实验、质粒DNA提取

一、实验目的

学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。

二、实验原理

在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA（Open circular DNA，简称ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA（Linear DNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

三、主要试剂

1． 溶液Ⅰ

50 mmol/L 葡萄糖

5 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris.HCl（pH 8.0）

10 mmol/L 乙二胺四乙酸Na（EDTA）（pH 8.0）

[0.5 M EDTA：93.05g EDTA.Na2，8g NaOH，充分溶解后调pH值至 1

8.0] （灭菌）。

[1M Tris-HCl（1000 mL）：121.1g Tris，49 mL浓HCl，充分溶解后调pH值至8.0]（灭菌）

2． 溶液 Ⅱ

0.4 mol/L NaOH， 2% SDS，用前等体积混合（新鲜配制）

3． 溶液 Ⅲ

5 mol/L 乙酸钾 60 mL

冰乙酸 11.5 mL

水 28.5 mL

4. TE 缓冲液

10 mmol/L Tris.HCl

1 mmol/L EDTA（pH 8.0）

5. 70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

6. RNase

将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl（pH7.5）、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/mL的浓度，于100℃加热15 min，缓慢冷却至室温，保存于－20℃。

7. LB+Amp100培养基：LB液体培养基内加入100 μg/mL的氨苄青霉素。

注意Amp遇高温分解，待培养基温度低于60℃时加入。

四、仪器耗材

恒温摇床、冷冻离心机、移液枪一套、制冰机、三角瓶、Eppendorf管、试管、培养皿、试剂瓶、超净工作台。

五、实验步骤

（一） 细菌的培养

将含有pUC19质粒的大肠杆菌，在LB+Amp100培养基平皿上划线，获得单菌落（37℃培养过夜）。

（二） 质粒提取

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1. 将2 mL含Amp（100 μg/mL）的LB液体培养基加入试管中，接入上述的含pUC19质粒的大肠杆菌（单菌落），37℃振荡培养过夜。

2. 取培养物倒入1.5 mL微量离心管中，4000 r/min 离心2 min。

3. 倒出培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4. 将细菌沉淀悬浮于100 μL溶液Ⅰ中，充分振荡混匀，室温放置5 min。

5. 加200 μL溶液 Ⅱ（新鲜配制），盖紧管口，颠倒混匀内容物，将离心管放冰上5 min。

6. 加入150 μL溶液 Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置5 min。

7. 12000 r/min，离心15 min，将上清转至另一离心管中。

8. 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24：1）（去蛋白），反复混匀，10000 r/min，离心10 min，将上清转移到另一离心管中。

9. 向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置15-20 min。12000 r/min离心10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10. 用500 μL 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

11. 加入适量（30 μL）的TE其中含有20 μg/mL的RNA酶，使DNA完全溶解，－20℃保存。

六、思考题

影响本实验结果的因素有哪些？

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第二篇：质粒DNA的转化及提取

[材料]

1. LB液体培养基的配制:

胰蛋白胨(bacto-tryptone): 10.0 g

酵母提取物(bacto-extract): 5.0 g

NaCl: 10.0 g

加蒸馏水至1000 ml, pH 7.0, 高压灭菌。

2. 铺板培养基的配制：

取200 ml LB培养基，加Agar A 3 g （1.5%）， 氨苄青霉素（100 μg/ml），于锥形瓶中，此时液体为浑浊状。高压灭菌后，液体变清亮。在液体降温但凝固之前，倒入培养皿中，铺满皿底即可。待培养基冷却凝固后，用封口膜将培养皿封住。

3. PⅠ液:

Glucose 2252g

Tris·Cl(PH 8.0) 1M 6.25ml

EDTA 0.5M 5ml

250ml容量瓶定容高压。

4. PⅡ液：

NaOH 10M 5ml

SDS 10% 25ml

250ml容量瓶定容。

5. PⅢ液：

6M KAc 50ml×2

冰乙酸 11.5ml×2

三蒸水 38.5ml×2

200ml 高压。

6. PⅣ液：

无水乙醇 500ml

0.5M EDTA 20ml

1M Tris·Cl 50ml

5M NaCl 4ml

1000ml定容分两瓶。

7. 树脂：10mg/ml (终浓度)

母液：200mg/ml

应用液： 20g 异硫氰酸胍

2.5ml树脂母液

定容至50ml,使用前混匀。

[质粒DNA的转化]

1. 将滤纸上的质粒 ( pRNA-U6.1/neo) 沿所画圆圈剪下,共8 μg，剪1/4，即为2 μg。 取一1.5 ml EP管，加入无菌高压蒸馏水50 μl， 将剪好的滤纸浸泡入蒸馏水中。

2. EP管放入金属浴， 55℃×10 min，取出后10000 rpm×1 min， 取上清2 μ（约l 80 ng）。

3. 取解冻后的感受态细菌DH5a 100 μl， 加质粒2 μl（约 80 ng），加质粒时轻柔吹打2-3次即可，然后轻轻旋转，冰上静置30 min。

4. 42℃ 热休克 60 s， 冰上静置5 min， 加入800 μl LB液体培养基（不含氨苄青霉素）， 37℃摇床180rpm×45 min， 然后4000 rpm×3 min, 弃约600~700μl上清，留200 μl。

5. 将留下的200 μl菌液吹打混匀，打到铺有固体培养基（含氨苄青霉素）培养皿上，然后用玻璃铺菌器将菌液均匀地铺满整个平皿。常温下正置30 min后，倒置放入37℃孵箱过夜。

[摇菌]

1. 37℃孵箱过夜后，观察细菌生长情况。选择单克隆菌落。

2. 取10 ml高压灭菌玻璃管，加入5 ml LB液体培养基，氨苄青霉素5 μl （终浓度为100 μg/μl）。

3. 用白枪头轻轻挑取单克隆菌落，打入液体培养基中。

4. 37℃摇菌，180rpm，不超过16小时。

[质粒DNA小量快速制备]

1. 1.5 ml细菌培养液快速离心收细胞， 5000 rpm×5 min，弃尽上清。

2. 加入200 μl PⅠ液（含RNAase），重新悬浮细菌沉淀（轻轻吹打）。

3. 缓慢加入200 μl PⅡ液，立即温和颠倒混匀液体，室温放置不超过5 min。 4. 缓慢加入 200 μl PⅢ液，立即充分颠倒混匀液体，冰浴10 min。

5. 4℃离心，15000 rpm×10 min，取上清于另一新Ep管中（尽量多吸）。

6. 加入1 ml树脂应用液，充分混匀后室温放置2-5 min。（树脂可以和DNA结合） 7. 15000 rpm×2 min，离心后弃上清。

8. 加入1 ml PⅣ液，弹起沉淀，10000 rpm×1 min，离心后弃上清。

9. 重复步骤8，再洗一次。

10. 加入0.5 ml丙酮洗一次，10000 rpm×1 min离心后弃上清，65℃干燥。

11. 加入ddH2O或TE 80 μl， 置65℃ 5 min。

12. 15000 rpm×5 min离心。

13. 取上清于新的Ep管中，即为纯化的质粒DNA。

存放位置：20080628

1. 质粒转化前，从滤纸上溶入蒸馏水中，没有用完，不足20 μl，存放在-80℃(一般保存 <6 个月)：GL-39

2. 摇菌后，有部分菌液没有用完可以冻存（菌：甘油（v/v）= 9：1），存放位置：罐1，杆6，3层，B1，B2，B3

3. 最后提取的质粒，存放在-80℃：GL-39 （分装，20 μl/tube ）

Con： 1. 147 ng/μl

2. 262 ng/μl

3. 3μl 76 ng/μl

4.20xx年6月29日所留菌液共六管，标记为：冻存管盖标有P1，P2，P3，P4，P5，P6，管壁上写有质粒转化菌1-6及日期2008.6.29。