食品卫生微生物检验实验室操作要求

食品微生物实验室工作人员，必须有严格的无菌观念，许多试验要求在无菌条件下进行，主要原因：一是防止试验操作中人为污染样品，二是保证工作人员安全，防止检出的致病菌由于操作不当造成个人污染。

一、无菌操作要求

二、无菌间使用要求

三、消毒灭菌要求

四、有毒有菌污物处理要求

五、培养基制备要求

六、样品采集及处理要求

七、样品检验、记录和报告的要求

一、无菌操作要求

1. 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。

2. 进行接种食品样品时，必须穿专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。

3. 接种食品样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。

4. 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。

5. 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。

6. 接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒。

7. 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处，接种结核菌和烈性菌的接种环应在沸水中煮沸5min，再经火焰烧灼。

8. 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

二、无菌间使用要求

1. 无菌间通向外面的窗户应为双层玻璃，并要密封，不得随意打开，并设有与无菌间大小相应的缓冲间及推拉门，另设有0.5-0.7m2的小窗，以备进入无菌间后传递物品。

2. 无菌间内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。

3. 无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。

4. 处理和接种食品标本时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

5. 在无菌间内如需要安装空调时，则应有过滤装置

三、消毒灭菌要求

微生物检测用的玻璃器皿、金属用具及培养基、被污染和接种的培养物等，必须经灭菌后方能使用。

(一)干热和湿热高压蒸气锅灭菌方法

1．灭菌前准备

(1)所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿如吸管、平皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。

(2)装培养基的三角瓶塞，用纸包好，试管盖好盖，注射器须将管芯抽出，用纱布包好。

2．装放

(1)干热灭菌器：装放物品不可过挤，且不能接触箱的四壁。

(2)大型高压蒸气锅：放置灭菌物品分别包扎好，直接放入消毒筒内，物品之间不能过挤。

3．设备检查

(1)检查门的开关是否灵活，橡皮圈有无损坏，是否平整。

(2)检查压力表蒸气排尽时是否停留在零位，关好门和盖，通蒸气或加热后，观察是否漏气，压力表与温度计所标示的状况是否吻合，管道有无堵塞。

(3)对有自动电子程序控制装置的灭菌器，使用前应检查规定的程序，是否符合于进行灭菌处理的要求。

4．灭菌处理

(1) 干热灭菌法：此法适应于在干热情况下，不损坏、不变质、不蒸发的物品、较常用于玻璃器皿、金属制品、陶瓷制品等的灭菌。

① 器械器皿应清洗后再干烤，以防附着在表面的污物炭化。

② 灭菌时安放物品不能过挤，不要直接接触底和箱壁，物品之间留有空隙。 ③ 菌时将箱门关紧，接上电源，先将排气孔打开约30min，排除灭菌器中的冷空气，温度升至160℃调节指示灯，维持1.5 –2h。

④ 灭菌完毕后或温度升温过程中，须在60℃以下才能打开箱门。

(2) 手提式高压锅或立式压力蒸气灭菌器的使用应按下列步骤进行：

① 手提式高压锅在主体内加入3L清水，立式高压锅加水16L(重复使用时应将水量补足，水变混浊需更换).

② 手提式压力锅将顶盖上的排气管插入消毒桶内壁的方管中(无软管或软管锈蚀破裂的灭菌器不得使用)。

③ 盖好顶盖拧紧，勿使漏气；置灭菌器于火源上加热，立式压力锅通上电源，并打开顶盖上的排气阀放了冷气(水沸腾后排气10-15min)。

④ 关闭排气阀，使蒸气压上升到规定要求，并维持规定时间(按灭菌物品性质与有关情况而定)。

⑤ 达到规定时间后，对需干燥的物品，立即打开排气阀排出蒸气，待压力恢复到零时，自然冷却至60℃后开盖取物，如为液体物品，不要打开排气阀，而应立即将锅去除热源，待自然冷却，压力恢复至零，温度降到60℃以下 再开盖取物，以防突然减压液体剧烈沸腾或容器爆破。

(3) 卧式压力锅蒸气灭菌器的使用按下列步骤进行：

① 关紧锅门，打开进气阀，将蒸气引入夹层进行预热，夹层内冷空气经阻气器自动排出。

② 夹层达到预定温度后，打开锅室进气阀，将蒸气引入锅室，锅室内冷空气经锅室阻气器自动排出。

③ 待锅室达到规定的压力与温度时，调节进气阀，使保持恒定至

④ 自然或人工降温至60℃再开门取物，不得使用快速排出蒸气法，以防突然降压，液体剧烈沸腾或容器爆破。

⑤ 使用自动程序控制式压力蒸气灭菌器，在放好物品关紧门后，应根据物品类别按动相应开关，以便按要求程序自动进行灭菌，灭菌时必须利用附设仪表记录温度与时间以备查，操作要求应严格按照厂家说明书进行。

5．灭菌温度与时间(1) 干热灭菌器灭菌温度160℃，1.5-2h。(2) 压力蒸气灭菌锅灭菌温度与时间

(二)间歇灭菌方法

1.灭菌方法系利用不加压力的蒸气灭菌，某些物质经高压蒸气灭菌容易破坏，可用此法灭菌。

(1)将欲灭菌物品置于锅内，盖上顶盖，打开排水口，使器内余水排尽。

(2)关闭排水口，打开进气门，根据需要消毒10～20min。

(3)灭菌完毕关闭进气门，取出物品待冷至室温温度，放入37℃温箱过夜，次日仍按上述方法消毒，如此三次，即可达到灭菌目的。

2．血清凝固器使用方法，培养基中含有血清或鸡蛋特殊成份时，因高热会破坏其营养成份，故用低温，可使血清凝固，又可达到灭菌目的。

(1) 在使用该法灭菌的血清等分装时，需严格遵守无菌操作，试管、平皿也经灭菌后使用。

(2)将培养基按要求使成斜面或高层，加足水后，接上电源，升温75～90℃1h灭菌，放37℃温箱过夜，再如此灭菌三次。

3．煮沸消毒：可用煮锅或煮沸消毒器，水沸腾后再煮5～15 min，也可在水中加入2﹪石炭酸煮沸5 min，加入0.02﹪甲醛, 80℃煮60 min均可达到灭菌目的, 但选用煮沸消毒的增消剂时, 应注意对物品的腐蚀性.

4．灭菌处理:灭菌后物品,按正常情况已属无菌,从灭菌器中取出应仔细检查放置,以免再度污染。

(1) 物品取出,随即检查包装的完整性,若有破坏或棉塞脱掉,不可作为无菌物品使用。

(2) 取出的物品,如为包装有明显的水浸者,不可作为无菌物品使用。

(3) 培养基或试剂等,应检查是否符合达到灭菌后的色泽或状态,未达到者应废弃。

(4) 启闭式容器,在取出时应将筛孔关闭。

(5) 取出的物品掉落在地或误放不洁这处,或沾有水液,均视为受到污染,不可作为无菌物品使用。

(6) 取出的合格灭菌物品,应存放于贮藏室或防尘柜内,严禁与未灭菌物品混放。

(7) 凡属合格物品,应标有灭菌日期及有效期限。

(8) 每批灭菌处理完成后,记录灭菌品名、数量、温度、时间、操作者。

四、有毒有菌污物处理要求

微生物实验所用实验器材、培养物等未经消毒处理，一律不得带出实验室。

1. 经培养的污染材料及废弃物应放在严密的容器或铁丝筐内，并集中存放在指定地点，待统一进行高压灭菌。

2. 经微生物污染的培养物，必须经121℃30min高压灭菌。

3. 染菌后的吸管，使用后放入5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液中，最少浸泡24h(消毒液体不得低于浸泡的高度)再经121℃30 min高压灭菌。

4. 涂片染色冲洗片的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道，染色的玻片放入5﹪煤酚皂溶液中浸泡24 h后，煮沸洗涤。做凝集试验用的玻片或平皿，必须高压灭菌后洗涤。

5. 打碎的培养物，立即用5﹪煤酚皂溶液或石炭酸液喷洒和浸泡被污染部位，浸泡半小时后再擦拭干净。

污染的工作服或进行烈性试验所穿的工作服、帽、口罩等，应放入专用消毒袋内，经高压灭菌后方能洗涤。

五、培养基制备要求

培养基制备的质量将直接影响微生物生长。因为各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下：

1．根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。

2．PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加入碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要准确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需注意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、去氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加入。

3．培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除去沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。

4．盛装培养基不宜用铁、铜等容器，使用洗净的中性硬质玻璃容器为好。

5．培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要注意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加入。

6．每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。如果是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。

7．目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。

8．每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作人员等应做好记录，以备查询。

六、样品采集及处理要求

1．所采集的检验样品一定要具有代表性，采样时应首先对该批食品原料、加工、运输、贮藏方法条件、周围环境卫生状况等进行详细调查，检查是否有污染源存在。

2．根据食品的种类及数量，采样数量及方法应按标准检验方法的要求进行。

3．采样应注意无菌操作，容器必须灭菌，避免环境中微生物污染，容器不得使用煤酚皂溶液，用新洁尔灭、酒精等消毒药物灭菌，更不能含有此类消毒药物或抗生素类药物，以避免杀死样品中的微生物，所用剪、刀、匙用具也需灭菌方可应用。

4．样品采集后应立即送往检验室进行检验，送检过程中一般不超过3h，如路程较远，可保存在1～5℃环境中，如需冷冻者，则在冻存状态下送检。

5．检验室收到样品后，进行登记(样品名称、送检单位、数量、日期、编号等)，观察样品的外观，如果发现有下列情况之一者，可拒绝检验。

(1) 样品经过特殊高压、煮沸或其他方法杀菌者，失去代表原食品检验意义者。

(2) 瓶、袋装食品已启开者，熟肉及其制品、熟禽等食品已折碎不完整者，即失去原食品形状者(食物中毒样品除外)。

(3) 按规定采样数量不足者。

对送检符合要求的样品，检验室收到后，应立即进行检验，如果条件不具备，应置4℃冰箱存放，及时准备创造条件，然后进行检验。

6．样品检验时，根据其不同性状，进行适当处理。

(1) 液体样品接种时，应充分混合均匀，按量吸取进行接种。

(2) 固体样品，用灭菌刀、剪取其不同部位共25g，置于225ml灭菌生理盐水或其他溶液中，用均质器搅碎混匀后，按量吸取接种。

(3) 瓶、袋装食品应用灭菌操作启开，根据性状选择上述方法处理后接种。

七、样品检验、记录和报告的要求

1．检验室收到样品后，首先进行外观检验，及时按照国家标准检验方法进行检验，检验过程中要认真、负责、严格进行无菌操作，避免环境中微生物污染。

2．样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字写出试验纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求详细、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。

第二篇：食品卫生微生物学检验大肠菌群检查操作程序

大肠菌群检验标准操作程序

1 大肠菌群

1.1 试剂：月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤、煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤、结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)、磷酸盐缓冲液、无菌生理盐水、无菌1mol/L NaOH、无菌1mol/LHCL

1.2 仪器：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、显微镜、均质器或灭菌乳钵、架盘药物

天平、灭菌吸管1ml、10ml、灭菌锥形瓶、灭菌玻璃珠、灭菌培养皿、灭菌试管、灭菌刀、剪子、镊子

1.3 大肠菌群MPN计数的检验程序

36±1℃  48±2h

 

                                36±1℃       48h±2h       

2 操作：

2.1 样品的稀释

2.1.1 固体和半固体样品：以称取25g样品，放入盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质杯内， 8000r/min-10000r/min的均质1-2min，或放入盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2分钟，做成1：10的均匀稀释液。

2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。

2.1.3 样品匀液的PH值应不6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/L NaOH或1mol/LHCL调节。

2.1.4 用1ml灭菌吸管或微量移液管理吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓缓注入注入9ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支1ml无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。

2.1.5 根据对样品污染情况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀淮。每递增稀释1次，换用一支1ml无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15分钟。

2.2 初发酵试验

2.2.1 每个样品，选择三个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如接种量超过1ml，则用双料LST肉汤），36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生，24h±2h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h±2h，产气者进行复发酵试验。未产气都为大肠杆菌阴性。

2.3 复发酵试验

2.3.1 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤

（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳

性管。

2.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告

2.4.1 按确证的大肠菌群LST阳性管数，检萦MPN表，报告每g(ml)样品中大肠菌群的MPN值。（见下表）              

大肠菌群最可能数（MPN）检索表