【摘要】 目的 观察银杏叶提取物金纳多合阿米洛利对大鼠肝纤维化模型的干预作用。方法 以二甲基亚硝胺造成大鼠肝纤维化模型，分别观察金纳多与阿米洛利干预后，羟脯氨酸、透明质酸及层粘连蛋白含量的变化。结果 各给药组（除阿米洛利组外）大鼠肝功能均较模型组有明显改善；阿米洛利和金纳多给药组较模型组的血清透明质酸、层粘连蛋白和肝组织羟脯氨酸含量降低(P<0.05)；肝组织内SOD较模型组升高，而MDA低于模型组(P<0.01)；金阿合用组效果最佳。结论 金纳多(银杏叶提取物)与阿米洛利对二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化模型均有预防作用，两者合用有一定的协同作用。
目前认为，肝纤维化可以预防和逆转。近年来，已有不少学者以干扰肝纤维化形成过程中某一因素来干扰肝纤维化的发展，取得了一定成绩。由于肝脏纤维化的发生发展是一个复杂的过程，有诸多因素参与，因此仅干扰其中某一因素效果并不理想。新近关于肝纤维化形成机制的研究表明氧应激和交换泵在肝纤维化形成中起重要作用[1,2]，为抗肝纤维化的研究提供了新靶点。本实验通过建立二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型，观察联用Na+/H+交换泵抑制剂阿米洛利（Amiloride）与抗氧化剂银杏叶提取物金纳多[3]（Ginaton）联用对大鼠纤维化形成的影响，以探索临床抗肝纤维化的新途径。现将实验方法及结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性SD大鼠，体质量（180±30）g，购于湖南中医学院实验动物中心，合格证号：SCXK（湘2002-003）。
1.1.2 药物 阿米洛利，1 g/瓶，购自Sigma公司；金纳多(银杏叶提取物)，5 g/瓶，由德国威玛舒培大药厂生产；二甲基亚硝胺，100 mL/瓶，购于TCI公司。
1.1.3 仪器 752-紫外分光光度计上海第三分析仪器厂，LD5-2A离心机北京仪器厂，AA-160型电子天平德国Denver公司，SN-862型放射免疫γ计数器上海分析仪器厂。
1.1.4 试剂 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒为南京建成生物制品公司产品；透明质酸（HA）和层粘连蛋白(LN)放免试剂盒购自上海海军生物医学研究所。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与造模 模型建立参照文献[4]。雄性SD大鼠60只，体质量150～210 g，随机分为6组，即正常组、模型组、阿米洛利组、金纳多组、金纳多+阿米洛利组（简称金阿合用组）、马络替酯组，每组10只。其中模型组及给药组每周连续3 d腹腔注射二甲基亚硝胺10 mg/kg,共3周；各给药组造模同时每日分别经胃灌注阿米洛利(1 mg/kg)、金纳多(40 mg/kg)、金阿合用组（与单用组浓度相同），共用药3周；马络替酯组造模同时每日经灌胃马洛替酯[5]（90 mg/kg）；正常对照组每周连续3 d腹腔注射生理盐水，共3周，同时每日灌胃生理盐水共3周。第4周初，摘眼球采血后处死动物，剪下完整肝脏组织标本，称肝质量后取部分中叶肝脏以10%中性甲醛固定，3 d内石蜡包埋，备病理检测；将余下肝脏于液氮中速冻，备肝组织匀浆测组织MDA、SOV、羟脯氨酸、透明质酸及层粘连蛋白，血清于-70 °C冰箱内保存备肝功能检测。
1.2.2 肝功能、脂质过氧化指标检测 MDA、GSH-PX、 SOD HA及LN均按试剂盒说明测定。肝组织羟脯氨酸测定参照李文才等[6]的方法。
1.3 统计学分析
计量资料以均数±标准差(ｘ±ｓ)表示， 用统计软件SPSS10.0进行单因素变量的方差分析和最小差值显著法（LSD）的两两比较。
2 结果
2.1 一般情况
正常对照组大鼠一般状态良好；模型组活动少，皮毛欠光滑，尿色黄，有腹泻。各给药组大鼠精神活跃，毛发光滑，体型丰满，无腹泻。
2.2 肝功能指标检测
如表1所示：与正常组比较，模型组谷丙转胺酶（ALT）和碱性磷酸酶（AlP）的水平明显升高，白蛋白、球蛋白比（A/G）的水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；除了阿米洛利组外，其它给药组ALT和AlP显著低于模型组，而A/G显著高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）；对ALT和A/G的影响金阿合用组优于阿米洛利单用组，差异有统计学意义（P<0.01）；对AlP的影响合用组优于两单用组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
2.3 脂质过氧化指标
由表2可见：与正常组比较，模型组MDA的水平明显升高，而SOD的活力明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，给药组不同程度明显扭转MDA和SOD，差异有统计学意义（P<0.01）；对MDA的影响金阿合用组优于各单用组，差异有统计学意义（P<0.05），对SOD的影响金阿合用组优于金纳多单用组，差异有统计学意义（P<0.05），但不优于阿米洛利单用组。见表2。
2.4 对大鼠肝纤维化程度的影响
由表3可见：与正常组比较，模型组HA、LN和 HYP的含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；各给药组不同程度明显降低HA、LN和HYP的含量，差异有统计学意义（P<0.05）；对HA和LN的影响，金阿合用组优于各单用组，差异有统计学意义（P<0.05）；对HYP的影响，金阿合用组并不优于单用组。见表3。
3 讨论
本实验的研究表明， 阿米洛利与金纳多对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化具有明显的预防作用。肝功能检测提示金纳多可减轻肝细胞的变性和坏死，并改善肝细胞功能，1 mg/kg的阿米洛利无此功效，表现为除了阿米洛利组，其余各组谷丙转氨酶和碱性磷酸酶较模型组显著降低(P<0.001)，白蛋白、球蛋白比显著升高(P<0.001)。胶原纤维主要由胶原蛋白所构成，Hyp为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝脏中的含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度相平行。本研究通过检测肝组织匀浆Hyp的含量发现，金纳多与阿米洛利均可降低Hyp的含量，说明阿米洛利与金纳多均可抑制胶原的生成和沉积。氧化应激及脂质过氧化是引起肝细胞损伤与肝星状细胞活化的重要机制[7]。通过检测肝组织匀浆中SOD、MDA含量发现，各给药组的SOD较模型组显著升高，而MDA显著降低，说明金纳多有直接降低自由基生成，减轻脂质过氧化的作用。而阿米洛利可能是通过抑制肝星状细胞激活、增殖及转型，从而减轻脂质过氧化的作用。对SOD、MDA的影响，合用组优于单用组，说明两者在抗脂质过氧化方面可能有协同效应。肝星状细胞活化为类肌成细胞，大量合成和分泌细胞外基质是肝纤维化形成的中心环节。本研究通过检测HA和LN的水平发现，金纳多与阿米洛利均可降低HA和LN的水平，尤以合用组最低，说明金纳多与阿米洛利可以抑制肝星状细胞活化，抑制细胞外基质的合成和分泌。总之，金纳多保护肝细胞及抑制肝星状细活化的作用与阿米洛利抑制肝星状细胞活化的作用可能正是它们合用效果更佳的原因。
目前认为，肝纤维化可以预防和逆转。近年来，已有不少学者以干扰肝纤维化形成过程中某一因素来干扰肝纤维化的发展，取得了一定成绩。由于肝脏纤维化的发生发展是一个复杂的过程，有诸多因素参与，因此仅干扰其中某一因素效果并不理想。新近关于肝纤维化形成机制的研究表明氧应激和交换泵在肝纤维化形成中起重要作用[1,2]，为抗肝纤维化的研究提供了新靶点。本实验通过建立二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化模型，观察联用Na+/H+交换泵抑制剂阿米洛利（Amiloride）与抗氧化剂银杏叶提取物金纳多[3]（Ginaton）联用对大鼠纤维化形成的影响，以探索临床抗肝纤维化的新途径。现将实验方法及结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 雄性SD大鼠，体质量（180±30）g，购于湖南中医学院实验动物中心，合格证号：SCXK（湘2002-003）。
1.1.2 药物 阿米洛利，1 g/瓶，购自Sigma公司；金纳多(银杏叶提取物)，5 g/瓶，由德国威玛舒培大药厂生产；二甲基亚硝胺，100 mL/瓶，购于TCI公司。
1.1.3 仪器 752-紫外分光光度计上海第三分析仪器厂，LD5-2A离心机北京仪器厂，AA-160型电子天平德国Denver公司，SN-862型放射免疫γ计数器上海分析仪器厂。
1.1.4 试剂 超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)试剂盒为南京建成生物制品公司产品；透明质酸（HA）和层粘连蛋白(LN)放免试剂盒购自上海海军生物医学研究所。
1.2 方法
1.2.1 动物分组与造模 模型建立参照文献[4]。雄性SD大鼠60只，体质量150～210 g，随机分为6组，即正常组、模型组、阿米洛利组、金纳多组、金纳多+阿米洛利组（简称金阿合用组）、马络替酯组，每组10只。其中模型组及给药组每周连续3 d腹腔注射二甲基亚硝胺10 mg/kg,共3周；各给药组造模同时每日分别经胃灌注阿米洛利(1 mg/kg)、金纳多(40 mg/kg)、金阿合用组（与单用组浓度相同），共用药3周；马络替酯组造模同时每日经灌胃马洛替酯[5]（90 mg/kg）；正常对照组每周连续3 d腹腔注射生理盐水，共3周，同时每日灌胃生理盐水共3周。第4周初，摘眼球采血后处死动物，剪下完整肝脏组织标本，称肝质量后取部分中叶肝脏以10%中性甲醛固定，3 d内石蜡包埋，备病理检测；将余下肝脏于液氮中速冻，备肝组织匀浆测组织MDA、SOV、羟脯氨酸、透明质酸及层粘连蛋白，血清于-70 °C冰箱内保存备肝功能检测。
1.2.2 肝功能、脂质过氧化指标检测 MDA、GSH-PX、 SOD HA及LN均按试剂盒说明测定。肝组织羟脯氨酸测定参照李文才等[6]的方法。
1.3 统计学分析
计量资料以均数±标准差(ｘ±ｓ)表示， 用统计软件SPSS10.0进行单因素变量的方差分析和最小差值显著法（LSD）的两两比较。
2 结果
2.1 一般情况
正常对照组大鼠一般状态良好；模型组活动少，皮毛欠光滑，尿色黄，有腹泻。各给药组大鼠精神活跃，毛发光滑，体型丰满，无腹泻。
2.2 肝功能指标检测
如表1所示：与正常组比较，模型组谷丙转胺酶（ALT）和碱性磷酸酶（AlP）的水平明显升高，白蛋白、球蛋白比（A/G）的水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；除了阿米洛利组外，其它给药组ALT和AlP显著低于模型组，而A/G显著高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）；对ALT和A/G的影响金阿合用组优于阿米洛利单用组，差异有统计学意义（P<0.01）；对AlP的影响合用组优于两单用组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
2.3 脂质过氧化指标
由表2可见：与正常组比较，模型组MDA的水平明显升高，而SOD的活力明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，给药组不同程度明显扭转MDA和SOD，差异有统计学意义（P<0.01）；对MDA的影响金阿合用组优于各单用组，差异有统计学意义（P<0.05），对SOD的影响金阿合用组优于金纳多单用组，差异有统计学意义（P<0.05），但不优于阿米洛利单用组。见表2。
2.4 对大鼠肝纤维化程度的影响
由表3可见：与正常组比较，模型组HA、LN和 HYP的含量明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；各给药组不同程度明显降低HA、LN和HYP的含量，差异有统计学意义（P<0.05）；对HA和LN的影响，金阿合用组优于各单用组，差异有统计学意义（P<0.05）；对HYP的影响，金阿合用组并不优于单用组。见表3。
3 讨论
本实验的研究表明， 阿米洛利与金纳多对二甲基亚硝胺诱导的肝纤维化具有明显的预防作用。肝功能检测提示金纳多可减轻肝细胞的变性和坏死，并改善肝细胞功能，1 mg/kg的阿米洛利无此功效，表现为除了阿米洛利组，其余各组谷丙转氨酶和碱性磷酸酶较模型组显著降低(P<0.001)，白蛋白、球蛋白比显著升高(P<0.001)。胶原纤维主要由胶原蛋白所构成，Hyp为胶原蛋白所特有的氨基酸成分，其在肝脏中的含量可反映胶原代谢的变化情况，与肝纤维化程度相平行。本研究通过检测肝组织匀浆Hyp的含量发现，金纳多与阿米洛利均可降低Hyp的含量，说明阿米洛利与金纳多均可抑制胶原的生成和沉积。氧化应激及脂质过氧化是引起肝细胞损伤与肝星状细胞活化的重要机制[7]。通过检测肝组织匀浆中SOD、MDA含量发现，各给药组的SOD较模型组显著升高，而MDA显著降低，说明金纳多有直接降低自由基生成，减轻脂质过氧化的作用。而阿米洛利可能是通过抑制肝星状细胞激活、增殖及转型，从而减轻脂质过氧化的作用。对SOD、MDA的影响，合用组优于单用组，说明两者在抗脂质过氧化方面可能有协同效应。肝星状细胞活化为类肌成细胞，大量合成和分泌细胞外基质是肝纤维化形成的中心环节。本研究通过检测HA和LN的水平发现，金纳多与阿米洛利均可降低HA和LN的水平，尤以合用组最低，说明金纳多与阿米洛利可以抑制肝星状细胞活化，抑制细胞外基质的合成和分泌。总之，金纳多保护肝细胞及抑制肝星状细活化的作用与阿米洛利抑制肝星状细胞活化的作用可能正是它们合用效果更佳的原因。
第二篇：大鼠肝动脉插管并体外留置模型的改进论文
目的 对体外留置肝靶向性给药途径的大鼠动脉插管模型进行改进，并探讨建立此模型的技术要点。方法 在10倍手术显微镜下，采用特制内径0.5 mm导管（由硬膜外麻醉导管加工而成）经胃十二指肠动脉剪口处插入肝动脉血管内，逆行到达肝固有动脉开口处后留置导管并固定。结果 20只大鼠造模，成功者17只，成功率为85%。结论 改进型大鼠肝动脉插管并体外留置模型较以往造模方法简单，并提高了模型成功率，技术易于推广，可应用于抗肝肿瘤、肝衰竭等靶向性给药的研究。
〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To improve the model of hepatic artery(HA) catheter and detain the catheter in vitro in rats, and approach the skill keys and value of establishing the model. Method Under the operation microscope(10×), a self-made catheter with 0.5mm ID, developed by peridural anesthetic catheter, was intubated into hepatic artery, through gastroduodenal artery, then the catheter was retained and fixed in rats. Result 20 rats were used to establish the model， in which 17 rats model were successful, the ratio was 85%. Conclusion The improved model is much easily established and achievement ratio is higher than others, which may be used to study on targeting administration in curing liver tumor or hepatic failure.
〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 Model; rats; HA catheterization; detaining in vitro; improvement
肝固有动脉插管的动物模型建立早有报道，但原有的方法易造成肝脏损伤、死亡率高，技术难以掌握。在实验研究中我们改进造模方法，掌握了技术要点，取得较为满意的效果，现将实验方法报道如下。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 动物 健康SD大鼠20只，清洁级，体质量（300±50）g，雌雄各半。由湖南农业大学动物实验中心提供，合格证号sck(湘）2003-0003。
1．1．2 手术器械 止血钳4把，有齿镊、持针器各1把，12.5 cm显微镊1把，14 cm显微剪1把，系线镊2把，小动脉夹数枚，缝合针数枚，0号、4号缝合丝线各数支，自制内径0.5 mm动脉插管数根（由硬膜外麻醉导管加工而成）。
1．1．3 仪器 Z20P5 10倍手术显微镜：苏州六六视觉科技股份有限公司；ES-1100型电子天平：长沙湘平科技发展有限公司。
1．1．4 药品 戊巴比妥钠：国药集团化学试剂有限公司，批号：F20041117，25 g/瓶，肝素钠注射液：江苏万帮生化医药股份有限公司，12 500 u/（mL·支），青霉素钠注射液：山西太行药业股份有限公司，80万u/支。
1．2 方法
拟参考Lindell肝动脉插管法[1]及赖力英等人的方法[2]进行改进，具体步骤如下。
1．2．1 术前准备 术前1天停止喂食，自由饮水；将硬膜外麻醉导管置于60 ℃恒温水浴箱中，预热拉长为内径约0.5 mm的导管，插口处剪成锲形，管内插入0.5 mm动脉介入导管的金属导丝；于手术前30 min经大鼠尾静脉注射50 u/mL肝素钠溶液2 mL进行手术前血液肝素钠化；以2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉。
1．2．2 造模方法 剑突以下的腹部剃毛后，络合碘消毒皮肤，手术按常规无菌手术规程操作。在腹部正中用手术刀切开皮肤切口2.5～3.0 cm，用无齿镊提起腹肌沿腹白线剪开腹肌，用止血钳钳夹切口两侧的腹肌，暴露肝脏；于胃与肝交界处用棉签钝性分离肝脏乳头叶，在其下方肝门区找到肝门静脉、肝固有动脉和胆管三者并行的Glisson系统，以最底下管径较粗的肝门静脉定位，中间外径较圆且有搏动的管道为肝固有动脉，下行分出胃十二指肠动脉及胃右动脉，右行为肝总动脉。去除血管外壁的结缔与脂肪组织，将各血管分离； 胃十二指肠动脉与胃右动脉交界处用0号丝线结扎血管，近心端用丝线套起备用，小动脉夹夹闭肝总动脉，在血管己经结扎处前方剪开血管壁约1/3~1/2（见图1），剪口前短暂松小动脉1次使胃右动脉血管充盈；将特制导管经胃、十二指肠动脉剪口入动脉血管，逆行到达肝固有动脉开口处，将导管内金属导丝退出，确认管腔通畅后，近心端用已经套起的丝线结扎并固定，松开动脉夹； 从腹壁引出导管并固定，连续缝合腹壁肌层。皮肤切口以75%乙醇消毒后用丝线缝合，引出的导管潜行于皮下至颈背部引出，用50 u/mL肝素钠生理盐水溶液封管，导管末端在乙醇灯下烧灼封口；术后大鼠臀部肌肉注射青霉素钠20 000 u/100 g，1次/3~5 d，防感染；隔天用生理盐水通管，并用50 u/mL肝素钠生理盐水溶液封管；每只大鼠单笼饲养。
2 结果
术中2只大鼠由于胃、十二指肠动脉剪口处血管断裂无法插管；术后20 h 1只因伤口渗血、便血而死亡；其余17只全部存活，成功率达85%，且术中出血量少，肝叶没有出现明显的损伤。术后0.5~1 h完全清醒，术后8 h可以行走，12 h饮食、活动逐渐恢复正常，伤口4 d完全愈合。术后留置管能顺利导入药物入肝，并能长期维持此功能（见图2）。
3 讨论
3．1 大鼠肝动脉插管并体外留置模型研制的目的与意义
目前在以肝脏为靶脏器的药效研究仍不理想，除了药物本身的药理作用原因外，肝靶向性差可能是重要的原因之一[3]。药物必须在其作用部位达到足够的浓度方能产生其特征性效应[4]。药物经周围静脉进入血液循环后，经过药代动力学的改变，到达肝脏的浓度已相当低，从而影响了临床疗效。而大剂量药物使用又可能造成对其他脏器的严重毒副作用，或医疗成本的提高。经由导管置入肝固有动脉的开口，药物可以不经体循环，顺血流直接作用于肝脏，肝靶向性强。这项技术能有效的提高药效、减低用药剂量、降低治疗成本以及减少药物的毒副作用。如，肝癌血供的90％以上来自肝动脉，经肝动脉给药可有效提高肿瘤局部的药物浓度，从而提高药效，减少抗肝肿瘤药物对其它脏器的毒副作用。所以肝动脉插管并体外留置大鼠模型在抗肝肿瘤、肝衰竭等研究药物对肝脏作用是有重要意义。
3．2 大鼠肝动脉插管并体外留置模型研制的现状
在药物对肝脏靶脏器作用的研究中，Lindell肝动脉插管法常用于一次性的给药实验，在打开动物腹腔导入药后又重新关闭，不能多次性的重复给药。而在科研实验中，往往需要多次乃至长期给药，这就需要肝动脉导管长期体外留置备用，而目前这方面的模型建立报道较少。参照现有的相关文献进行模型构建，发现有不少不足之处：①肝固有动脉和胃、十二指肠动脉难以定位，寻找时，极容易造成肝包膜下瘀血及肝叶损伤；②导管插入成功后，回流的血液极易在狭窄的管道内凝固而阻塞管道；③手术意外、动物死亡常见，失败率高。
3．3 大鼠肝动脉插管并体外留置模型的改进及体会
在成功建立大鼠肝动脉插管并体外留置模型之后，总结经验认为此技术改进的关键有以下几点。
①大鼠的选择 鼠龄太小或体质量太轻，其胃、十二指肠动脉管径相应会过小而致导管无法插入；鼠龄太大，血管与脂肪组织粘连过多难以分离，且血管老化失去弹性极易断裂；选择鼠龄在16~30周，体质量在250~350 g的大鼠，实验效果比较理想；②手术前血液肝素钠化可以避免在导管插入成功后，回流的血液凝固阻塞管道，同时也可以起到充盈靶血管的作用，但要注意避免肝素用量过大而致伤口渗血、不愈合；③麻醉剂及量的选择 在参阅文献及预实验效果比较后最终选择了戊巴比妥钠，它具有起效快、可控性强、副作用小等优点[5]；鉴于实验大鼠个体差异性，以2%戊巴比妥钠45 mg/kg标准，先推总量的2/3，以全身软瘫、角膜反射消失为进行麻醉完成的基准，若不足余下的以0.1 mL/次试推直至完成；④血管分离 Glisson系统中肝门静脉、肝固有动脉和胆管三者被共同的血管周围纤维囊所包裹，故术中血管分离操作须十分小心，尽量祛除血管外壁的结缔与脂肪组织将各血管分离，以便于血管结扎、剪切口；因为大鼠肝叶较脆，血运丰富，所以动作要轻柔，尽量避免机械损伤；动脉夹夹闭肝总动脉时间不宜过长，尽量将肝脏缺血再灌注损伤降低至最低程度；⑤导管留置 导管插入后松开动脉夹，可见管内血液回流，为导管插入成功的标志；导管潜行于皮下是其长期留置体外的关键，由于大鼠活泼好动，喜欢撕咬，一般手术置管后导管容易被撕裂、咬断，故注意严防感染，加强局布消毒，并防止凝血堵管，定期使用肝素钠通管。
〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To improve the model of hepatic artery(HA) catheter and detain the catheter in vitro in rats, and approach the skill keys and value of establishing the model. Method Under the operation microscope(10×), a self-made catheter with 0.5mm ID, developed by peridural anesthetic catheter, was intubated into hepatic artery, through gastroduodenal artery, then the catheter was retained and fixed in rats. Result 20 rats were used to establish the model， in which 17 rats model were successful, the ratio was 85%. Conclusion The improved model is much easily established and achievement ratio is higher than others, which may be used to study on targeting administration in curing liver tumor or hepatic failure.
〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 Model; rats; HA catheterization; detaining in vitro; improvement
肝固有动脉插管的动物模型建立早有报道，但原有的方法易造成肝脏损伤、死亡率高，技术难以掌握。在实验研究中我们改进造模方法，掌握了技术要点，取得较为满意的效果，现将实验方法报道如下。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 动物 健康SD大鼠20只，清洁级，体质量（300±50）g，雌雄各半。由湖南农业大学动物实验中心提供，合格证号sck(湘）2003-0003。
1．1．2 手术器械 止血钳4把，有齿镊、持针器各1把，12.5 cm显微镊1把，14 cm显微剪1把，系线镊2把，小动脉夹数枚，缝合针数枚，0号、4号缝合丝线各数支，自制内径0.5 mm动脉插管数根（由硬膜外麻醉导管加工而成）。
1．1．3 仪器 Z20P5 10倍手术显微镜：苏州六六视觉科技股份有限公司；ES-1100型电子天平：长沙湘平科技发展有限公司。
1．1．4 药品 戊巴比妥钠：国药集团化学试剂有限公司，批号：F20041117，25 g/瓶，肝素钠注射液：江苏万帮生化医药股份有限公司，12 500 u/（mL·支），青霉素钠注射液：山西太行药业股份有限公司，80万u/支。
1．2 方法
拟参考Lindell肝动脉插管法[1]及赖力英等人的方法[2]进行改进，具体步骤如下。
1．2．1 术前准备 术前1天停止喂食，自由饮水；将硬膜外麻醉导管置于60 ℃恒温水浴箱中，预热拉长为内径约0.5 mm的导管，插口处剪成锲形，管内插入0.5 mm动脉介入导管的金属导丝；于手术前30 min经大鼠尾静脉注射50 u/mL肝素钠溶液2 mL进行手术前血液肝素钠化；以2%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔注射麻醉。
1．2．2 造模方法 剑突以下的腹部剃毛后，络合碘消毒皮肤，手术按常规无菌手术规程操作。在腹部正中用手术刀切开皮肤切口2.5～3.0 cm，用无齿镊提起腹肌沿腹白线剪开腹肌，用止血钳钳夹切口两侧的腹肌，暴露肝脏；于胃与肝交界处用棉签钝性分离肝脏乳头叶，在其下方肝门区找到肝门静脉、肝固有动脉和胆管三者并行的Glisson系统，以最底下管径较粗的肝门静脉定位，中间外径较圆且有搏动的管道为肝固有动脉，下行分出胃十二指肠动脉及胃右动脉，右行为肝总动脉。去除血管外壁的结缔与脂肪组织，将各血管分离； 胃十二指肠动脉与胃右动脉交界处用0号丝线结扎血管，近心端用丝线套起备用，小动脉夹夹闭肝总动脉，在血管己经结扎处前方剪开血管壁约1/3~1/2（见图1），剪口前短暂松小动脉1次使胃右动脉血管充盈；将特制导管经胃、十二指肠动脉剪口入动脉血管，逆行到达肝固有动脉开口处，将导管内金属导丝退出，确认管腔通畅后，近心端用已经套起的丝线结扎并固定，松开动脉夹； 从腹壁引出导管并固定，连续缝合腹壁肌层。皮肤切口以75%乙醇消毒后用丝线缝合，引出的导管潜行于皮下至颈背部引出，用50 u/mL肝素钠生理盐水溶液封管，导管末端在乙醇灯下烧灼封口；术后大鼠臀部肌肉注射青霉素钠20 000 u/100 g，1次/3~5 d，防感染；隔天用生理盐水通管，并用50 u/mL肝素钠生理盐水溶液封管；每只大鼠单笼饲养。
2 结果
术中2只大鼠由于胃、十二指肠动脉剪口处血管断裂无法插管；术后20 h 1只因伤口渗血、便血而死亡；其余17只全部存活，成功率达85%，且术中出血量少，肝叶没有出现明显的损伤。术后0.5~1 h完全清醒，术后8 h可以行走，12 h饮食、活动逐渐恢复正常，伤口4 d完全愈合。术后留置管能顺利导入药物入肝，并能长期维持此功能（见图2）。
3 讨论
3．1 大鼠肝动脉插管并体外留置模型研制的目的与意义
目前在以肝脏为靶脏器的药效研究仍不理想，除了药物本身的药理作用原因外，肝靶向性差可能是重要的原因之一[3]。药物必须在其作用部位达到足够的浓度方能产生其特征性效应[4]。药物经周围静脉进入血液循环后，经过药代动力学的改变，到达肝脏的浓度已相当低，从而影响了临床疗效。而大剂量药物使用又可能造成对其他脏器的严重毒副作用，或医疗成本的提高。经由导管置入肝固有动脉的开口，药物可以不经体循环，顺血流直接作用于肝脏，肝靶向性强。这项技术能有效的提高药效、减低用药剂量、降低治疗成本以及减少药物的毒副作用。如，肝癌血供的90％以上来自肝动脉，经肝动脉给药可有效提高肿瘤局部的药物浓度，从而提高药效，减少抗肝肿瘤药物对其它脏器的毒副作用。所以肝动脉插管并体外留置大鼠模型在抗肝肿瘤、肝衰竭等研究药物对肝脏作用是有重要意义。
3．2 大鼠肝动脉插管并体外留置模型研制的现状
在药物对肝脏靶脏器作用的研究中，Lindell肝动脉插管法常用于一次性的给药实验，在打开动物腹腔导入药后又重新关闭，不能多次性的重复给药。而在科研实验中，往往需要多次乃至长期给药，这就需要肝动脉导管长期体外留置备用，而目前这方面的模型建立报道较少。参照现有的相关文献进行模型构建，发现有不少不足之处：①肝固有动脉和胃、十二指肠动脉难以定位，寻找时，极容易造成肝包膜下瘀血及肝叶损伤；②导管插入成功后，回流的血液极易在狭窄的管道内凝固而阻塞管道；③手术意外、动物死亡常见，失败率高。
3．3 大鼠肝动脉插管并体外留置模型的改进及体会
在成功建立大鼠肝动脉插管并体外留置模型之后，总结经验认为此技术改进的关键有以下几点。
①大鼠的选择 鼠龄太小或体质量太轻，其胃、十二指肠动脉管径相应会过小而致导管无法插入；鼠龄太大，血管与脂肪组织粘连过多难以分离，且血管老化失去弹性极易断裂；选择鼠龄在16~30周，体质量在250~350 g的大鼠，实验效果比较理想；②手术前血液肝素钠化可以避免在导管插入成功后，回流的血液凝固阻塞管道，同时也可以起到充盈靶血管的作用，但要注意避免肝素用量过大而致伤口渗血、不愈合；③麻醉剂及量的选择 在参阅文献及预实验效果比较后最终选择了戊巴比妥钠，它具有起效快、可控性强、副作用小等优点[5]；鉴于实验大鼠个体差异性，以2%戊巴比妥钠45 mg/kg标准，先推总量的2/3，以全身软瘫、角膜反射消失为进行麻醉完成的基准，若不足余下的以0.1 mL/次试推直至完成；④血管分离 Glisson系统中肝门静脉、肝固有动脉和胆管三者被共同的血管周围纤维囊所包裹，故术中血管分离操作须十分小心，尽量祛除血管外壁的结缔与脂肪组织将各血管分离，以便于血管结扎、剪切口；因为大鼠肝叶较脆，血运丰富，所以动作要轻柔，尽量避免机械损伤；动脉夹夹闭肝总动脉时间不宜过长，尽量将肝脏缺血再灌注损伤降低至最低程度；⑤导管留置 导管插入后松开动脉夹，可见管内血液回流，为导管插入成功的标志；导管潜行于皮下是其长期留置体外的关键，由于大鼠活泼好动，喜欢撕咬，一般手术置管后导管容易被撕裂、咬断，故注意严防感染，加强局布消毒，并防止凝血堵管，定期使用肝素钠通管。