间接血凝试验

    血凝试验(hemagglutinationtest)是红细胞凝集试验的简称。间接血凝试验是以红细胞作为载体的间接凝集试验，在临床检验中应用广泛，下面简述其操作过程。

间接血凝试验示意图

    (一)载体

    红细胞是大小均一的载体颗粒，最常用的为绵羊、家兔、鸡的红细胞及O型人红细胞。新鲜红细胞能吸附多糖类抗原，但吸附蛋白质抗原或抗体的能力较差。致敏的新鲜红细胞保存时间短，且易变脆、溶血和污染，只能使用2～3天。为此一般在致敏前先将红细胞醛化，可长期保存而不溶血。常用的醛类有甲醛、戊二醛、丙酮醛等。红细胞经醛化后体积略有增大，两面突起呈圆盘状。

    醛化红细胞具有较强的吸附蛋白质抗原或抗体的能力，血凝反应的效果基本上与新鲜红细胞相似。如用两种不同醛类处理效果更佳。也可先用戊二醛，再用鞣酸处理。醛化红细胞能耐60℃加热，并可反复冻融不破碎，在4~C可保存3～6个月，在—20℃可保存1年以上。

    (二)致敏

    致敏用的抗原或抗体要求纯度高，并保持良好的免疫活性。用蛋白质致敏红细胞的方法有直接法和间接法。直接法只需在低pH，低离子浓度下，用醛化红细胞直接吸附即可。间接法则需用偶联剂将蛋白质结合到红细胞上。常用偶联剂为双偶氮联苯胺(bidiazotizedbenzidine，BDB)和氯化铬。前者通过共价键，后者通过金属阳离子静电作用使蛋白质与红细胞表面结合而达到致敏的目的。

    (三)血凝试验

    血凝试验可在微量滴定板或试管中进行，将标本倍比稀释，一般为1：64，同时设不含标本的稀释液为对照孔。在含稀释标本1滴的板孔(或试管)中，加入0．5％致敏红细胞悬液l滴，充分混匀，置室温1～2h，即可观察结果。凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集(一)。如红细胞凝集，则分布于孔底周围。根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱，以+十凝集的孔为滴度终点。

血凝反应强度示意图

间接凝集反应的类型

    将可溶性抗原(或抗体)先吸附于适当大小的颗粒性载体的表面，然后与相应抗体(或抗原)作用，在适宜的电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象，称间接凝集反应(indirectagglutination)或被动凝集反应(passiveagglutination)。这种反应适用于各种抗体和可溶性抗原的检测，其敏感度高于沉淀反应，因此被广泛应用于临床检验。

    根据致敏载体用的是抗原或抗体以及凝集反应的方式，间接凝集反应可分为

    (一)正向间接凝集反应

    用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体。

正向间接凝集反应原理示意图

    (二)反向间接凝集反应

    用特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗原

反向间接凝集反应原理示意图

    (三)间接凝集抑制反应

    诊断试剂为抗原致敏的颗粒载体及相应的抗体，用于检测标本中是否存在与致敏抗原相同的抗原。检测方法为将标本先与抗体试剂作用，然后再加入致敏的载体，若出现凝集现象，说明标本中不存在相同抗原，抗体试剂未被结合，因此仍与载体上的抗原起作用。如标本中存在相同抗原，则凝集反应被抑制。同理可用抗体致敏的载体及相应的抗原作为诊断试剂，以检测标本中的抗体，此时称反向间接凝集抑制反应。

间接凝集抑制反应原理示意图

    (四)协同凝集反应

    协同凝集反应(co-agglutination)与间接凝集反应的原理相类似，但所用载体既非天然的红细胞，也非人工合成的聚合物颗粒，而是一种金黄色葡萄球菌A蛋白(staphylococcusprotienA，SPA)。SPA具有与IgG的Fc段结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。如与相应抗原接触，即出现反向间接凝集反应。协同凝集反应也适用于细菌的直接检测。

    在间接凝集反应中，可用作载体的颗粒种类很多，常用的有动物或人红细胞、细菌和多种惰性颗粒如聚苯乙烯胶乳(polystyrenelatex)、皂土(bentonite)及明胶颗粒、活性炭、火棉胶等。在临床检验中最常用的为间接血凝试验和胶乳凝集试验。

自身红细胞凝集试验

    自身红细胞凝集试验(auto-erythrocyteagglutinationtest)与一般间接血凝试验不同之处为反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。主要试剂材料为抗人O型红细胞的单克隆抗体，这种抗体能与不论何种血型的红细胞结合，但不引起凝集反应。当这种抗体与另一特异性抗体连接成双功能抗体，可以形成网络而导致红细胞凝集。该方法可用于检测标本中的抗原；如与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的抗体。反应中的标本为受检者的全血。

试验的过程如下：在白色塑料片上加血液标本1滴和上述试剂1滴，混匀，2min后观察结果，出现红细胞凝集为阳性。反应机制见图。

    血液标本中的红细胞和抗原(或抗体)分别与试剂中的抗红细胞单克隆抗体和特异性抗体(或抗原)反应，形成网络而导致红细胞的凝集。

    自身红细胞凝集试验的特点是受检标本为全血，不需分离血清，采指血或耳垂血进行试验，受检者即刻可知检测结果。此试验已成功地用于抗HIV抗体的检测。也有检测HBsAg的试剂供应，其敏感度与间接血凝试验相仿。

第二篇：口蹄疫正向间接血凝试验操作要点

口蹄疫正向间接血凝试验操作要点

免疫抗体检测是科学掌握动物免疫接种疫苗后抗体产生和消长变化的有效方法之一。口蹄疫正向间接血凝试验就是用口蹄疫抗原检测未知血清中是否含有口蹄疫抗体的血清学检测方法之一。近年来，此方法经常用于牲畜接种口蹄疫疫苗后能否产生抗体或抗体滴度能否达到免疫保护，以利于指导畜牧业生产。

一、原理

用已知血凝抗原检测未知血清抗体的试验，称为正向间接血凝试验，亦称间接血凝。 抗原与其对应的抗体相遇，在一定条件下形成抗原—抗体复合物。但这种复合物的分子团很小，肉眼看不见。将抗原吸附（致敏）在红血球表面，再与抗体结合，红血球便出现凝集现象，不仅肉眼能看见，而且反应的敏感性大大提高。口蹄疫正向间接血凝试验就是将口蹄疫纯化病毒致敏到绵羊红血球表面，制成口蹄疫血凝抗原，用于检测动物血清中的口蹄疫抗体水平。

二、适用范围

主要用于检测口蹄疫疫苗接种动物后血清抗体效价。

三、器材

1、 96孔110～120度V型医用血凝板，与血凝板大小相同的玻板。

2、 微量移液器与吸头。

3、 口蹄疫血凝抗原（口蹄疫正向血凝诊断液）。

4、 口蹄疫对照阴性血清。

5、 口蹄疫对照阳性血清。

6、 稀释液。

7、 待检血清（被检血清）。

四、试验方法

1、加稀释液

在血凝板上1～6排的1～9孔；第7排的1～4孔；第8排的1～12孔各加稀释液50微升。

2、稀释待检血清

取1号待检血清50微升加入第1排第1孔，混匀（避免产生过多的气泡），取出50微升移入第2孔，混匀后取出50微升移入第3孔??直到第9孔混匀后取出50微升丢弃。此时第1排1～9孔待检血清的稀释度（稀释倍数）依次为：1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，1:64，1:128，1:256，1:512。

取2号待检血清加入第2排；取3号待检血清加入第3排??均按上法稀释，注意！每取一份血清时，必须更换吸头一个。

3、稀释阴性对照血清

在血凝板上的第7排第1孔加阴性血清50微升，倍比稀释至第4孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃。此时阴性血清对照孔依次为：1:2，1:4，1:8，1:16。

4、稀释阳性对照血清

在血凝板上的第8排第1孔加入阳性血清50微升，倍比稀释至第12孔，混匀后从该孔取出50微升丢弃，此时阳性血清稀释倍数为1:2～1:4096。

5、加血凝抗原

被检血清各孔、阴性对照血清各孔、阳性对照血清各孔、稀释液对照孔均各加血凝抗原25微升。

6、振荡混匀

将血凝板置于微量振荡器上振荡1分钟，然后将血凝板放在白纸上观察各孔红血球是否混匀，不出现血球沉淀为合格。盖上玻板，静置于室温下1.5～2小时判定结果，也可延至翌日判定。

7、 判定标准

移去玻板，将血凝板放在白纸上，先观察阴性对照血清1:16孔，稀释液对照孔，应无凝集，或仅出现“+”凝集。

阳性血清对照1:2～1:256各孔应出现“++~++++”凝集为合格。

在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔，以呈现“++”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价。例如1号待检血清1～5孔呈现“++~++++”凝集，6~7孔呈现“++”凝集，第8孔呈现“+”凝集，第9孔无凝集，那么就可判定该份血清的口蹄疫抗体效价为1:128。

接种O型口蹄疫灭活苗的猪群血清O型抗体效价达到1:128（或1:128以上）为免疫合格。

五、注意事项

1、试验前，必须仔细阅读试剂盒内的说明书。

2、严重溶血或严重污染的血清样品不宜检测，以免发生非特异性反应。

3、为确保试验判断准确，不得使用90度和130度血凝板。

4、血凝板用后应及时在水龙头下冲净血球，再用蒸馏水或去离子水冲洗3次，甩干水分放 37℃ 恒温箱内干燥备用。检测用具应煮沸消毒，再置于 37℃ 恒温箱内干燥备用。

5、每次检测做一份阴性、阳性和稀释液对照即可。