30—300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。

[2]. 用灭菌吸管吸取1ml稀释水样，注入平板培养基的中心，并用无菌三角玻棒进行涂布。每个稀释度做三个平行，共做九个平皿。

[3]. 培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养48小时，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为1ml水样的细菌总数。

(3) 菌落计数方法

① 先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到

培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。

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  微生物实验原始记录

            粤珍小厨餐饮管理有限公司

                                                       编号：

主检：                  审核：            检验日期：        年   月   日

邹平县产品质量监督检验所检验原始记录

                                                        共  页 第  页

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微生物综合实验  水中细菌总数的测定

一、实验目的

1．学习水样的采集和水样中细菌总数的测定方法。

2．了解和掌握平板菌落计数的原则。

3．复习、巩固微生物实验的各单元操作。

二、实验原理

水中细菌总数的测定是进行水质检验的必要项目之一，主要作为判定饮用水、水源水、地表水等被污染程度的标志。

本试验采用平板菌落计数技术来测定水中的细菌总数。该法是根据在固体培养基上所形成的菌落来进行计数。菌落总数是指在一定条件下，1 mL水样所生长出来的细菌菌落的总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基和在一种条件下，使水中的所有细菌均能生长繁殖，因此，这种方法所得到的结果只是一种近似值。目前一般采用营养琼脂培养基，在需氧条件下，37℃培养36-48 h，所得到的细菌绝大部分是腐生性的嗜中温性需氧菌和兼性厌氧菌。

三、实验材料

1．检样：矿泉水等饮用水、河水、湖水、井水等。

2．培养基：营养琼脂培养基（附录Ⅱ-1.3）

3．仪器与其它用具：三角烧瓶，广口瓶，吸管，培养皿，试管，培养箱等。

四、实验步骤

1. 水样的采集与处理

⑴ 饮用水：采样前，先用酒精棉球擦拭瓶口灭菌，以灭菌移液管或移液枪取水样。

    ⑵ 河水、湖水、池水：应取距水面10 cm~15 cm的深层水样。先将已灭菌的带玻璃塞的广口瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来使瓶口向上，拔去瓶塞，待水盛满后，将瓶塞盖好，再将瓶子从水中取出。在一定深度采水样时，需要用特制的采水器（图14-14）。采水器是一金属框，内装玻璃瓶，其底部装有重沉坠，可按需要坠入一定深度。瓶盖上系有一绳索，拉吊绳索即可打开瓶盖，待水样瓶中水盛满后，放松绳索，即自行盖上瓶盖。水样采集后，将水样瓶取出，并立即用无菌棉塞或灭菌胶塞塞好瓶口，以备检验。

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食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项

1 菌落总数及测定

菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物,它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度,与培养基混合,在一定培养条件下,每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。

菌落总数就是指食品检样经过处理,在一定条件下(如需氧性质、培养基成分、pH、培养温度和时间等) 1 mL ( g)检样中所含菌落的总数。 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度、食品的新鲜度及卫生质量,它反映食品在生产、加工、销售过程中是否符合卫生要求,以便对被检样品做出适当的卫生学评价。也可以应用这一方法观察食品中细菌的性质以及细菌在食品中繁殖的动态,菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣[ 1 ] 。

2 菌落总数测定中的注意事项

2. 1 所用器皿及稀释液

2. 1. 1 检验中所用玻璃器皿,如培养皿,吸管、试管、移液器的吸头等必须是完全灭菌的,并在灭菌前彻底洗涤干净,不得残留有抑菌物质。

2. 1. 2 用作样品稀释的液体,每批都要有空白对照。如果在琼脂对照平板上出现几个菌落时,要查找原因,如可通过追加对照平板,以判定是空白稀释液,用于倾注平皿的培养基,还是平皿、吸管或空气可能存在的污染。

2. 1. 3 检样的稀释液一般用灭菌盐水,如果对含盐量较高的食品(如酱品等)进行稀释,则宜用蒸

馏水。做醋时用20% ～ 30%碳酸钠调pH 至中性。

2. 2 检样的稀释

2. 2. 1 检样稀释时,应以无菌操作称取(或量取)有代表性的样品25 g (或mL ) , 剪碎放于含有225 mL灭菌稀释液的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠) ,经充分振摇作成1: 10 的稀释液。如系肉、鱼等固体样品,先用自来水把表面冲洗干净,取可食部分(即鱼肉)剪细加入稀释液后,置均质器中以8 000 ～ 10 000 r /min 速度处理1 min,使做成均匀的1: 10稀释液。

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