微生物综合实验  水中细菌总数的测定

一、实验目的

1．学习水样的采集和水样中细菌总数的测定方法。

2．了解和掌握平板菌落计数的原则。

3．复习、巩固微生物实验的各单元操作。

二、实验原理

水中细菌总数的测定是进行水质检验的必要项目之一，主要作为判定饮用水、水源水、地表水等被污染程度的标志。

本试验采用平板菌落计数技术来测定水中的细菌总数。该法是根据在固体培养基上所形成的菌落来进行计数。菌落总数是指在一定条件下，1 mL水样所生长出来的细菌菌落的总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其它生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基和在一种条件下，使水中的所有细菌均能生长繁殖，因此，这种方法所得到的结果只是一种近似值。目前一般采用营养琼脂培养基，在需氧条件下，37℃培养36-48 h，所得到的细菌绝大部分是腐生性的嗜中温性需氧菌和兼性厌氧菌。

三、实验材料

1．检样：矿泉水等饮用水、河水、湖水、井水等。

2．培养基：营养琼脂培养基（附录Ⅱ-1.3）

3．仪器与其它用具：三角烧瓶，广口瓶，吸管，培养皿，试管，培养箱等。

四、实验步骤

1. 水样的采集与处理

⑴ 饮用水：采样前，先用酒精棉球擦拭瓶口灭菌，以灭菌移液管或移液枪取水样。

    ⑵ 河水、湖水、池水：应取距水面10 cm~15 cm的深层水样。先将已灭菌的带玻璃塞的广口瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来使瓶口向上，拔去瓶塞，待水盛满后，将瓶塞盖好，再将瓶子从水中取出。在一定深度采水样时，需要用特制的采水器（图14-14）。采水器是一金属框，内装玻璃瓶，其底部装有重沉坠，可按需要坠入一定深度。瓶盖上系有一绳索，拉吊绳索即可打开瓶盖，待水样瓶中水盛满后，放松绳索，即自行盖上瓶盖。水样采集后，将水样瓶取出，并立即用无菌棉塞或灭菌胶塞塞好瓶口，以备检验。

   水样采集后应立即检验，如需要保存或运送，应采取冰镇措施，但一般要求不得超过4 h。

 

图14-14  采水器

1-开瓶绳索  2-铁框  3-瓶盖  4-水样瓶  5-沉坠

2. 细菌总数的测定

⑴ 饮用水：

① 用灭菌吸管吸取0.2 mL水样，涂布于事先准备好平板中，共做2个平皿。

② 另取一空的灭菌培养皿，倾注15 mL~20 mL牛肉膏蛋白胨培养基，作为空白对照。

③ 将平皿倒置于37℃培养箱内，培养24 h，进行菌落计数。

⑵ 河水、湖水、池水等：

① 稀释水样：取3支装有4.5 mL无菌水的试管。取0.5mL水样注入到第一支装有4.5毫升无菌水的试管内，摇匀，再自第一管取上述稀释液0.5 mL，加入到第二支管内，如此稀释到第三管，分别制成稀释度为10^-1、10^-2、10^-3的均匀稀释液。稀释倍数视水样污染程度而定，一般中度污染水样，取10^-1、10^-2、10^-3三个连续稀释度，严重污染水样取10^-2、10^-3、10^-4三个连续稀释度。

② 自最后三个稀释度的试管中各取0.2 mL稀释水，涂布于事先准备好平板中，共做2个平皿。

③待琼脂凝固后，将平皿倒置于37℃培养箱内，培养24 h，进行菌落计数。

3. 菌落计数方法：参见微生物学实验平板菌落计数部分。

五、实验结果（要求每组除自来水之外，还要选两种水源检测，共计三种）

将实验数据填入下表，并报告所检测水样的细菌总数。

1. 自来水

2. 河水、湖水或池水等

3、对得到的菌落进行简单染色和革兰氏染色观察，画出菌体的形态图，说明革兰氏染色的结果。

水中细菌总数的测定

实验材料与设备：

1、  试剂：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、氢氧化钠、硫代硫酸钠、结晶紫、革兰氏染色所需的试剂。

2、  器皿：500ml和250ml三角瓶、培养皿、试管、5ml和1ml移液器（吸头）、pH试纸（5-9）、载玻片、纱布、牛皮纸、棉绳。

3、设备：灭菌锅、培养箱、摇床、超净台、显微镜、电子天平、烘箱。

n  综合实验报告写作格式：

题目

作者（小组全部成员，自己为第一作者）

前言

材料方法

实验结果

结论

参考文献

贡献率（％）：

第二篇：实验五 水中细菌总数的测定

实验五   水中细菌总数的测定

实验目的

l.学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。

2.了解水源水的平板菌落计数的原则。

基本原理
    本实验应用平板菌落计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
实验器材
    l.培养基   肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水。
    2.仪器或其他用具   灭菌三角烧瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管等。
操作步骤
    l.自来水水样的采取：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。
    2.自来水细菌总数测定
①用灭菌吸管吸取lml水样，注入灭菌培养皿中。共做两个平皿。
②分别倾注约15mL己溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
③另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL作空自对照。
④培养基凝固后，倒置于37℃ 温箱中，培养24h，进行菌落计数。
⑤两个平板的平均菌落数即为lml水样的细菌总数。

实验报告
1.自来水

2.思考题：从自来水的细菌总数结果来看，是否合乎饮用水的标准？

实验六   酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别

目的要求

1、观察酵母菌的形态及出芽方式，学会区分酵母菌死活细胞的实验方法。

2、掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

实验原理

酵母菌是不运动的单细胞真核型微生物，其大小通常比细菌大。大多数酵母菌以出芽的方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。本实验通过美蓝染液水浸片来观察酵母菌的形态和出芽生殖方式。

美蓝是一种无毒性的燃料，它的氧化型呈蓝色，还原型呈无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此可对酵母菌的死活细胞进行鉴别。

实验器材

1、菌种 酿酒酵母培养约2d的麦芽汁（或豆芽汁）斜面培养物。

2、溶液或试剂 0.1％碱性美兰蓝染色液。

3、仪器及其它用具  显微镜、载玻片、盖玻片等。

操作步骤

1、在载玻片中央加一滴0.1％碱性美兰蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌苔放载染液中，混合均匀。

染液不宜过多或过少，否则在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡而影响观察。

2、用镊子取一块盖玻片，先将一端与菌液接触，然后慢慢把盖玻片放下使其盖在菌液上。

盖玻片不宜平着放下，以免产生气泡影响观察。

3、将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母菌的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞。

4、染色约半个小时后再次进行观察，注意死细胞数量是否增加。

实验报告

1、结果

绘图说明所观察到的酵母菌的形态特征。怎样鉴别死活细胞？分析出现这种结果的原因？

2、思考题

比较酵母菌和细菌的形态、构造和繁殖方式？