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       【摘要】 观察叶下珠复方Ⅱ号对小鼠实验性肝损伤的保护作用。【方法】将NIH小鼠随机分成正常对照组，模型组，叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组(剂量分别为110、55、27.5g·kg-1)，联苯双酯组(150mg·kg-1);以刀豆蛋白A(Con A)和D?氨基半乳糖(D?GalN)分别复制小鼠急性肝损伤模型，用叶下珠复方II号水提液进行干预治疗，并与联苯双酯进行对照，检测小鼠血清谷丙转氨酶( ALT)、谷草转氨酶(AST)及肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性，并观察肝组织病理改变。【结果】叶下珠复方Ⅱ号可显著性降低两种实验性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性，升高肝损伤小鼠肝组织SOD活性，与模型组比较差异有显著性意义(P<0.01)，与联苯双酯组比较差异无显著性意义(P>0.05)，且可明显减轻肝组织病理改变。 【结论】 叶下珠复方Ⅱ号对刀豆蛋白A和D?氨基半乳糖所致小鼠实验性肝损伤具有较好的保护作用，作用机制与抑制脂质过氧化损伤有关。

　　【关键词】 叶下珠复方Ⅱ号/药理学 肝损伤/中药疗法 肝/病理学 疾病模型 动物 小鼠

　　叶下珠复方Ⅱ号是在叶下珠复方[1]的基础上加入桃仁、苦参等药物组方而成，具有解毒活血、疏肝健脾作用，临床上主要用于慢性乙型肝炎和肝纤维化的治疗。为探讨该复方对实验性肝损伤保护作用的效果，我们以NIH小鼠为实验对象，观察该方对刀豆蛋白A(Con A)所致免疫性肝损伤模型和D?氨基半乳糖(D?GalN)所致化学性肝损伤模型的作用，现报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物 NIH小鼠，雌雄各半，体质量18～22g，由广州中医药大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK(粤)2003-0001。

　　1.2 药物 叶下珠复方Ⅱ号组方药材购于广州中医药大学第一附属医院，水煎2次，混合后浓缩成含生药4kg/L，用时以蒸馏水配成所需浓度;联苯双酯滴丸由北京协和制药厂生产，批号04060106，每丸含联苯双酯7.5mg，试验时以30g/L的二甲基亚砜溶解，再用蒸馏水稀释至所需浓度;刀豆蛋白A(Con A)为美国华盛顿生物药品公司产品;D?氨基半乳糖(D?GalN)由重庆医科大学生化教研室生产，批号050326。

　　1.3 主要试剂与仪器 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)检测试剂盒均由上海荣盛生物技术有限公司提供，批号为20050125;超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，批号20041108;722型分光光度计(上海第三分析仪器厂);TLL?C台式冷冻离心机(北京四环科学仪器厂); CK40?F200型显微镜(Olympus Optical Co.Ltd)。

　　1.4 ConA致小鼠急性肝损伤模型复制及分组、给药方法[2] 将60只NIH小鼠随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组，模型组，叶下珠复方Ⅱ号高、中、低剂量组(简称中药高、中、低剂量组，剂量分别为110、55、27.5g·kg-1，相当于20倍、10倍和5倍临床用药剂量)，联苯双酯(150mg·kg-1)治疗组。除正常对照组外，其他各组小鼠于实验首日上午尾静脉注射ConA20mg·kg-1，各给药组于首日、次日和第3日上午予小鼠灌胃给药1次;末次给药后4h，模型组和各给药组小鼠再次尾静脉注射ConA20mg·kg-1，禁食不禁水，8h后摘眼球取血，分离血清待检;断头处死动物，取肝左叶组织，一部分用体积分数为40%甲醛溶液固定，另一部分制成匀浆待检。

　　1.5 D?GalN致小鼠急性肝损伤模型的复制及分组、给药方法[3] 分组和剂量设计同1.4，各治疗组小鼠每日灌胃给药1次，连续4d。末次给药后1h，除正常对照组外，其他组小鼠均以D?GalN 800mg·kg-1腹腔注射，禁食不禁水，24h后摘眼球取血，分离血清待检;断头处死动物，取肝左叶组织，一部分用体积分数为40%甲醛溶液固定，另一部分制成匀浆待检。

　　1.6 血浆ALT、AST活性检测 采用赖氏法，按试剂盒说明操作，采用722型紫外分光光度计于波长505nm处检测吸光值,制定标准曲线,换算成ALT、AST值。

　　1.7 肝组织SOD活性测定 将肝组织制成100g/L匀浆，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，按试剂盒说明操作。

　　1.8 组织病理学观察 以体积分数为40%甲醛溶液固定肝组织, 石蜡包埋切片，常规苏木素-伊红(HE)染色,光镜下观察、拍照。

　　1.9 统计学方法 采用SPSS10.0软件包进行统计分析,多组计量资料分析采用One?way ANOVA法,多重比较采用LSD法。

　　2 结果

　　2.1 叶下珠复方Ⅱ号对Con A致小鼠急性肝损伤模型的保护作用 由表1可知，模型组小鼠血清ALT、AST活性较正常对照组升高，肝组织SOD活性较正常对照组降低，差异均有显著性意义(P<0.01)。中药高、中、低剂量组ALT、AST活性均低于模型组，差异有显著性意义(P<0.01)，而与联苯双酯组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。中药高、中、低剂量组肝组织中SOD的活性高于模型组，差异有显著性意义(P <0.01)， 但与联苯双酯组比较，差异无显著性意义(P>0.05)。

　　肝组织病理学观察：光镜下见正常对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝窦未见异常。模型组全部小鼠肝组织均出现明显病变，小叶内大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见凋亡小体、明显的点状坏死和灶性坏死，坏死灶可见大量炎性细胞浸润;汇管区淋巴细胞和单核细胞炎性浸润尤为明显,肝窦内可见红细胞淤积。叶下珠复方Ⅱ号高、中剂量组和联苯双酯组部分肝组织可见散在点状坏死和灶性坏死，肝细胞损伤程度明显减轻，炎性细胞浸润显著减少(图1)。

　　2.2 叶下珠复方Ⅱ号对D?GalN致小鼠急性肝损伤模型的保护作用 由表2可知，模型组小鼠血清ALT、AST活性较正常对照组升高，肝组织SOD活性较正常组降低，差异均有显著性意义(P<0.01)。除中药低剂量组血清ALT外，中药各组血清ALT、AST活性降低，肝组织SOD活性升高，与模型组比较有显著性差异(均P <0.01)，与联苯双酯组比较差异无显著性意义(P>0.05)。

　　肝脏组织病理学观察：光镜下见正常对照组肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，肝小叶结构完整，无病理性改变。模型组全部小鼠肝组织均出现病变，大多数肝细胞肿胀，细胞质疏松化，有的呈气球样变，可见广泛的肝细胞脂肪变性、点状坏死和灶性坏死，并出现炎性细胞浸润。叶下珠复方Ⅱ号高、中剂量组和联苯双酯组肝细胞变性、坏死程度显著减轻，炎性细胞浸润减少,肝组织病变明显改善(图2)。表1 叶下珠复方Ⅱ号对Con A致肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝组织SOD活性的影响表2 叶下珠复方Ⅱ号对D?GalN所致肝损伤小鼠血清ALT、AST及肝组织SOD活性的影响

　　毕业论文是每个毕业生都要经过的一道门槛，下面就让我们学习下怎么写毕业论文?

　　【摘要】目的：研究心脉龙注射液对家兔低血容量性休克致缺血再灌注的保护作用及其机制。方法：实验动物16只随机分两组，制备缺血再灌注(ischemiareperfusion，I-R)模型，心脉龙(XML)组8只，缺血30min，在灌注时从静脉快速输入自体血和20mL生理盐水(心脉龙注射液加入其中，1.5ml/kg)(I-R+SM);对照组8只，缺血30min，静脉输入自体血和等量生理盐水(I-R+SM)。各组动物除回输血液外，外加100 mL液体补充丢失的水分。观察缺血前(BT)，I-R后30min，1h，2h血中超氧化物岐化酶(SOD)活力，NO-2/NO-3含量，血液pH值和尿量变化，结果：XML组血浆NO-2/NO-3含量高于对照组，I-R2h，对照组(4.08±1.95)цmol/L，XML组(7.56±1.21)цmol/L(P<0.01);SOD活力也高于对照组;XML组(70.05±9.87)Nu/mL;对照组(43.17±10.93)Nu/mL(P<0.01)。随着SOD活力，NO-2/NO-3水平升高，酸中毒有所纠正，pH值逐渐上升，循环血流状态改善，尿量增加。结论：心脉龙注射液对低血容量性休克致缺血再灌注兔有一定保护作用，其机制与增加SOD活力，促进NO产生有关。

　　【关键词】心脉龙;再灌注损伤;兔;超氧化物岐化酶;一氧化氮

　　缺血后再灌注，不仅不能使组织、器官的功能恢复，反而加重技能机构的损害，目前研究认为其发生与体内超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)活力，一氧化氮(nitric oxide,NO)水平变化有关[1，2]。心脉龙注射液(Xinmailong injecrion,XML)是我院药学院发明的国家二类新药(中药)，其在临床上主要用于改善缺血导致的微循环障碍，对缺血再灌注方面的影响，目前研究尚少，本研究旨在探讨心脉龙注射液对低血容量休克缺血再灌注兔的保护作用及其机制。

　　1　材料和方法

　　1.1　动物模型健康家兔16只，雌雄不限，体重1.8～2.5kg，本院动物室提供。3%戍巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉注射麻醉，分离一侧颈总动脉，肝素化后(800цg/kg)颈总动脉插管连接三通和血压测定装置(PC-lab多道生物信号分析系统)。

　　分离双侧输尿管并插管，计数每分钟尿量。经三通管放血使血压在10min内由正常的16.2kpa降至5.3kpa，维持30min，失血量占总血量的50%。经颈外静脉快速回输自体血液的20mL生理盐水，外加100mL液体补充手术丢失的水分(1h内输完)。

　　1.2　分组和标本采集

　　输入自体血和等量盐水(I-R+NS)。分别于失血前(beforeischemia，BI)，I-R后30min、1h、2h、颈外静脉取血测定血浆SOD活力、NO代谢产物亚硝酸盐/硝酸盐(NO-2/NO3-)含量、血液pH值，并计数相应时段每分钟尿量(mL/min)。

　　1.3　检测方法

　　SOD活力测定用黄嘌呤氧化酶法，试剂盒购自南京建程生物工程研究所。NO含量测定用比色法：待测血浆经沉淀蛋白质后，同Griess试剂进行重氮偶氮反应，其产物在548nm处有最大吸收峰，用亚硝酸盐做标准，721B型分光光度计测定NO-2/NO3-含量，间接反应NO水平。

　　1.4　统计处理

　　数据均以±s表示，组内=组间比较采用t检验判断差异显著性。

　　2　结果

　　2.1　I—R时血浆NO-2/NO-3含量变化及SM对其影响I—R引起血浆NO-2/NO-3含量明显下降，对照组I—R2h，亦有BI的(12.91±1.04)цmol/L降至(4.08±1.95)цmol/L，为BI的1/3(P<0.001)。SM组I—R各时点均较对照组有所回升，2h显著高于对照组(p<0.01)，但仍低于BI水平(p<0.01)。

　　2.2　I—R时血浆SOD活力变化及SM对其影响

　　将兔随机分两组，XML组：缺血30min，再灌注时颈外静脉快速输入自体血和20mL生理盐水(XML加入生理盐水中，1.5ML/kg)(I-R+SM)。对照组：缺血30min，再灌时由表1可见，I—R后30min、1h、2h均较BI明显下降(p<0.01，P<0.001)。SM注射液可有效防止SOD活力下降，I—(上接第22页)R后1h已有所增加，2h明显高于对照组(p<0.01)表1。

　　2.3　I—R时血浆pH值变化及XML对其影响由表2可见，I—R克引起血液pH下降，对照组I—R2h已由BI7.34±0.02降至7.18±0.09(p<0.01)。SM可防止pH值已开增高，2hpH值显著高于对照组(p<0.01)。

　　2.4　尿量变化(mL/min)

　　缺血前，对照组0.15±0.03;XML组0.13±0.04，两组比较无明显差异(p>0.05).I-R30min,两组均无尿，XML组委0.05±0.03，两组比较有显著差异(p<0.01);I-R2h，对照组仍无尿，XML组0.08±0.02，两组比较有非常显著差异(p<0.001)。

　　3　讨论

　　实验结果提示，免缺血再灌注后血浆NO-2/NO-3含量和SOD活力均逐渐下降;SM能够阻止NO-2/NO-3水平下降;增加pH值，改善循环血液状态，使尿量增加。

　　有研究证明

　　[1，2]缺血再灌注时由于大量自由基产生，使SOD消耗增多，活力下降，同时使血管内皮细胞受损伤，NO合成释放减少，灭活加快，加之缺血氧致酸中毒，NO浓度进一步下降。NO为血管内皮细胞释放的内皮细胞衍生舒张因子，正常情况下不断产生进入血管平滑肌细胞激活鸟苷酸环化酶，使细胞内游离Ca2+水平降低，平滑肌松弛，血管舒张[3]。病理情况下，NO合成释放减少，灭活增加，血中NO浓度降低，输血管作用减弱，缩血管作用增加，使血管壁增厚，管腔狭窄，血流减少，加之血小板聚集，粘附并释放大量活性物质，导致微循环障碍，内脏血流减少，出现少尿或无尿。故缺血再灌注后血浆NO含量和SOD活力下降，互为因果，造成恶性循环。

　　心脉龙注射液是我院药物研究所研制的国家二类新药，有研究报道心脉龙注射液能抑制缺氧/缺糖诱导的神经细胞凋亡及钙超载，有神经细胞保护作用[4\\5]，同时有对抗氧自由基、减少脑出血时神经细胞凋亡的作用和对缺血再灌注心肌有保护作用[3、4]。因此，心脉龙注射液通过增加血浆SOD活力，增强机体抗氧化能力。NO含量增加可以抑制纤维蛋白原与血小板结合，防止血小板粘附损伤的内皮或沉积在损伤的血管壁上，组织血小板与其它细胞聚集，同时解聚已聚合的血小板，而被激活的血小板能释放5-羟色胺，促进血管内皮细胞释放血管舒张因子NO[1]。NO本身具有抑制白细胞粘附、中和氧自由基尔拮抗过氧化作用[5]，同时扩张血管，改善血液循环状态。试验中观察到XML组再灌注1h，家兔尿量明显增强，表明内脏血供开始恢复;血液pH值由再灌注后30min7.24±0.07逐渐增至7.31±0.04，也提示缺血再灌注后引发的酸中毒有所纠正。实验结果提示，心脉龙注射液对缺血再灌注兔有一定保护作用。