农业微生物学实验指导 北京农学院食品科学系 授课教师 刘一倩 高秀芝 20xx年3月 实验1显微镜的使用及细菌形态的观察 1目的要求 1了解普通光学显微镜的构造各部分的功能和使用方法。 2学习并掌握油镜的原理和使用方法熟悉几种常见微生物的基本形态。 2普通光学显微镜的构造与油镜的工作原理 2.1普通光学显微镜的构造 显微镜的构造可分为机械装置和光学系统两大部分。机械装置包括镜座、镜筒、镜臂、物镜转换器、载物台、推进器、粗调螺旋、微调螺旋、光圈等部件光学系统由接目镜、接物镜、聚光器、反光镜等组成图1-1。 1镜座 镜座是显微镜底座用以支撑全镜呈长方形。其上装有电源开关、照明光源、保险丝、光源滑动变阻器等。 2镜筒 镜筒上连接目镜、下连接转换器光线从筒中通过。 安装目镜的镜筒分为可调式的单筒和固定式的双筒两种。从镜筒上缘到物镜转换器螺旋口之间的距离称为筒长。国际上将显微镜的标准筒长定为160mm此数字标在物镜的外壳上。 3镜臂 连接镜筒和镜座。有的镜臂是固定的有的可向后方倾斜其作用是支撑镜筒、载物台、聚光器和调焦装置等。 4物镜转换器 转换器上可安装35个物镜一般是3个物镜低倍镜、高倍镜、油镜。转动转换器时可以按需要调换各种物镜将之推到使用位置上。 图1-1 光学显微镜构造示意图 5载物台 载物台呈长方形中央有一孔为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推进器。 6推进器 推进
器由一横一纵两个推进齿轴和齿条构成转动其上螺旋可使标本片向前、后、左、右移动。研究型显微镜的纵横架杆上刻有刻度标尺构成精密的平面坐标系。如需要重复观察已检查标本的某一物像时可在第一次检查时记下纵横标尺的数值下次按数值移动推进器就可以找到原来标本的位置。 1.物镜转换器2.物镜3.游标卡尺4.载物台5.聚光器6.虹彩光圈
7.光源8.镜座9.电源开关10.光源滑动变阻器11.粗调螺旋12.微调螺旋13.镜臂14.镜筒15.目镜16.标本移动螺旋 7粗调螺旋 粗调螺旋用于粗放调节物镜和标本的距离。老式单目镜显微镜的粗调螺旋向前扭动镜头下降接近标本。新式双目镜显微镜如Motic显微镜镜检时双手向后扭动使载物台上升让标本接近物镜反之则下降标本远离物镜。使用显微镜观查标本时主要使用粗调螺旋调节。 8微调螺旋 用粗调螺旋只能粗放地调节焦距难于观察到清晰的物像因而需要用微调螺旋做进一步调节。其每转一周镜筒移动0.1 mm。新式研究型显微镜粗、微螺旋为共轴式。原则上微调螺旋每次旋转不超过一周。 9光圈 在聚光器下方可任意开闭用来调节射入聚光器光线强弱。 10接目镜 目镜作用是将物镜放大了的实像进行第二次放大形成虚像并映入眼帘。不同的目镜上刻有5×、10×、15×等字样以表示该目镜的放大倍数。 普通光学显微镜常用的目镜主要是惠更斯目镜。研究型显微镜配有性能更好的目镜如补偿目镜K、平场目镜P和广视场目镜WF等。
照相时选用照相目镜NFK。 11接物镜 物镜安装于转换器上入射光线通过物镜时使被检物像形成第一次放大的实像。普通显微镜装有低倍镜10×、高倍镜40×和油镜100×三种消色差物镜外壳上标有“Ach” 字样通常与惠更斯目镜配合便用。使用低倍镜和高倍镜时物镜与标本间的介质是空气称之为干燥系物镜。而使用油镜时物镜与标本间的介质是香柏油称之为油浸系物镜。油镜标有HI或Oil字样及镜头下缘刻有白环或红环。检查细菌标本要用油镜。研究型显微镜配有性能更好的物镜如复消色差物镜Apo、平场物镜Plan、平场消色差物镜Plan Ach、平场复消色差物镜Plan Apo等。 12聚光器 由聚光透镜、升降螺旋和能调节开孔大小的虹彩光圈组成装在载物台下面可通过升降螺旋而起落。其作用是将光线聚光于标本之上增强照明度。普通光学显微镜配置的都是明视场聚光器分为阿贝聚光器、齐明聚光器和摇出聚光器三种。研究型显微镜如Motic BA400显微镜配有性能更好的消色差摇出式聚光器能将聚光器上透镜从光路中摇出满足低倍物镜4×大视场照明的需要。齐明聚光器虽质量最好但不适于4倍以下的物镜。 13反光镜 早期普通光学显微镜常用自然光检视标本在镜座上装有反光镜由平凹两面镜子组成。光线较强时用平面镜光弱时用凹面镜可自由旋转方向以将最佳光线反射入聚光器。新式研究型显微镜镜座上装有光源并由电流调节螺旋来调节光照强度。 2.2油镜使用的工作原理
在显微镜的光学系统中物镜的性能直接影响显微镜的分辨率。与其他物镜相比油镜的放大倍数最大使用也比较特殊需在载玻片与镜头之间滴加香柏油这主要有如下二方面的原因 1增加照明亮度 油镜的放大倍数虽然可达100×但因焦距很短镜头直径很小进入镜头中的光线亦较少故所需要的光照强度最大图1-2。当油镜头和标本玻片之间的介质为空气时因空气折射率n1.00与玻璃的折射率n1.55不同会有一部分光线被折射而不能进入镜头内使视野更暗物像显现不清。若在镜头与标本玻片之间滴上与玻璃的折射率相仿的油类如香柏油n1.52等则光线不发生折射从而增加了视野的照明亮度图1-3。 图1-2 物镜的焦距、工作距离和虹彩光圈的关系 图1-3 干燥系物镜A与油浸系物镜B的光线通路 2增加显微镜的分辨力 显微镜的分辨力或分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值口径成正比与光波长度成反比。因此当光波波长一定时物镜的数值口径愈大则显微镜的分辩力愈大被检物体的细微结构也愈清晰地区别出来。分辨力可由下列公式表示 分辨力最大可分辨距离λ/2NA 式中λ为光波波长0.40.7 ?0?8mNA为物镜的数值口径值。它是光线投射到物镜上的最大角度称为镜口角的一半正弦与介质的折射率之乘积即NAn·sinα。式中α为光线最大入射角的半数它取决于物镜的直径和焦距。在实际应用中光线入射角最大只能达到120?0?2其半数的正弦为
Sin60?0?20.87。以空气为介质时NA1×0.870.87而以香柏油为介质时NA1.52×0.871.32故以香柏油为介质的油镜要比用空气为介质的高倍镜分辩力高因而细菌用油镜才可观察到。 然而显微镜的放大倍数越高并不等于其分辨力越高。假如采用放大率为40×的高倍镜NA0.65和放大率为24×的目镜虽然总放大率为960×但其分辩力只有0.42?0?8m若采用放大率为90×的油镜NA1.25和放大率为9×的目镜虽然总放大率为810×但却能分辨出0.22?0?8m之间的距离因而显微镜的总放大倍数越高并不是其分辨力越高。 3实验材料 3.1菌种 细菌三型、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli等染色玻片标本。 3.2溶液或试剂 香柏油、二甲苯。 3.3仪器与其他用具 显微镜、擦镜纸等。 4普通光学显微镜的使用流程 安置→调光源→调目镜→调聚光器→镜检低倍镜→高倍镜→油镜 →擦物镜头→复原 5操作步骤 5.1观察前的准备
5.1.1显微镜的安置 置显微镜于平整的实验台上镜座距实验台边缘约10cm。镜检时姿势要端正。一般用左眼观察右眼绘图或记录两眼同时睁开以减少眼睛疲劳。 5.1.2光源调节 安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度。反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时较强的自然光源用平面镜较弱的照明光源用凹面镜并调节其角度使视野内的亮度适宜、均匀。凡检查染色标本时光线应强检查未
染色标本时光线不宜太强可通过光圈、聚光器、反光镜调节适宜的光线。 5.1.3双筒显微镜的目镜调节 根据使用者的个人情况双筒显微镜的目镜间距可以适当调节而左目镜上一般还配有屈光度调节环可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。 5.1.4 聚光器数值孔径值的调节 正确使用聚光镜才能提高镜检效果。聚光镜的主要参数是数值孔径它有一定的可变范围一般聚光镜边框上的数字是代表它的最大数值孔径通过调节聚光镜下面可变光阑的开放程度可以得到各种不同的数值孔径以适应不同物镜的需要。 5.2 显微镜观察 一般情况下特别是初学者进行显微镜观察时应遵守从低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序。因为低倍数物镜视野相对较大易发现目标和确定检查的位置。 5.2.1低倍镜观察 将标本片置于载物台上用弹簧夹固定移动推进器使观察对象处于物镜正下方。旋动粗调螺旋使物镜与标本片距离约lcm单镜筒显微镜或0.5cm双镜筒显微镜再以粗螺旋调节使镜头缓慢升起单镜筒或使载物台缓慢下降双镜筒直到物像出现后再用微螺旋调节使物像清晰。然后移动标本玻片将观察目标移至视野中心后仔细观察与绘图。 5.2.2高倍镜观察 由低倍镜直接转换成高倍镜至正下方。转换时需用眼睛于侧面观察避免镜头与玻片相撞。调节聚光器和光圈使视野亮度适宜而后微调细螺旋使物像清晰。利用推进器移动标本找到需要观察的部位并移至视野中心仔细观察或准备用油
镜观察。 5.2.3油镜观察 先将光圈开至最大集光器升至最高位调节好光源使照明亮度最强。 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后用粗调节螺旋将镜筒远离载物台然后在标本上滴加香柏油切勿过多否则视野模糊转换油镜头从侧面注视小心将之浸入油滴中使其几乎与标本片相接触为度注意切不可将油镜镜头压到标本否则不仅压碎玻片还会损坏镜头。用粗螺旋缓慢升起镜筒单镜筒或下降载物台双镜筒至物像出现后再以细螺旋调至物像清晰。如果油镜已离开油面而仍未见物像可再将镜头浸入油中重复以上操作至物像清晰为止。 5.3显微镜用后的处理 观察完毕台起镜头立即用擦镜纸擦去镜头上的油再用擦镜纸蘸取少许二甲苯香柏油溶于二甲苯或乙醚乙醇混合液擦去镜头上的残留油迹最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。严禁用手或其他纸擦镜头以免损坏镜头。用绸布清洁显微镜的金属部件。 将各部分还原将物镜转成“八”字形再将载物台下降至最低降下聚光器以免与物镜相撞反光镜垂直于镜座。套上镜套放回柜内或镜箱中。 6实验结果与报告 1分别绘出用油镜观察到的细菌的形态图。注意观察它们的个体形态、大小、排列方式。有芽孢的细菌观察其菌体两端情况及芽孢着生位置。 7思考题 1观察细菌时为何使用油镜它与干燥系物镜使用方法有何不同使用时注意哪些问题 2普通光学显微镜的目镜与物镜的常用放大倍数有几种显微镜的放大倍数越高分辩力越
高吗为什么举例说明。 3试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节螺旋的误操作 4根据实验体会谈谈应如何根据所观察微生物的大小选择不同的物镜进行有效的观察。 实验2 细菌的革兰氏染色及其形态观察 1目的要求 1了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 2学习掌握革兰氏染色技术进一步熟练光学显微镜油镜的使用技术。 2基本原理 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。根据细菌细胞壁的结构和化学组成的不同经革兰氏染色后呈现不同的染色反应可将所有细菌区分为两大类即革兰氏阳性菌用G表示和革兰氏阴性菌用G-表示。当细菌用结晶紫初染后像简单染色法一样所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂它能与结晶紫结合成结晶紫—碘的复合物从而增强了染料与细菌的结合力。染色关键在于脱色剂的脱色作用。当用乙醇或丙酮处理时两类细菌的脱色效果是不同的。G细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成壁厚、类脂质含量较低用乙醇或丙酮脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小透性降低从而使结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。G-细菌则不同由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量较高所以当脱色处理时类脂质被乙醇或丙酮溶解细胞壁通透性增大使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱
出来用复染剂复染后细胞被染上复染剂的红色。 3实验材料
3.1菌种 大肠杆菌Escherichia coli约24h营养琼脂斜面培养物枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis或蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus约1820h营养琼脂斜面培养物。 3.2染色剂 草酸铵结晶紫染色液、鲁格尔氏碘液、95乙醇、0.5番红沙黄染色液。
3.3仪器与其他用具 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶内装香柏油和二甲苯因二甲苯有毒及容易损坏镜头可用乙醚乙醇混合液替代二甲苯、生理盐水、擦镜头纸、吸水滤纸、纱布、火柴、玻璃铅笔、玻片夹或镊子等。 4实验流程 涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染1min→水洗→碘液媒染1min→水洗→95乙醇脱色30s→水洗→沙黄复染1min→水洗→滤纸吸干→镜检 5操作步骤 5.1制片 取菌种培养物按简单染色法中的常规涂片、干燥、固定进行制片。注意要用活跃生长期的幼龄培养物做革兰氏染色。 5.2初染 在涂片菌膜处滴加草酸铵结晶紫适量以刚好将菌膜覆盖为宜染色12min倾去染色液细水冲洗至洗出液为无色。 5.3媒染 滴加碘液于涂片上作用1min水洗。 5.4脱色 用滤纸吸去玻片上的残水滴加95酒精于涂片上轻轻摆动玻片直至乙醇脱色刚好不出现紫色为止一般30s如牛乳培养物用60s后立即水洗终止脱色。 5.5 复染 沙黄复染12min水洗。 5.6镜检 用滤纸吸干或自然干燥油镜检查。G菌呈蓝紫色G-菌呈红色。 革兰氏染色的注意事项①涂片不宜过厚勿使细菌
密集重叠影响脱色效果否则脱色不完全造成假阳性。镜检时应以视野内分散细胞的染色反应为标准。②火焰固定不宜过热以玻片不烫手为宜否则菌体细胞变形。③滴加染色液与酒精时一定要覆盖整个菌膜否则部分菌膜未受处理亦可造成假象。④乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。如脱色过度则G菌被误染成G-菌而脱色不足G-菌被误染成G菌。在染色方法正确无误前提下如菌龄过长死亡或细胞壁受损伤的G菌也会呈阴性反应故革兰氏染色要用活跃生长期的幼龄培养物。 6示范 在示范镜下观察大肠杆菌图2-1a、枯草芽孢杆菌图2-1b、金黄色葡萄球菌图2-1 c、藤黄微球菌图2-1d、钩端螺旋菌图2-1e、副溶血性弧菌图2-1f的形态及排列方式。 a b c d e f 图2-1 各种细菌在光学显微镜下的形态×1 000 7实验结果与报告 根据观察结果 按比例大小绘出革兰氏染色制片中细菌的形态图并说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应。 8思考题 1详叙革兰氏染色的原理及操作方法染色时应注意哪些问题 2哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性其中最关键的环节是什么 3不经过复染这一步能否区别G菌和G-菌 4为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察 5当你对未知菌进行革兰氏染色时怎样保证操作正确结果可靠 实验3 霉菌形态及菌落特征的观察 1目的和要求 1 学习并掌握观察四类常见霉菌形态特征的基本方法。 2 掌握青霉、曲霉的小室载片培养法以便更好地观察
其个体形态。 3 观察霉菌的平板菌落特征了解霉菌的菌落特征在丝状真菌形态学鉴定上的重要性。 2基本原理 霉菌是由复杂的菌丝体组成。它分为基内菌丝或营养菌丝、气生菌丝或繁殖菌丝由繁殖菌丝产生孢子。霉菌的繁殖菌丝及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。观察霉菌的形态常用的有下列三种方法①乳酸石炭酸棉蓝浸片法是将培养物置于乳酸石炭酸棉蓝染色液中制成霉菌制片。由于霉菌菌丝较粗大约为310?0?8m置于水中观察时菌丝容易收缩变形故常用乳酸石炭酸棉兰染色液制片使细胞不会变形染液的蓝色能增强反差并具有防腐、防干燥、防止孢子飞散作用能保持较长时间必要时还可用光学树胶封固制成永久标本长期保存。但用接种针或小镊子挑取菌丝体时菌体各部分结构在制片时易被破坏不利于观察其完整形态。②小室载玻片培养法用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上接种后盖上盖玻片培养霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后将载玻片上的培养物置显微镜下观察。这种方法可以保持霉菌自然生长状态便于观察到霉菌完整的营养和气生菌丝体的特化形态例如曲霉的足细胞、顶囊青霉的分生孢子梗、根霉的匍匐枝、假根等。此外也便于观察不同生长时期的培养物。③玻璃纸培养法其操作方法与放线菌的玻璃纸培养观察方法相似。此种方法用于观察不同生长阶段霉菌的形态亦可获得良好效果。
霉菌在固体培养基上生长呈棉絮状毛霉、蜘蛛网状根霉、绒毛状曲霉和地毯状青霉的菌落。其繁殖方式多为无性繁殖和少为有性繁殖。霉菌的菌丝体及其菌落形态特征是霉菌分类、鉴定的重要依据。 3实验材料 3.1菌种 黑曲霉、产黄青霉、黑根霉和总状毛霉2830℃培养35d的PDA或麦芽汁斜面和平板培养物点植接种、培养根霉假根的PDA平板培养物、培养霉菌的小室载玻片培养物。 3.2培养基 马铃薯葡萄糖PDA琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基。 3.3试剂与染色剂 乳酸石炭酸棉蓝染色液、50乙醇、20甘油保湿剂、无菌生理盐水。 3.4仪器与其他用具 接种环、接种钩、解剖针、解剖刀、镊子、酒精灯、载玻片、盖玻片、透明胶带、圆形滤纸片、U形玻璃棒、无菌平皿、无菌细口滴管、格尺、普通光学显微镜、体视显微镜、恒温培养箱等。 4操作步骤 4.1霉菌的形态观擦 4.1.1乳酸石炭酸棉蓝浸片法 在载玻片上滴一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液用解剖针或小镊子从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝先置于50乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子再置于载玻片上的染液中用解剖针小心地将菌丝分散开。盖上盖玻片注意勿压入气泡和移动盖玻片以免影响观察置于低倍镜和高倍镜下观察四类霉菌内容如下 根霉用低倍镜观察孢子囊梗囊轴等用高倍镜观察孢子囊孢子的形状大小。将根霉斜面培养物置于显微镜载物台上用低倍镜观察根霉的孢子囊柄、孢子囊、假根和匍匐枝。
图3-1 小室载玻片培养法示意图 毛霉用低倍镜观察孢子囊梗囊轴等用高倍镜观察孢子囊孢子的形状大小。将毛霉斜面培养物置于显微镜载物台上用低倍镜观察毛霉的孢子囊梗粗细、孢子囊大小、形状、色泽等。 曲霉在高倍镜下观察菌丝有无隔膜分生孢子着生位置辩认分生孢子梗、顶囊、小梗和分生孢子。 青霉在高倍镜下观察菌丝有无隔膜分生孢子梗、副枝、小梗和分生孢子的形状等。 4.1.2粘片法 取一滴棉蓝染色液置于载玻片中央取一段透明胶带打开霉菌平板培养物粘取菌体粘面朝下放在染液上。镜检。 4.1.3小室载玻片培养法 1培养小室的灭菌 将略小于平皿底部的圆形滤纸片1张、U形玻璃棒、载玻片和两块盖玻片等按图7-5放入平皿内盖上平皿盖包扎后于121℃湿热灭菌30min置60℃烘箱中烘干备用。 2琼脂块的制作 取已灭菌的PDA琼脂培养基67ml注入另一灭菌平皿中使之凝固成薄层。用解剖刀切成0.51.0cm2的琼脂块并将其移至上述培养室中的载玻片上每片放两块图3-1。制作过程应注意无菌操作。 上正面观下侧面观 1平皿2U形玻璃棒3盖玻片4培养物5载玻片6保湿用滤纸3接种和培养 用接种环或接种钩挑取很少量的青霉曲霉、根霉、毛霉的孢子接种于培养基四周用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上并轻压使之与载玻片间留有极小缝隙但不能紧贴载玻片否则不透气。注意接种量要少尽可能将孢子分散接种在琼脂块边缘上否则培养后菌丝过于稠密
影响观察。先在平皿的滤纸上加35ml灭菌的20甘油用于保持平皿内的湿度盖上皿盖皿盖上注明菌名、组别和接种日期置2830℃培养35d。 4镜检 培养至12d后可以逐日连续观察到孢子的萌发、菌丝体的生长分化和子实体的形成过程。将小室内的载玻片取出直接用低倍镜和高倍镜观察上述四类霉菌的形态重点观察曲霉分生孢子头和青霉的帚状枝形态根霉和毛霉的孢子囊和孢子囊孢子菌丝有无隔膜等情况。
4.1.4根霉的假根观察方法 将溶化并冷却至50℃的PDA培养基倒入无菌平皿其量约为平皿高度的1/2。冷凝后用接种环蘸取根霉孢子划线接种于.