国家饮用水标准规定，饮用水中细菌总数每毫升不超过100个。

          

微生物学综合性实验论文

题目：自来水中细菌总数的测定

实验课程名称:微生物学实验

姓名：某某某

学号：000000000

专业：生物科学

班级：某某班

指导老师：某某某

自来水中细菌总数的测定

  姓名：某某某    指导老师：

 

摘要：本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以某种培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是近似值^【1】。目前一般采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在保证无菌的环境下，采取自来水的样品，利用培养基制作平板，按菌落计数方法进行计数，通过实验测得的菌落数对照国家饮用水标准来判断水质^【2】。良好的饮用水细菌总数应<100CFU/mL，而>500CFU/mL则不适宜饮用，我国饮用水卫生标准（GB5749—85）规定每毫升水样细菌总数37℃培养24h不得大于100个。对自来水用平板菌落计数技术测定细菌总数，通过观测得到每毫升自来水中菌落数为80个。

关键词：自来水  牛肉膏蛋白胨琼脂培养基  平板菌落计数技术  乳白色菌落

引言：各种天然水中常含一定数量的微生物，而水是微生物广泛分布的天然环境。水中微生物的主要来源是：水中的水生性微生物（如光合藻类）、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等^【3】。水是生命之源，人的生存离不开水环境，水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。自来水的微生物学检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。水中细菌总数可说明被有机物污染的程度，细菌数越多，有机物质含量越大。细菌总数是指1 mL水样在普通牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃经24h培养后，所生长的菌落数。本实验只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温的需氧细菌菌落总数^【4】。微生物学指标是评价水中生物性污染的重要指标，是水质在流行病学上安全的保证。近年来随着环境污染加重我国水质不断下降，给居民饮水安全带来隐患。因此，我们想通过测定自来水中的细菌总数，了解水质情况，呼吁人们保护水资源。

1  材料和方法

1.1 时间与地点

本实验于20##年11月1～2日在太原师范学院微生物实验室完成。

1.2材料

1.2.1 实验材料 自来水

1.2.2 实验试剂 牛肉膏蛋白胨培养基 1mol/LNaOH  1mol/LHCl 蒸馏水 

1.2.3 实验仪器 高压蒸汽灭菌锅 培养皿 三角烧瓶 天平 牛角匙 pH试纸（pH5.5-9.0） 量筒

玻璃棒  电热炉  温度计

1.3 方法

1.3.1灭菌

1.3.1.1首先将高压蒸汽灭菌锅内锅层取出，再向外锅内加入适量的水,使水面与三角搁架相平为宜。

1.3.1.2放回内锅层,并放入培养皿、三角烧瓶、量筒、移液管。

1.3.1.3加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺旋，使螺旋松紧一致，防止漏气。

1.3.1.4用电炉加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷气。待冷气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力上升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa，121℃，20min灭菌。

1.3.1.5灭菌时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时打开排气阀，旋松螺旋，打开盖子，取出灭菌物品。

1.3.2水样的采取

放开水龙头使水流3min后，用已灭菌的三角烧瓶接取水样，以待分析。

1.3.3制备牛肉膏蛋白胨培养基

1.3.3.1称量

用电子天平称量33g牛肉膏蛋白胨培养基粉末置于烧杯中。

1.3.3.2溶化

在上述烧杯中加入1000mL蒸馏水，然后，在石棉网上加热，并用玻璃棒搅拌直至沸腾2分钟。

1.3.3.3调pH

在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH。如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/L HCl进行调节。

1.3.4细菌总数测定

1.3.4.1灭菌移液管吸取1mL水样，注入其中一套灭菌的培养皿中。共做2个平皿。

1.3.4.2分别倾注约15mL已溶化并冷却到45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使自来水和培养基混匀。

1.3.4.3另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。

1.3.4.4待培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24小时，进行菌落计数。

两个平板的平均菌落数，即为1mL自来水的细菌总数。

2   结果与分析

2.1 结果

2.1.1实验数据

    测得培养皿中细菌菌落数如下表：

                              自来水中菌落总数表实验数据

自来水中细菌总数=（平板1菌落数+平板2菌落数）÷2-对照组菌落数

实验中对照组的菌落为15，处理上表中数据知，该自来水中细菌平均数为80个/ mL。

2.2分析

实验测的该自来水中的细菌总数为80个/ mL，符合国家饮用水标准。

本实验对照组中的菌数应为0个，但实验测得数据为15个，这主要是因为有杂菌混入，杂菌来源可能：培养皿灭菌不充分；灭菌后在空气中放置又落入杂菌；培养基倾入培养皿后没有立即加盖；配置培养基时反复升降温，使一些杂菌产生抗性^【6】。

3   讨论

人的生存离不开水环境，水质的好坏对人们生活起着至关重要的作用，而判断水质的标准，微生物在水中的数量、种类是必不可少的。细菌是微生物界的一个大类群，它与人类的生活密切相关，其中有的有益，有的有害，为了我们更好的生活，我们必须研究细菌，并掌握一些方法，来使细菌向人类有用的方面发展^【5】。

虽然水中存在大量的细菌且种类繁多，但由于牛肉膏蛋白胨所提供的生长条件的限制，培养基中所得的细菌群落较单一为大肠杆菌，呈圆片状^【7】。

实验过程中应做到：（1）培养皿灭菌后不能马上加水，因为高温会杀死自来水中的大肠杆菌；（2）培养基不能过早配制，过早配置使培养基在空气中暴露的时间过长，杂菌污染的可能性就会增大影响实验结果的正确性；（3）倒置培养基时应降温至45 ℃，温度过高会烫死大肠杆菌，过低会使培养基凝固；（4）倾注培养基后要将平皿在桌面上做匀速旋转，将培养基和自来水样摇匀，在培养基中观察时可见一些菌苔就是平皿没有摇匀的结果；（5）配置培养基时反复升降温，使一些杂菌产生抗性，培养基不能在空气中暴露过长时间，倾入培养皿后应立即加盖，以免杂菌混入；（6）将培养基倒置培养。这样绝大多数的细菌会着生在培养基表面。这是由于菌种在固体培养基上借助重力作用而形成的，有利于菌落计数。（7）应在高温时在对照组中倒入培养基，否则对照组中会出现大量的菌落^【8】。

测定水样是否符合饮用水的微生物方面的卫生标准，通常包括下列两项：细菌总数测定和总大

肠菌群的测定。除采用平板菌落计数测定细菌总数外，现在已有许多快速、简便的微生物检测仪或试剂纸（盒或卡）等用来测定水中细菌总数^【9】。

4   结论

实验测的该自来水中的细菌总数为80个/ mL，符合国家饮用水标准。

通过此实验，我们可知平板菌落计数技术法是测定水样中细菌总数比较方便的方法，但它存在一定的缺陷，比如在数菌落时，菌落太小且又处于培养基内部，这样就不能准确地观察到菌落，从而影响实验结果；又如在培养过程中由于细菌之间的相互抑制也会使菌落计数的结果减少^【10】。因此，只有我们在不需要精确的情况下才可使用此方法。

本实验的成败在于灭菌、无菌操作技术、培养基的温度等方面是否操作正确，所以，今后要更加注意其方法及原理。

参考文献

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[2] 李根生 《干燥培养基恩德制造及应用》上海：上海科学技术文献出版社，1994

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[4] 郝士海 《现代细菌学培养基和生化试验手册》北京：中国科学技术出版社，1992

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[6] 顾孔珍 钱纯 罗岳平.用R2A Agar培养基提高饮用水中细菌总数的检出率[J].净水技术，2004，23（1）：42-43

[7] 张清敏，李洪远，王兰. 环境生物学实验技术，2005

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[10] 张秀绘，苏筱军，李庆平，等．生活饮用水细菌学指标的影响因素．环境与健康杂志，2006，23：152—153

［11］ 罗雪云等 《食品卫生微生物检验标准手册》 北京：中国标准出版社，1995

第二篇：食品和水样中的细菌总数及大肠菌群的检测

食品和水样中的细菌总数及大肠菌群的检测

（一)实验目的

(1)了解和学习食品和水样中细菌总数和大肠菌群的测定原理和测定意义。

(2)学习和掌握食品中菌落总数检测方法和用稀释平板计数法测定水中细菌总数的方法。

(3)学习和掌握食品和水样中大肠菌群的检测方法。

（二)实验原理

食品的微生物学指标主要包括菌落总数、大肠菌群和致病菌等三个项目。其中菌落总数和大肠菌群是最重要、最常检的检验项目。

检测食品中的菌落总数，可以了解食品在生产中，从原料加工到成品包装受外界污染的情况．从而反映食品的卫生质量。一般来说、菌落总数越多，说明食品的卫生质量越差，遭受病原菌污染的可能性越大。而菌落总数仅少量存在时，病原菌污染的可能性就会降低或者几乎不存在。但上述规则也有例外，有些食品成品的菌落总数并不高，但由于已有细菌繁殖并已产生了毒素，且毒素性状稳定，仍存留于食品中；再有一些食品如酸泡菜和酸乳等，本身就是通过微生物的作用而制成的，且是活菌制品。因此，菌落总数的测定对评价食品的新鲜度和卫生质量有着一定的卫生指标的作用，但本能单凭此一项指标来判定食品的卫生质量，还必须配合大肠菌群和致病菌等检验，才能作出比较全面、准确的评价。

大肠菌群是水源污染的指示菌，当饮用水中检查出大肠菌群时，即证实水已被粪便污染，对人是有害的，是不卫生的。同样，食品中若有大肠菌群存在，也会影响人的健康。

水是微生物广泛分布的天然环境。各种天然水中常含有一定数量的微生物。水中微生物的主要来源有：水中的水生性微生物(如光合藻类)、来自土壤径流、降雨的外来菌群和来自下水道的污染物和人畜的排泄物等。水中的病原菌主要来源于人和动物的传染性排泄物。

水的微生物学的检验，特别是肠道细菌的检验，在保证饮水安全和控制传染病上有着重要意义，同时也是评价水质状况的重要指标。国家饮用水标准规定，饮用水中大肠菌群数每升中不超过3个，细菌总数每mL不超过100个。

所谓细菌总数是指1mL或1g检样中所含细菌菌落的总数，所用的方法是稀释平板计数法，由于计算的是平板上形成的菌落(colony-forming unit，cfu)数，故其单位应是cfu/g(mL)。它反映的是检样中活菌的数量。

所谓大肠菌群，是指在37℃24h内能发酵乳糖产酸、产气的兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌的总称，主要由肠杆菌科中四个属内的细菌组成，即埃希氏杆菌属、柠檬酸杆菌属、克雷伯氏菌属和肠杆菌属。

水的大肠菌群数是指100mL水检样内含有的大肠菌群实际数值，以大肠菌群最近似数(MPN)表示。在正常情况下，肠道中主要有大肠菌群、粪链球菌和厌氧芽胞杆菌等多种细菌。这些细菌都可随人畜排泄物进入水源，由于大肠菌群在肠道内数量最多，所以，水源中大肠菌群的数量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一项重要指标。目前，国际上已公认大肠菌群的存在是粪便污染的指标。因而对饮用水必须进行大肠菌群的检查。

水中大肠菌群的检验方法，常用多管发酵法和滤膜法。多管发酵法可运用于各种水样的检验，但操作繁琐，需要时间长。滤膜法仅适用于自来水和深井水，操作简单、快速，但不适用于杂质较多、易于阻塞滤孔的水样。

(三)实验器材

(1) 菌落总数的测定：

1)培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌生理盐水，75%乙醇。

2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管，直径为9cm的平皿，18mm x 200mm试管，1mL和10mL吸管，500mL三角瓶，500mL广口瓶，均质器或乳钵，培养箱、恒温水浴锅等。

(2)大肠菌群的测定；

1)培养基：

①乳糖胆盐蛋白胨培养基，乳糖发酵管，伊红美蓝琼脂培养基(EMB)：

蛋白胨20g，猪胆盐(或牛、羊胆盐)5g，乳糖10g，0.04%溴甲酚紫水溶液25mL，水1000mL，pH7.4。

制法：将蛋白胨、胆盐从乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，分装，每瓶50mL或每管5mL，，并倒置放入一个杜氏小管，l15℃灭菌15min。

双倍或三倍乳糖胆盐蛋白胨培养基：除水以外，其余成分加倍或取三倍用量。 ②伊红美蓝琼脂培养基：

蛋白胨10g，乳糖10g， K2HP04 2g， 2％伊红水溶液20Ml，0.65％美蓝水溶液lOmL，琼脂17g，水1000mL，pH7.1。

制法：将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶于水中，校正pH后分装．121℃灭菌15min备用。临用时加入乳糖并熔化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。 ③乳糖发酵管：

除不加胆盐外．其余同乳糖胆盐蛋白胨培养基。

2)器材：灭菌三角瓶，灭菌的具塞三角瓶，灭菌平皿，灭菌吸管，灭菌试管，灭菌发酵管，灭菌广口瓶，均质器或乳钵，培养箱，恒温水浴锅等。

3）试剂：革兰氏染色液等。

（四）实验方法

食品中：

(1)菌落总数的检测

1)检样稀释及培养：

①以无菌操作法，将检样25g(或25mL)剪碎以后，放于装有225mL无菌水的三角版(瓶内预先放适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成l：10的均匀稀释液。 固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌容器中以8000-10000r／min的速度离心1min，做成1：10的均匀稀释液。

②将上述样品进行10倍系列稀释，稀释度视食品性质和污染状况而定。

③根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择2—3个适宜稀释度，分别吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。

④迅速将熔化后保温在45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基15—20mL注入平皿，并转动平皿使混合均匀，同时将培养基倾入加有1mL空白稀释剂(即不含样品)的灭菌平皿内作空白对照。

⑤待琼脂凝固后，倒置平板，于36±1℃恒温箱内培养48±2h取出，计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得lg(1mL)样品所含菌落总数。

2)菌落计算方法和报告：

同实验一0七水中菌落总数测定方法中的菌落计数报告方式。

(2)大肠菌群的检测：

1)检验程序：

食品中大肠菌群检测程序见图l08—1所示。

2)操作步骤：

①采样及稀释：

a． 按无菌操作法将检样25g(或25mL)放于含有225mL无菌水的三角瓶中(瓶内预置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1：10的均匀稀释液。固体检样最好用无菌均质器，以8000-10000r/min的速度离心1min，做成1：10的稀释液。

b．用1mL灭菌吸管吸取1：10稀释液1Ml，注入含有9mL无菌水的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支lmL灭菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀释液。 c. 根据食品的卫生要求或对检验样品污染情况的估计，选择三个稀释度，

图1 食品中大肠菌群的检测程序

每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。

②乳糖初发酵试验：

即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。

． 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双倍乳糖胆盐发酵管；lmL及1mL以下者，用单倍乳糖胆盐发酵管。每一个稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

③分离培养：

将产气的发酵管分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板，置36±1℃温箱内培养18-24h，然后观察菌落形态并作革兰氏染色、镜检并作复发酵试验。

④乳糖复发酵试验：

即通常所说的证实试验，其目的在于证明经乳糖初发酵试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。

在上述选择性EMB培养基上，挑取可疑的大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±l℃温箱内培养24±2h，观察产气情况。

凡乳搪发酵管产气，革兰氏染色为阴性反应的无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠菌群阴性。

水样中：

(1)水样的采集：

1)自来水：先将自来水龙头用酒精灯火焰灼烧灭菌，再开放水龙头使水流5min，以灭菌三角瓶接取水样以备分析。

2)池水、河水、湖水等地面水源水：在距岸边5m处，取距水面10-15cm的深层水样，先将灭菌的具塞三角瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。如果不能在2h内检测的，需放入冰箱中保存。

(2)细菌总数的测定：

1)水样稀释及培养：

①按无菌操作法，将水样作10倍系列稀释：

⑦根据对水样污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度(饮用水如自来水、深井水等，一般选择1、1:10两种浓度；水源水如河水等，比较清洁的可选择1:10、1:100、1:1000三种稀释度；污染水—被选择1:100、1:1000、1:10000三种稀释度)，吸取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作3个重复。

③将熔化后保温度45℃的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平皿，每皿约15mL，并趁热转动平皿混合均匀。

④待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内培养24±1h后取出，计算平皿内菌落数目，乘以稀释倍数，即得1mL水样中所含的细菌菌落总数。

2)计算方法：

作平板计数时，可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数。

3)计数的报告：

①平板菌落数的选择：

选取菌落数在30-300之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个重复时，应选取两个平板的平均数。如果一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板计数作为该稀释度的菌数。若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘2以代表整个平板的菌落数。

②稀释度的选择：

a. 应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以该稀释倍数报告之(表1例1)。

b．若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30-300之间，则视二者之比如何来决定。若其比值小于2，应报告其平均数；若比值大于2，则报告其中较小的数字(l例2、例3)。

c．若所有稀释度的平均菌落均大于300，则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(l例4)。

d．若所有稀释度的平均菌落数均小于30、则应按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(1例5)。

e. 若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告之（表1例6)。 f. 若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300之间，则以最接近30或300的平均菌落数乘以该稀释倍数报告之(表l例7)。 ③细菌总数的报告：

细菌的菌落数在l00以内时，按其实有数报告；大于100时，用二位有效数字，在二位有效数字后面的数字，以四舍五入方法修约。为了缩短数字后面的0的个数，可用10的指数来表示，如表1“报告方式”一栏所示。 (3)大肠菌群的测定(多管发酵法)：

表 1 稀释度的选择及细菌数报告方式

1)生活饮用水或食品生产用水的检验：

①初步发酵试验：

在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的

发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。摇匀后，37℃培养24h。

②平板分离：

经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18—24h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。

③复发酵试验：

将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。

④报告：

根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表107-2（或表107-3），报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

2)水源水的检验：

用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。

①严重污染水：1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。

②中度污染水：10．1，0．1，0．01mL各1份。

③轻度污染水：100，10，1，0．1mL各l份。

④大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份。

表2 大肠菌群检索表（饮用水）

表3 大肠菌群数变异不大的饮用水

表4 大肠菌群检索表（严重污染水）

表5大肠菌群检索表（中度污染水）

表6大肠菌群检索表（轻度污染水）

表7 大肠菌群变异不大的水源水

操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数，查表107-4、表l07-5、表107-6或表107-7，报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。 附：滤膜法

滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。 (1)准备工作： 1)滤膜灭菌：

将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。

2)滤器灭菌：准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。 3)培养：

将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。 (2)过滤水样：

1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将祖糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。

2)水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。

(3)结果判定：

1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。

①紫红色，具有金属光泽的菌落。

②深红色，不带或略带金属光泽的菌落。

③淡红色，中心颜色较深的菌落。

2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。

3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。

生物工程07-2班

聂永生（20075839）