实验一 酵母RNA的提取及含量测定
一、实验目的与要求
1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。
2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法,
3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
二、实验原理
由于RNA的来源和种类很多,因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出,此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA,用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA,主要用作制备核苷酸的原料,其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液,90℃提取3-4h,迅速冷却,提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。 酵母含RNA达2.67-10.0%,而DNA含量仅为0.03-0.516%,为此,提取RNA多以酵母为原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(-C=C一C=C-),能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。核酸(DNA,RNA)的最大紫外吸收值在260nm 处。遵照Lambert-Beer 定律,可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。
在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同,紫外吸收光也随之表现出明显的差异,它们的摩尔消光系数也随之不同。所以,在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。
核酸的摩尔消光系数(或吸收系数),通常以ε(ρ)来表示,即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值(即光密度,或称为光吸收)。核酸的摩尔消光系数不是一个常数,而是依赖于材料的前处理、溶液的pH 和离子
强度发生变化。RNA 溶液(pH = 7.0)的ε(ρ)= 7 700-7 800,RNA 的含磷量为9.5%,含1μg /mL RNA 溶液的光密度为0.022-0.024。因此,测定未知浓度的DNA(RNA)溶液的光密度OD260nm,即可计算测出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高,如核酸3μg/mL 的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品,测定误差较小。
蛋白质由于含有芳香族氨基酸,因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm 波长处,在260nm 波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低,故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。
三、主要仪器和试剂
试剂:啤酒酵母粉、0.04M NaOH溶液、95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液:30mL乙醇加0.3mL HCl。
仪器:紫外分光光度计、离心机、真空干燥箱、三角瓶、烧杯、水浴锅。
四、实验步骤
1、称取5g干酵母粉,用30mL 0.04M NaOH溶液分步在研钵中研磨均匀后,转入2支50ml比色管,沸水浴加热35min,冷却,转入离心管,4000r/min,离心15min,将上清慢慢倾入装有10mL酸性乙醇的离心管,边加边搅动。
2、加毕,静置,待RNA沉淀完全后,5000r/min离心5min。弃去上清液。用95%乙醇分步将沉淀转移至布氏漏斗抽滤并洗涤,消耗95%乙醇体积总约30ml;
3、再用乙醚洗涤沉淀两次,消耗体积总约20ml,沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量(减去滤纸重量),并记录该数据。
4、RNA粗品中RNA纯度测定:将样品配制成含5~50μg核酸/mL的溶液:将上述RNA粗品溶解于100ml容量瓶,定容,静置,取上清液于紫外分光光度计上测定260nm吸收值,按下式计算纯品RNA浓度。若O.D260读数过大,则根据O.D260值再做适当稀释。
五、计算:
O.D260-260nm 波长处的光密度读数;
L-为比色杯的厚度,一般为1或0.5;
0.024为1μgRNA/mL的光密度;
六、结果
RNA浓度=O.D260/0.024×L=0.386/0.024μg/mL=16×10^-6 g/ml
干酵母粉RNA含量=RNA重/干酵母称重×100%
=16×10^-6 g/ml×100ml/5g×100%
=0.032%
七、思考题
1.破酵母细胞时为什么要在沸水浴中进行?
答:由于酵母细胞外有一层厚厚的细胞壁,而RNA存在于细胞质中,所以必需将酵母细胞的细胞壁研磨破碎后才能提取出RNA。加入NaOH之后水浴煮沸30min的作用是促进细胞壁变性,使类脂、甘露聚糖、葡聚糖等成分部分分解,使蛋白质变性,从而使细胞破裂,RNA则从细胞中分离出来。
另外细胞中含有多种分解RNA的酶类(如RNase等),为了避免RNA在提取过程中被降解,得到较为完整的RNA分子,破碎酵母细胞时应在沸水中进行,这样可以使细胞中降解RNA的蛋白酶类活性受到抑制甚至变性失活,从而起到保护RNA分子的作用。
2.为什么用酵母作为实验原料?如何使RNA从酵母中释放出来?RNA的等电点是多少?
答:酵母繁殖快,生长周期短;其细胞质中的核酸大部分是RNA,而DNA很少;RNA提取液与菌体分离比较容易,因此酵母是提取RNA的好材料。
工业上将RNA从细胞中释放出来主要有三种方法,包括稀碱法、浓盐法和自溶法。(1)稀碱法是在一定的碱浓度下,使构成细胞壁的蛋白质、脂肪及糖的化合物得到水解,从而破坏细胞壁,使RNA从细胞中释放出来,该方法属于化学破壁法。(2)浓盐法是基于改变酵母细胞的渗透压,是细胞自身破裂而释放出RNA,即利用高浓度的盐(10% NaCl)在90~100°C条件下改变了细胞膜通透性,并将核蛋白体解离成RNA和蛋白质而使 RNA释放到盐溶液中。同时,90~100°C的高温可破坏磷酸单酯酶和磷酸二酯酶的活力,避免RNA的降解。该方法属于物理化学破壁法。(3)自溶法是利用某些酵母菌种在发酵结束后,细胞中的溶酶体膜破裂,使得溶酶体中的水解酶释放到细胞之中,利用菌体自身的酶系将细胞溶解,从而释放出RNA。通常自溶法的菌浓度为2%,PH值9.5~10,自溶温度以60~65°C为宜。
RNA的等电点为PH2.5。根据核酸在等电点溶解度最小的性质,将溶液在低温下调pH至2.0~2.5,RNA则以白色絮状沉淀形式从盐溶液中析出。再次离心,固液分离,便可获得RNA粗产品。
3 为什么用稀碱溶液可以使酵母细胞裂解?
答:酵母菌的细胞壁呈“三明治”结构——外层为甘露聚糖,内层为葡聚糖,中间层为一层蛋白质分子(包括多种酶类),此外细胞壁壁上还含有少量的类脂和几丁质。稀碱溶液能够对酵母菌细胞壁和细胞膜上的脂类起到抽提作用,脂类发生皂化反应从而被分解,使细胞穿孔。同时细胞壁的聚糖成分在碱液中会部分水解,蛋白质(包括多种酶类)也会发生变性,从而增加酵母细胞的通透性,酵母细胞原生质膜失去选择透过性,细胞就破裂使RNA流出。
4.核酸的溶解性质是什么?常用什么试剂分离沉淀核酸?
答:核酸是具有极性的高分子物质,根据相似相溶原理,DNA和RNA都是微溶于水,其钠盐在水中的溶解度较大。它们可溶于2-甲氧乙醇,也可溶于10%左右的氯化钠溶液,但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂,尤其是在50%左右的乙醇溶液中溶解度很小。因此,常用乙醇从溶液中沉淀核酸,当乙醇浓度达50%时,DNA就沉淀出来,当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。
第二篇:实验七酵母RNA的提取及鉴定
姓名:郭沈杰年级专业:2012级生物科学同组者:蔡萍萍
学号:12050011012
实验七 酵母RNA的提取及鉴定
一、实验目的
掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
二、实验原理
酵母核酸中RNA含量较多,DNA含量则少于2%。RNA可溶于碱性溶液,当碱被中和后,可加乙醇使其沉淀,有此可得粗RNA制品。
用碱液提取的RNA有不同程度的降解。
三、实验仪器
1、离心机
2、水浴锅
3、电炉
4、烧杯
5、量筒
6、移液管
7、玻璃棒
8、滤纸
9、漏斗
10、试剂瓶
11、电子天平
12、pH试纸(pH1~14)
四、实验试剂
1、干酵母粉
2、0.2%氢氧化钠溶液:2g氢氧化钠溶于蒸馏水并稀释至1000ml。
3、乙酸(A.R.)
4、95%乙醇
5、 无水乙醚(A.R.)
6、10%硫酸:浓硫酸(比重1.84)10ml,缓缓倾于水中,稀释至100ml。
7、氨水(A.R.)
8、5%硝酸银溶液:5g硝酸银溶于蒸馏水并稀释至100ml,贮于棕色瓶中。
五、实验步骤
(一)RNA的提取:
1、称取2g干酵母粉于100ml烧杯中,加入0.2%氢氧化钠溶液10ml,沸水浴加热30分钟,经常搅拌(如沸水浴过程中溶液蒸干可再加5~8ml氢氧化钠)。冷却,然后加入乙酸数滴,使提取液呈酸性(pH试纸检验,pH5~6),离心10-15分钟(4000r.p.m)。
倒取上清液,加入2倍体积的95%乙醇,边加边搅,加毕,静置,待完全沉淀,过滤。
2、滤渣先用95%乙醇洗2次,每次约5毫升,再用无水乙醚洗2次,每次也约5ml。
3、洗涤时可小心地用玻璃棒搅动沉淀。乙醚滤干后,滤渣即为粗RNA,可鉴定和测定含量用。
(二)鉴定:
1、取上述RNA约0.5g,加10%硫酸5ml,加热至沸1~2分钟,将RNA水解。
2、水解液2ml,加入氨水2ml和5%硝酸银溶液1ml,观察是否产生絮状嘌呤银化合物。
注意事项:
1、离心管回收
2、离心的时候,要两两对称放置,且离心管中溶液的量基本一样。否则会遭成离心机转子的损坏。
六、实验结果
(一)RNA的提取:
加入乙酸使溶液呈酸性,溶液呈土黄色。
进行离心后,沉淀沉于离心管的下部,上半部分上清液呈土黄色。
取上清液,加入2倍体积的95%乙醇后,溶液呈现白色浑浊状
完全浑浊后,上清液呈白色,沉淀为白色。
过滤洗涤后,得RNA粗品。
(二)鉴定:
(1)水解后,溶液呈无色透明状。
加入氨水后,溶液仍澄清,溶液中似有油状物质产生。
加入硝酸银后,仍似有油状物质产生。
一段时间后,产生白色絮状沉淀。
(2)取水解液0.5ml,加苔黑酚—三氯化铁试剂1ml,加热至沸1min,观察颜色变化
七、实验分析
称取干酵母粉:2.0096g
最后得到的RNA粗品:0.034 g
RNA提取率(%)=RNA质量(g)/干酵母粉质量(g)x100%
本实验中RNA提取率(%)= 0.0346 g / 2.0096g = 1.722%
(稀碱法提取的RNA为变性RNA)
本实验为定性实验,提取酵母中的RNA中,产生白色沉淀时可能因副反应产生的其他沉淀,即最终的沉淀中可能混有其他杂质,不适于进行定量测定。
依据:酵母细胞富含核酸,且核酸主要是RNA,含量为干菌体的2.67%~10.0%,而DNA含量较少,仅为0.03%~0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA,主要用作制备单核苷酸的原料,其工艺比较简单。
八、实验注意事项
1. 过滤时, 洗涤不能带水, 否则沉淀粘在滤纸上取不下来。
2. 有时絮状沉淀出现较慢, 可放十多分钟。
3. 利用等电点控制RNA析出时,应严格控pH。
4. 稀碱法提取的RNA为变性RNA,可用于RNA组分鉴定及单核苷酸制备,不能作为RNA生物活性实验材料。
九、思考题
? 1、简述核酸分离纯化的一般原则。
保持核算一级结构的完整性;
尽量排除其他分子的污染,保持核酸纯度。
? 2、RNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些?
过滤时,洗涤不能带水,否则沉淀粘在滤纸上取不下来;
有时絮状沉淀出现较慢,可放十多分钟;
利用等电点控制RNA析出时,应严格控制pH;
稀碱法提取的rna为变性rna,可用于单核苷酸制备,不能作为rna生物活性材料。