【原理】

琼脂糖（agarose）是经过挑选，以质地较纯的琼脂（agar）作为原料而制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一含有硫酸根和羟基的多糖，它具有离子交换性质，这种性质会给电泳及凝胶过滤以不良的影响。琼脂糖是直链多糖，它由D－半乳糖和3,6－脱水－L－半乳糖的残基交替排列组成。

琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（98－99%），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。

血清中脂类物质与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小也相差很大，因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。

琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中，通电后可以看到脂蛋白向正极移动，并分离出几个区带。

正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为β－脂蛋白（最深），前β－脂蛋白（最浅）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原点处应无乳糜微粒。有时前β－脂蛋白也显示不出来。

琼脂糖主要通过氢键而形成凝胶。电泳时因凝胶含水量大（98－99%），近似自由电泳，因为固体支持物的影响少，故电泳速度快，区带整齐。而且由于琼脂糖不含带电荷的基团，电渗影响很少，是一种较好的电泳材料，分离效果较好。

血清中脂类物质与血清载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白（lipoprotein）形式存在。各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小也相差很大，因此，以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。

琼脂糖凝胶电泳分离血清蛋白方法简单。将血清脂蛋白用脂类染料苏丹黑（或油红等）进行预染。再将预染过的血清加样于琼脂糖凝胶板加样槽中，通电后可以看到脂蛋白向正极移动，并分离出几个区带。

正常人血清脂蛋白可出现三条区带，从阴极到阳极依次为β－脂蛋白（最深），前β－脂蛋白（最浅）及α－脂蛋白（比前β－脂蛋白略深些），在原点处应无乳糜微粒。有时前β－脂蛋白也显示不出来。

【操作】

1、预染血清血清0.2ml中加苏丹黑染色液0.2ml，混合置37℃水浴中染色30分钟，离心（2000转/分）约5分钟。以除去悬浮于血清中染料沉渣。

2、制备琼脂糖凝胶板将已配制好的0.5%琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化，用吸管吸取凝胶溶液浇注在载玻片上，约3 ml。静置半小时后凝固（天热时需延长，也可放入冰箱中数分钟以加速凝固）。

3、点样将剪好的滤纸条对折，以折边在距凝胶一端2cm处切一点样口。将毛细管插入预染好的血清中，待吸入部分血清后，取毛细管使其有样品的一端靠于点样口端部，停靠3秒左右。

4、电泳将凝胶板平放入电泳槽中，使加样端接在阴极一侧，用四层滤纸或纱布做成“引桥”，敷于胶板的两端，各搭住凝胶板约1cm左右，“引桥”的另一端浸于电泳槽内的巴比妥缓冲液中。接通电源，首先调节电流为3-4mA/凝胶板，电泳10－15分钟；然后调节电流为6-7mA/凝胶板，电泳30－40分钟，即可观察到分离的区带。

5、如果需要保留电泳图谱，可将电泳后的凝胶板（连同载玻片）放入清水中浸泡脱盐2小时，然后放烘箱（80℃左右）中烘干即可。

【试剂】

1、苏丹黑染色液将苏丹黑B加到无水乙醇中至饱和，摇荡使乙酰化。用前过滤。

2、巴比妥缓冲液称取巴比妥钠15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸馏水至1000ml（pH为8.6，离子强度0.075），为电极缓冲液。

3、凝胶缓冲液取三羟甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸馏水溶解后，稀释至1000ml，pH为8.6。

4、琼脂糖凝胶称取琼脂糖0.45 g溶于50 ml凝胶缓冲液中，再加水50 ml。在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。

【注意事项】

1、电泳样品应为新鲜的空腹血清。

2、加热溶化琼脂时，须防止水份蒸发过多。琼脂糖凝胶最好随用随制，以免凝胶表面干燥，影响分离效果。

3、制作凝胶板时琼脂糖浓度一般选用0.5%左右为宜，高于1%以上α－脂蛋白部分较紧密，β和前β－脂蛋白部分不够清晰；低于4.5%则凝固性较差，图谱不清。

4、点样口要大小适宜，边缘整齐、光滑，否则会影响电泳图谱。

5、在α－脂蛋白前若出现较浅区带，可列为前α－脂蛋白。

【正常参考范围】

α－脂蛋白　20~30%

β－脂蛋白 20~30%

前β－脂蛋白 0~28%

乳糜微粒（-）

第二篇：非浓缩尿SDS2琼脂糖凝胶蛋白电泳的临床应用

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文章编号:100122087(2004)0620506203　　　中图分类号:R446.12　　　文献标识码:A

非浓缩尿SDS2琼脂糖凝胶蛋白电泳的临床应用

张春兵,　李　飞

(江苏省中医院,江苏南京210029)

　　摘要:目的　探讨非浓缩尿蛋白电泳对早期肾损伤诊断的应用价值。方法　对55例患者尿液标本分别进β行尿蛋白半定量及尿蛋白(U2Pr)、尿微量白蛋白(mAlb)、N2乙酰22D2氨基葡萄糖苷酶(NAG)β,2D2半乳糖苷酶

(GAL)定量测定,与非浓缩尿的十二烷基磺酸钠2琼脂糖凝胶蛋白电泳(SDS2AGE)结果进行分析比较。结果　

与SDS2AGE结果相比较,尿常规及全自动生化仪定量测定有关指标的灵敏度相对较低。结论　SDS2AGE检测灵敏度高,方法简便,省时,扫描后可得半定量结果,且结果较直观,对早期肾损伤诊断有较大的应用价值。

关键词:非浓缩尿;蛋白电泳;尿蛋白

　　ClinicalapplicationofSDS2agarosegelelectrophoresisforurinaryanalysisusingnonconcentratedurinesample　ZHANGChunbing,LIFei.TCMHospitalofJiangsuProvince,JiangsuNanjing210029,China

　　Abstract:Objective　Tostudythesignificanceofsodiumdodecylsulfateargarosegelelectroproresis(SDS2AGE)

forurinanyproteinanalysisusingnonconcentratedurinesample.Methods　Urinaryproteinof55nonconcentratedurinesampleswereanalyzedusingSDS2AGEandurineanalyzer.Urinaryprotein,urinaryalbumin,NAGandGALwerealsomasuredusingautomatedchemistryanalyzer.Results　SDS2AGEwasmoresensitivethanothertwometh2ods.Conclusions　SDS2AGEissensitive,simple,lesstime2consumingandshowsintuitionalresultsforurinaryproteinanalysis.Itisworthfulforclinicalapplication.

　　Keywords:Nonconcentratedurine;Sodiumdodecylsuffateargaroseelectrophoresis;Urinaprotein

　　蛋白尿是肾损伤较为常见的临床表现之一,

尿液标本取材简便,无创伤。目前常用的检测方法为尿蛋白半定量(尿液分析仪),以及采用免疫比浊法检测尿总蛋白(U2Pr)、尿微量白蛋白(mAlb)和生化定量分析检测N2乙酰2β2D2氨基葡

β萄糖苷酶(NAG)、2D2半乳糖苷酶(GAL),但上述检测受灵敏度等多方面因素影响,具有相当的局

限性,而且难以全面的分析肾损伤的部位和程度。十二烷基硫酸钠2琼脂糖凝胶电泳(SDS2AGE)因其检测灵敏度高,可将非浓缩尿蛋白成分按分子大小分离出各种蛋白组分,因此可根据各组分的出现与否判断肾单位损伤部位、程度,而且能较全面反映肾脏的整体情况。为分析各种原因导致的肾损伤的诊断、疗效监测、预后判断提供有价值的依据[1]。我们对尿常规测定蛋白,生化分析仪测U2Pr、mAlb、NAG、GAL及SDS2AGE非浓缩尿蛋

材料和方法

一、标本

随机选择门诊及住院患者55例(临床开出尿

常规检查申请的患者),男33例,女22例,年龄10～75岁,所有患者均留新鲜晨尿送检。

二、仪器

法国Sebia公司HYDRASYS全自动电泳仪;韩国YD2URISCAN尿分析仪;日本OLYMPUSAU2700全自动生化仪。

三、试剂

1.尿蛋白电泳试剂盒　Sebia公司(批号:08032/04)。内含:(1)pH(7.0±0.1)琼脂糖凝

胶;(2)pH(6.9±0.1)SDS缓冲条带;(3)SDS2溴酚蓝稀释液;(4)2.0g/L结晶紫染色液。

2.U2Pr　RANDOX试剂(批号:156UP)。

3.mAlb　上海太阳生物技术公司(批号:2002/11/15)。

4.NAG、GAL　福建三明市蓝波生物技术研

白电泳结果进行比较分析。

作者简介:张春兵,男,19xx年生,学士,主管技师,主要从事临床化学研究。

? 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.

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究所(批号分别为:2003/02/10、2002/12/30)

5.尿常规检测试纸条　盈东生物技术(北京)有限公司(批号:41223)。

四、方法

1.SDS2AGE　收集晨尿10ml,1500r/min离心5min,上清液待测。取20μlSDS2溴酚蓝稀释液加入80μl已处理尿液,混匀,吸取5μl加入凝胶孔中(5孔/板),扩散10min,打开电泳仪装上缓冲条带,放置凝胶于电泳板上启动电泳程序,电泳15min。取出凝胶置染缸烘干,染色,脱色,固定,扫描,报告结果。全过程耗时2.5h。

2.生化指标测定　用日本OLYMPUSAU2700全自动生化仪按试剂给定参数设置相关项目,定标通过后,直接测定尿液U2Pr、mAlb、NAG、GAL含量。

3.尿常规测定　用YD2URISCAN尿分析仪

五、统计学方法

采用单因素方差方法分析结果。

结

果

一、SDS2AGE电泳结果

按Sebia公司提供非浓缩尿蛋白电泳说明书所写标准分类,分为混合型、肾小管型、肾小球型、生理性、溢出性蛋白尿。

二、尿常规结果

按试纸条说明书所写标准(±0.1g/L,+0.3g/L,++1g/L,+++3g/L,++++10g/L)分类,55例尿蛋白半定量结果与非浓缩尿蛋白电泳,结果见表1。

三、U2Pr、mAlb、NAG、GAL结果

分别根据尿常规及电泳结果分类,采用方差分析进行统计,结果见表2。

直接进行尿蛋白半定量测定。

表1　尿常规蛋白半定量结果与SDS2AGE尿蛋白电泳结果统计表(55例)

电泳分型

-

尿常规

±

177/41.22/11.76/35.32/11.70/00/0

+102/20.00/03/30.01/10.04/400/0

++83/37.50/04/50.00/01/12.50/0

+++42/50.00/02/50.00/00/00/0

++++

51/20.00/04/80.00/00/00/0

例数混合型肾小管型肾小球型溢出型生理性正常

110/02/18.21/9.11/9.12/18.25/45.5

　　注“:/”左边为SDS2AGE电泳各型在不同程度尿常规蛋白半定量结果中的例数,右边为其所占百分比

表2　尿常规蛋白半定量分类及尿SDS2AGE电泳结果分类的4项生化指标结果(?x±s)

方法和分类尿蛋白半定量-　　　±　　　+　　　++　　　+++　　　++++尿SDS2AGE电泳　　混合型　　肾小管型　　肾小球型　　溢出型　　生理性　　正常

345.4±119.0△217.8±40.9△398.9±153.0△278.3±34.6△199.8±77.9△110.0±21.7

182.0±106.5△156.3±92.5△193.6±70.5△51.0±14.0△100.0±73.6△25.4±3.1

123.4±93.0130.5±53.926.4±13.252.0±7.670.0±14.845.6±9.6

26.2±26.012.8±6.730.1±24.34.5±1.716.6±9.95.0±2.4

U2Pr(mg/L)

mAlb(mg/L)

NAG(U/L)

GAL(U/L)

　　162.0±68.1

259.7±41.2

3

　　60.4±47.7

145.1±85.9

3

　　61.0±22.4

92.6±60.6

3

　　　　9.4±7.7

13.8±10.9315.2±10.2314.9±7.0367.0±5.3357.0±26.73

241.2±64.93404.0±80.03470.0±68.73607.0±34.83

87.8±43.43282.4±57.73226.8±37.93144.8±25.63

68.2±14.8391.8±22.73123.8±14.03324.4±112.23

　　注:1.正常参考值范围:U2Pr28～141mg/L,mAlb0～60mg/L,NAG35～65U/L,GAL2～16U/L;2.与蛋白半定量分类中“-”组比较,3P<0.01;与电泳分类中正常组比较,△P<0.01

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讨论

SDS2AGE电泳通过琼脂糖凝胶的分子筛作

正常尿液内蛋白含量极微,但当肾脏发生病

变时,会引起不同分子量的蛋白质析出,如肾小管疾病时,在尿液中就会有超过正常值范围的小分子蛋白析出,电泳结果便表现为肾小管型蛋白尿,即小分子蛋白尿;同样,肾小球病变时,大分子蛋白析出,表现为肾小球型蛋白尿;而肾小球和肾小管都存在病变时,大小分子蛋白共同存在,为混合型蛋白尿;仅有白蛋白升高为生理性蛋白尿,仅有小分子蛋白,而且小分子蛋白区出现少量深染条带,为溢出性蛋白尿,与肾小管型蛋白尿的区别在于本周蛋白谱带单一,各带含量大小不均。因此检测尿中蛋白是判断肾脏是否损伤的常用方法。

本实验有11例尿分析仪蛋白半定量结果为“-”,但其电泳结果异常者4例,生理性蛋白尿2例,正常者为5例,仅占45.5%,我院为全国中医肾病中心,来检查尿常规的患者中肾科占很大的比例,所以随机选择的尿液样本阳性率较高。17例尿常规蛋白半定量结果为“±”的尿液电泳结果全部不正常,而1例“+”,1例“++”,电泳均为生理性蛋白尿,说明尿常规受其检测灵敏度(0.1g/L)等因素限制,检测结果有相当大的局限性,容易产生漏检或误检,仅粗略反映尿中蛋白含量,对临床病因诊断帮助不大。

免疫比浊法灵敏度相对较高(0.07g/L),可用生化仪定量测定反映早期肾损伤的生化指标U2Pr、mAlb、NAG、GAL。由表2可知,在SDS2AGE电泳结果正常的标本中,溢出性和生理性2种非肾疾病引起U2Pr都不在正常值范围,说明U2Pr结果对肾疾病不特异,易误诊。mAlb在电泳结果中提示肾损伤时不在正常值范围,而溢出性与生理性2种情况其结果均有部分数值在正常值范围内,说明mAlb对肾脏疾病还不是很特异。NAG、GAL则在电泳结果异常时均有数值在正常范围内的情况存在,说明尿NAG、GAL敏感性较差。按尿常规蛋白半定量结果分组用方差分析进行统计,4项生化指标差异均有显著性(P<0.01),但因是按灵敏度不高的尿常规结果分组,并无多大临床意义,而按灵敏度很高的电泳结果分组,则NAG、GAL指标在电泳结果正常与异常间差异无显著性(P<0.05)。说明作为判断肾脏疾病的指标,生化指标并不完全可靠,而且与尿常规一样,生化指标也存在不能反映出肾单位损伤具体部位的缺点。

用,使电泳的迁移率与摩擦系数的反比关系只表现在蛋白质分子大小上,因此尿蛋白各组分便可按分子量的大小顺序排列在凝胶上,便于做肾单位损伤病理分析[2,3]。根据尿液中蛋白质的分子量大小,区分出肾小管型、肾小球型、混合型蛋白尿,同时还可区分出生理性和溢出性蛋白尿。我们所检测的55例标本中,有54.5%的尿常规蛋白“-”患者、10.9%的mAlb正常患者、29.1%的NAG、GAL正常患者存在肾脏损伤,而尿常规蛋白和生化指标显示异常者中,有12%为生理性蛋白尿、7.3%为溢出性蛋白尿,这些均不是肾脏损伤引起的。由这些数据来看,Sebia电泳的优势显而易见,他可对尿液中的异常蛋白定性,通过电泳可区分出尿中各种蛋白成分,如白蛋白、脂蛋白、转铁蛋白、补体和本周蛋白等。临床可根据不同类型的蛋白尿来判断患者肾脏有无疾病,或是哪一部分发生病变,从而指导临床医生的治疗和预后判断。他还具有操作简便,灵敏度高(0.015g/L)的特点,电泳膜片通过光密度扫描仪进行分析,便可获得直观尿蛋白电泳图谱及百分含量,对尿液的选择性程度做出初步估计,用于早期肾损伤的诊断和疾病治疗过程中对病情的动态分析有很大价值[4]。

综上所述,尽管肾损伤的诊断金标准是肾活检,但经比较研究证实SDS2AGE电泳检测灵敏度高且他的分型与肾活检结果相符[4],且可无创伤地随时了解患者尿液中各蛋白组分的含量及变化,这对肾脏疾病的诊断,指导治疗和预后判断有极高的价值,是一种很值得推广的早期肾损伤实验室检测方法。

致谢:感谢上海第二医科大学附属新华医院检验科沈霞教授对本课题的指导和帮助。

参考文献

[1]　陈　立,庄叶萍.SDS2AGE非浓缩尿蛋白电泳的建

立与应用[J].天津医科大学学报,2002,8:1092110.

[2]　王生余.半薄SDS2PAGE垂直式平板电泳法检测尿

蛋白谱[J].肾脏病与透析肾移植杂志,1999,8:393.

[3]　郭荛君.蛋白电泳实验技术[M].北京:科学技术出

版社,1999.1462157.

[4]　沈　霞,张敏华,汪　萍,等.非浓缩尿蛋白电泳的

临床应用[J].中华检验医学杂志,2001,24:2662

268.

(收稿日期:2004205231)

(本文编辑:龚晓霖)

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