质粒DNA 的提取与纯化

实验目的：

1掌握碱变性法提取质粒DNA的原理和各种试剂的作用及方法。 2学习并掌握凝胶电泳法进行DNA的分离纯化的实验原理及方法。 3学习并掌握凝胶的制备及电泳方法。

实验原理：

简明原理：碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB一氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取的质粒DNA纯度高，可直接用于酶序列测定及分析。 碱变性提取质粒DNA一般包括三个基本步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。

在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA和质粒DNA均被释放出来，

但是两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在PH高达12.0的碱性溶液中，染色体DNA烦人氢键断裂双螺旋结构解开而变性，共价闭环状质粒DNA的大部分氢键断裂而变性，但两条互补链不完全分开。当用PH为4.6的KAc高盐溶液调节PH至中性时，变性的质粒DNA可发生复性恢复共价闭环的超螺旋结构而溶于溶液中，而染色体DNA不能复性，与不稳定大分子缠连在一起形成沉淀，通过离心与溶于溶液中的质粒DNA分离。

溶于上清液中的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液使之凝聚成沉淀。由于RNA与DNA 性质相似，乙醇沉淀DNA时也伴随着RNA的沉淀，可用RNA酶降解。质粒DNA 溶液中的RNase以及一些可溶蛋白可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA。

含有电解液的凝胶在电场中，其中的电离子会发生移动，移动速度可因电离子的大小，形态，电荷量的不同而有所差异。利用移动速度差异，就可以区别各种大小不同的分子。因此可用凝胶电泳法分离，鉴定和纯化DNA片段。凝胶电泳技术操作简单而迅速，分辨率高，分辨范围极广。凝胶中DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料如溴化乙锭（EB）染色直接观察到，甚至含量少至20 Pg的双链DNA在紫外激发下也能直接检测到。需要的话，这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种各样目的的实验。

琼脂糖凝胶电泳易于操作，适用于核酸电泳，测定DNA的相对分子质量，分离经限制酶水解的DNA片段，进一步纯化DNA等。琼脂糖凝胶

电泳是一种常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而带负电荷，在电场中向正极移动。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳迁移速率主要取决于下面6个因素：

（1）样品DNA分子的大小 （2）缓冲液 , （3）温度

（4）DNA分子的构象：一般情况下，超螺旋型迁移速度最快，其次为线状分子，最慢的是开环状分子。

（5）琼脂糖浓度：通常凝胶浓度越低，则凝胶孔径越大，DNA电泳迁移速度越快，因此，相对分子质量越大，选用的凝胶浓度应越低。

（6）电泳所用电场：凝胶电泳分离DNA的有效范围随着电压上升而减少。为了获得DNA片段的最佳分离效果，电场强度应小于5 V／cm。

实验准备

实验仪器与材料：

恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml离心管，50ml离心管，不同型号的吸头，微量移液器，微波炉，电泳仪，制胶槽，梳子，锥形瓶，离心机。

菌体：E.coliDH5a受体菌，具有Amp r标记的质粒DNA pUC19.

实验试剂及其理化作用：

LB培养液，抗生素

溶液Ⅰ（ 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl，pH=8.0）：葡萄糖增稠，使悬浮后 的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA是阳离子

螯合剂，抑制DNase的活性。

溶液Ⅱ （0.2M NaOH / 1% SDS）：使细胞破裂，使质粒DNA与染色体DNA同时变性。 溶液Ⅲ （3M 醋酸钾 / 2M 醋酸）：这一步的K置换了SDS（十二烷基磺酸钠）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸钾）沉淀；SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质也沉淀了，同时基因组DNA也被PDS共沉淀。加醋酸中和使溶液呈中性，使变性的质粒DNA复性，但不能使染色体DNA复性。

RNase酶母液 ，TE缓冲液 （10mM Tris-HCl(pH 8.0)，1mM EDTA(pH 8.0)），饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，

苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。

遇冷无水乙醇，70%乙醇，TAE电泳缓冲液，上样缓冲液（6×），琼脂糖，溴化乙锭(EB)，DNA相对分子质量标准物DNA Marker, 醋酸钠。

实验步骤

1、质粒的提取

EcoliDH5α （PUC19）→LB+AP平板划线→37℃，16-18hr→单菌落→LB+AP(80ml)→37℃,O/N→LB+AP(80ml)→37℃，4-6hr→称管重W1,约30ml

菌液→10000rpm,1min→去上清，加5mlⅠ,涡旋→10000rpm,1min→去上

清，吸干净→称重W2→2mlⅠ,涡旋，冰浴5min→4mlⅡ,颠倒摇匀，冰浴

5min→3mlⅢ,缓慢摇匀，冰浴5min→12000rpm,10min→转上清至新管→2V冰乙醇，匀，-20℃，>30min→12000rpm,15min→去上清→2ml70%乙醇清洗→10000rpm,1min→去上清→70%乙醇清洗→10000rpm,1min→去上清→37℃,5-10min→1mlTE溶液→2μlRNase(50μg/μl),37℃,

2、纯化及电泳

两份完全一样的500μl粗提物→加等体积酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V1）→加等体积（V1）酚、氯仿、异戊

醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V2）→加等体积（V2）酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）→12000rpm,5min→转上清至新管（V3）→加1/10V33MNaAc+2V冰乙醇→取沉淀→-20℃,30-60min→12000rpm,15min

→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→弃上清→500μl70%乙醇→12000rpm,5min→吸净上清→37℃,5-10min→两管25μlTE溶液→50μl/组→得纯化质粒DNA。

40ml×TAE→300ml锥形瓶→称0.4g琼脂糖→微波炉沸腾3次→50-60℃→倒板成型

取3μlDNA+1-2μl 6×loading Buffer→混匀→点样→100V，电泳，40min→EB染色10min→水洗10min→紫外成像→分析

注意事项：

1， 提取过程应尽量保持低温。

注意离心机的使用，离心管要配平，以防错误操作损坏离心机。离心结束后，将离心管从离心机中取出时应保持其倾斜状态，防止沉淀重新进入上

清液中。

2，溶液2要现用现配，以保证NaOH没有吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。

3，溶液2处理即变性时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片段会慢慢断裂。

4，加上溶液2之后混匀动作要轻柔,既保证细菌沉淀在试剂中充分扩散又要避免机械剪切已变性的质粒DNA和染色体基因组DNA。

5，沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。时间不宜太长(限20 min内)。沉淀离心后，需用70％乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。

6，酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。

7，应避免琼脂糖溶液在微波炉里加热时间过长，否则溶液将会暴沸蒸发，

影响琼脂糖浓度。

8，制胶时要除去气泡。

9，拔梳子时要特小心，以防凝胶与支持物脱离。

10，上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。

11，溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有EB的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲

洗干净。

实验现象及结果分析

1，W1=12.716g, W2=12.876g,菌重W2-W1=0.160g。

2，加入溶液Ⅰ后，将离心管盖好后放于旋涡振荡器上振荡，无白色菌体块状物悬浮在液体中，即已振荡均匀。

3，加入溶液Ⅱ时，要逐滴缓慢加入，边加边轻轻摇动离心管，可观察到离心管中液体呈粘稠的蛋清状无白色菌体块存在。溶液Ⅱ为强碱性溶液，可以使细胞破裂，质粒DNA 和染色体DNA变性。

4，加入溶液Ⅲ并离心后出现白色絮状沉淀。因为溶液Ⅲ为高盐溶液，调节碱性溶液至中性，使变性的质粒DNA可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA不能复性，而是与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成白色絮状沉淀。

5，用饱和酚氯仿抽提是试管底出现大量白色沉淀。

6，加入无水乙醇离心后离心管底出现少量的沉淀。加入ET溶液后管底沉淀物溶解。

我们组的电泳条带

图1 质粒DNA 电泳条带

1，从胶的左边开始，各条带分别是：（1）DNA marker，DL-5000（2—13）各组提取的质粒 DNA条带，（14）PUC19 ，(15)λ DNA

2，箭头所标记的是我们组的电泳条带。从上到下依次是：蛋白质，染色体DNA杂带，开环质粒DNA带，线形质粒DNA带，超螺旋质粒DNA带（主带），RNA带。

3，用我们组实验所得的电泳条带与第14条带，即标准的PUC19带型和DNA marker比较可以看出，我们提取到超螺旋质粒DNA条带清晰含量较多。开环质粒DNA和线性质粒DNA的电泳条带不清晰，因此样品中含有少量染色体DNA及线形和环状DNA. 蛋白质带较浅,说明大部分蛋白质杂质已被抽提掉。RNA条带较浅，说明RNA 含量并不多，大部分RNA被RNase降解除去。

我们组本次实验中所提取的质粒DNA，与100ng/ul的纯p UC19质粒相比较,含量大约有200—300ng/ul。蛋白质,DNA杂带，RNA等杂志相对较少。

说明我们虽然在提取过程中存在一些失误，在去上清过程中没有用移液器吸出而是直接倒掉留下了较多的杂志，使得粗提取的质粒DNA中含有较多的蛋白质杂质，但是经过纯化过程已经把大部分的蛋白质杂质抽提掉除去。

实验原理：

从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可利用分子大小不同，碱基组成的差异以及质粒DNA的超螺旋共价闭合环状结构的特点来进行。碱基性法抽提效果良好，既经济且得率较高。抽提到的质量DNA可用于酶切、连接和转化。对于分子量较大拷贝较少对的质粒DNA，由于DNA片段较大易于损伤断裂，因此选用吕华铯密度超高离心法抽提DNA，且具有纯度高、步骤少、方法稳定且获得的质量DNA是超螺旋构型等特点。对于高拷贝数质粒，用少量制备法抽提质粒DNA就有足够量可用于基因操作。

碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在PH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以PH4.8的NaAc高盐缓冲液去调节其PH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，

而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质—SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。本实验就是利用碱变性抽提大肠杆菌中的质粒。

loading buffer 的中文名字叫上样缓冲液,6*的缓冲液中可以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是 300bp，后面的有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右。

loading buffer的功能主要有两个。第一，里边的指示剂溴酚蓝和二甲苯酚起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，里边的成分甘油可以加大样品密度，使样品密度大于TAE，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都会写明。SDS主要是促使聚合酶变性，因为没有除尽的聚合酶会结合在DNA双链上影响它的迁移速率。细胞裂解后的裂解液，加loading 100℃加热，也是为了中止酶促反应，防止提取的蛋白质降解。 6×loading buffer 一般配置：

6×Loading buffer:

30mM EDTA

36%(v/v) Glycerol （甘油）

0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF （二甲苯青FF)

0.05%(w/v) Bromophenol BLUE (溴酚蓝)

第二篇：实验十一 细菌质粒DNA的提取和纯化

实验十一  细菌质粒DNA的提取和纯化

一、实验目的：

通过细菌质粒DNA的提取，掌握共价闭合环状DNA的提取方法。

二、实验原理：

1、细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。

2、质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法、煮沸法和去污剂（如Triton和SDS）裂解法。

3、碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。

当菌体在NaOH和 SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在实验室中常用。

三、实验材料：

含有PMD19质粒的大肠杆菌（E. coli.）菌液

四、实验用具和药品：

实验用具：摇床、离心机、移液器及枪头、玻璃试管（15mL）及塞子、离心管（1.5mL）。

实验药品：

五、实验步骤：

（一）细菌繁殖

第1天晚上： 吸取含质粒的菌液2μL，转移入2mL LB（加入相应抗生素），37℃，过夜振荡（200r/min）培养。

（二）菌体收集

第2天早晨(时间:约2-3h左右)： 1、将过夜培养的菌体转入1.5mL离心管，5000r/min离心30sec；2、弃上清

（三）碱裂解法提取质粒DNA

1、将上述沉淀重悬于100μL冰预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡（须使沉淀完全分散） (葡萄糖：悬浮细胞；EDTA；抑制DNAase)

2、加入200μL溶液Ⅱ，盖紧管口，轻柔颠倒离心管5_~10次，该过程应小于5min；（NaOH：溶解细胞膜，释放DNA；SDS）                

3、加入150μL冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，温和地颠倒离心管5_~10次，该过程大于5min；（乙酸钾 ：和SDS 反应生成PDS（十二烷基硫酸钾），沉淀蛋白，同时体积较大的染色体DNA也一起沉淀；冰乙酸 ：中和NaOH ）

4、10000r/min离心5min；

5、上清转移到另一新1.5mL离心管中；

6、加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温放置2min（若沉淀不充分，可加入1/10体积3mol/L的醋酸钠）；

7、10000r/min离心5min；

9、弃上清，干燥沉淀；

9、加TE溶解沉淀，保存。

六、实验作业：

思考本实验的关键步骤是什么？

答：本实验的关键是溶液Ⅰ重悬须充分，溶液Ⅲ混合须温和。碱裂解法的关键是如何把握SDS-NaOH处理的时间。质粒制备过程中，如果质粒长时间暴露于NaOH, 质粒有可能不可逆变性，使得抽提质粒中有部分是变性质粒。这些变性质粒，不能酶切。所有一般情况下，SDS-KOH处理时间不能超过5分钟，最好在冰里处理，观察到液体变得清就可以加入中和液。

七、注意事项：

1、质粒的选取，尽量选择较小的松弛型质粒。

2、提取过程应尽量保持低温。

3、溶液II不可冷冻,现用现配，加入溶液2后不要剧烈振荡，只需轻轻颠倒几次离心管。复性时间不宜过长，一般是5分钟，否则会使染色体复性。

4、沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。

5、应用TE缓冲液溶解沉淀是为了在用苯酚、氯仿抽提时，以减少DNA的损失。

6、50%的乙醇可溶解DNA,故应该极其注意70%的乙醇是否盖子完好,否则稀释的乙醇有可能将所获得DNA溶解掉。

八、讨论与小结：

1.为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

2.在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？

在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

本次实验是能动性、严谨性很强的实验，因此通过这次实验，我们能把理论和实践更好的联系在一起，将将理论应用到实践，提高了自己的实验能力，同时也加深理论的理解。

要成功完成实验，必须理论知识丰富，全面了解可能导致实验失败的因素，在试验中特别注意。时刻规范操作，否则容易导致实验失败。