九龙江水大肠杆菌

群的测定

林淑丽

（漳州师范学院10级生物系食品科学与工程     101304116）

摘要：本文通过多管发酵法、革兰氏染色法两种不同的方法测定九龙江水大肠杆菌群数量。初步掌握多管发酵法及革兰氏染色法。了解大肠杆菌在饮水中的重要性和革兰氏染色原理在细菌分类鉴定的重要性。

关键词：多管发酵法    大肠杆菌     九龙江水   革兰氏阴性   无芽孢杆菌

THE DETERMINATION OF COLIFORM BACTERIA WHICH IN THE JIULONG RIVER

Lin  Shuli

(10Food science and engineering in Biology department, Zhangzhou Normal University 101304116)

Abstract: this article through multiple tube fermentation and gram's staining method two different methods to determine the Kowloon river escherichia coli group of quantity. Preliminary grasp tube fermentation and gram's staining method. Understand the importance of e. coli in drinking water and gram stain principle in the importance of bacteria classification and identification.

Keywords: much tube fermentation;   E. Coli;   the water of Jiulong River;  gram-negative;     sporeless bacterium

大肠杆菌（学名：Escherichia coli，通常简写为E. coli）)是生活在温血动物（包括鸟类和哺乳动物）大肠中的重要细菌种类，对食物正常消化具有重要作用。技术上，大肠菌群被定义为一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，可利用乳糖在48小时内35℃之下产生气体的杆菌。在水净化和污水处理领域，大肠杆菌很早就被选作水污染程度的指示性物种，标志着有多少人类粪便存在于水中，其测量标准为大肠菌群指数。故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。大肠杆菌也常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。

1    材料与方法

1.1       试验菌株培养与培养基的制备

1.1.1    试验菌株

         大肠杆菌

1.1.2          培养基的配制与培养条件

  本实验所用培养基采用乳糖胆盐蛋白胨培养基和伊红美蓝琼脂培基， 培养温度：37℃ ，培养时间：1-- 2天，常压空气下培养。

1.2                    操作步骤

1.2．1     多管发酵       

1. 水样的采集：

   用高温灭菌过的试剂瓶到九龙江取水，将瓶子连瓶盖一起伸到10-15 厘米的深处打开瓶塞，等水满后盖上盖子后从水中取出。运送水样时应避免玻璃瓶摇动，水样溢出后又流回瓶中，从而增加污染。

2. 水样的稀释：

将灭菌的三根小试管标上1、2、3的记号，各装4.5ml的无菌。充分振荡水样，从中吸取0.5ml于1号试管中，，充分振荡既得1：10的稀释液。同理配置2,3号试管1：100，1：1000的稀释液。

3.  水源水的检查

  (1) 初步发酵试验:有50ml三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵瓶中，加入50ml水样（轻度污染水的测定);在1支含有5ml三倍浓缩乳糖蛋白胨的大发酵管中，加入10ml水样（轻、中度污染水的测定各一支）。

  (2) 从原水样、1：10，1：100，1：1000的稀释液各吸取1ml于四支经过灭菌的

     装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨中。（每吸取一次，吸头都要换一次）

 (3) 将上述溶液混匀后，于36摄氏度培养24h，24h未产气的继续培养至48h。记 

      录其稀释液的产气管数（如图表一），进行复发酵试验。

 (4)  平板分离:经24h 培养后，将产酸产气及48h 产酸产气的发酵管（瓶），分别划线接种于 伊红美蓝琼脂平板上，再于37℃下培养18-24h,将符合下列特征的菌落的一小部分，进行涂片，革兰氏染色，镜检。

 （5）复发酵试验: 经涂片、染色、镜检，如为革兰氏阳性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖胆盐蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37℃培养24h，结果若产酸又产气，即证实有大肠菌群存在。证实有大肠菌群存在后，再根据初发酵试验的阳性管（瓶）数查表，即得大肠菌群数。

 1.2．2  革兰氏染色

  

1. 制片

（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中间加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，制成很薄的涂面，注意取菌不要太多。

（2）晾干：让涂片在酒精灯火焰上方文火烘干。

（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）

注意：

①要用活跃生产期的幼培养物做革兰氏染色；

②涂片用的载玻片要洁净无油污迹，否则影响涂片。

③挑菌量应少些，涂片宜薄，过厚重叠的菌体则不易观察清楚。

2. 初染

（1）结晶紫色染色：将玻片置于干净的培养皿上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1-2分钟。

（2）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。

3. 媒染

（1）用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1分钟。

（2）水洗：用水洗去碘液。

4.脱色

用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。

革兰氏染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰氏阳性细菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性细菌。而脱色时间过短，革兰氏阴性细菌则会被误认为是革兰氏阳性细菌。脱色时间的长短还受涂片的厚薄、脱色时玻片晃动的程度等因素的影响。脱色时间一般约20-30s。

5. 复染

（1）用番红复染约2分钟。

（2）水洗：用水洗去涂片上的番红染色液。

（3）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。

6．镜检

镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的是革兰氏阴性菌。

2   结果与分析

 

2.1  稀释液产气管数 （表一)

2.2 大肠菌群检数

表1：大肠菌群检数表(严重污染水)

据大肠菌群检数表可知：每升水样中大肠杆菌群数为23000，故得九龙江水属于严重污染水。

2.2油镜下观察到的菌体

 

在显微镜下观察到的大肠杆菌的形态——杆形，红色。

3总结与讨论

（1） 通过这次实验，我们学习了测定水源大肠杆菌的数量的两种方法，多管发酵法和革 兰氏染色法。并且初步掌握了其原理及操作方法。

（2） 在多管发酵的初发酵中水样接种于发酵管内，24h 内小套管中有气泡形成，并且培养基浑浊，颜色改变，说明水中存在大肠杆菌，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果，在量少的情况下，也可能延迟48h 后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做平板发酵和复发酵试验，才能确定是否是大肠菌群。48h 后仍不产气的为阴性结果。

（3） 革兰氏染色操作包括涂片，固定，初染，媒染，脱色，复染。实验过程中，我们进行革兰氏染色时，染色涂片太厚。因此我们总结出在涂时注意取适量的菌体；

（4） 实验过程中，我们进行革兰氏染色时，大肠杆菌体有点小，可能原因：1.平板培养时菌体过多菌体生长缓慢。2.涂片太厚，菌体互相重叠。制片时温度过高使得菌体轻度脱水收缩。

第二篇：大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选

1.前言

抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有 DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。

在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。

紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。

因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。

2.材料和方法

2.1实验材料、仪器和试剂

菌种：大肠杆菌

仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器

试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水

2.2实验方法

2.2.1制备培养基

普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：

牛肉膏5g    蛋白胨10g   Nacl 5g   琼脂20g      蒸馏水1000ml    Ph7.0

按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃  15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml

筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。）

牛肉膏5g     蛋白胨10g    Nacl 5g   琼脂20g  蒸馏水1000ml  Ph7.0  硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）0.2ml，按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃  15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素0.2ml加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml

2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL）

①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。

②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌体散开，得到菌悬液。

③菌悬液浓度用血球计数板计数

使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。将菌液滴在血球计数板0．1ml 的计数格中，细菌被固定染色后，在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，（一般数125个小格），根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌的数量。

血球计数板规格：

计数格=4*4=16大格

1大格=5*5=25小格

小格体积=0.05*0.05*0.1=0.00025mm3=2.5*10-7ml(长*宽*高)

计算方法例如：125格中90个细菌，则（90÷125）÷（2.5*10-7）个/ml=2.88*106

所以，125格中的细菌大约在31(4格1个菌)—3125（每个小格25个菌）个。

2.2.3诱变处理及接种

①     将紫外灯打开，预热30min；

②     取无菌培养皿（Φ90mm，含无菌大针），加入稀释好的菌悬液8ml以覆盖培养皿底面为宜。

③     将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌1分钟，然后打开皿盖，分别处理10s、20s、40s、80s、160s（可以累积照射），照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；

④     每个照射剂量分别取0.5ml分别稀释1000倍和100倍，然后取稀释液0.1ml做普通培养基的涂布培养，每个处理两个重复；同时每个照射剂量取0.1ml照射液直接做两个筛选培养基的涂布培养。

⑤     对照涂布培养：将照射的菌液稀释1000倍，在稀释液中取0.1ml做2个普通培养基涂布培养，2个筛选培养基的涂布培养。涂布要均匀，培养基表面无液流。

⑥     37℃培养24h后，计数，统计分析。对于筛选的抗性菌种进行验证、纯化。

2.2.4.结果计数、分析、统计及讨论

①以辐射时间为横坐标，以存活菌落数的lg值为纵坐标，作紫外线对大肠杆菌致死效应曲线。

②列公式计算不同辐射剂量下的致死率。

③计算并比较不同辐射剂量下大肠管杆菌的抗药突变率，并分析不同辐射剂量的诱变效果差异原因

突变率=筛选平板菌数/普通平板菌数*100%

④抗药性菌株的筛选与纯化

将一抗性克隆划线到一新的抗性平板上，与对照菌相比较，观察生长状况

3.结果与分析

3.1实验结果记录及初步整理

表1.大肠杆菌诱变初始数据

3.2最佳照射时间的设置

结合数据处理结果的图和表分析，在10s的照射下，细菌死亡率达到了95%，20s时达到了99.9%，说明在20s内大部分菌株已经死亡，而整个实验过程中未发生任何正突变，可能与此有较大关系。已经有实验证实，当菌种死亡率达到70%~80%时，突变率最大。所以在做进一步的实验中应该减少照射剂量，或通过增多10s内的照射设置，或增大照射距离，因为时间太短可能导致控制实验的难度加大。使死亡率变化曲线能突显出变化趋势。

3.3筛选培养基选择

筛选培养基是将发生突变的菌株从普通菌株中显现出来并对其浓缩。该实验中的筛选培养基中的添加剂是硫酸卡那霉素，若发生突变的菌株能对其显现出抗性，但这抗性也是有一定范围的，若超过其抗性范围即使发生突变也不能正常生长。本实验选用的50mg/L,实验证明该浓度对于该菌种抗性选育来说已经过高，应该选择较低的浓度。可以在试验前对该菌种的最低致死浓度做检测。将制备好的出发菌株溶液涂布在含不同浓度硫酸卡那霉素的平板上, 37 ℃培养24h,观察不同平板上的菌落数,并记录不同抗生素作用浓度。凡是在前一个低浓度平板上已长出菌落而在后一个较高浓度平板上未长出菌落的,后一浓度即为某种抗生素对出发菌株的最低致死浓度【1】。

表2.不同照射剂量下的存活率lg值和死亡率

4.小结与讨论

（1）本实验通过对大肠杆菌进行紫外线照射，欲得到抗性菌株，但由于照射剂量过大和抗生素浓度过高等原因未得到任何一株抗性菌株。

（2）通过本实验，得到了在28cm，下大肠杆菌的照射致死致死曲线，可以依此曲线反回归在该照射条件下选择合适的照射时间得到较高的突变率。

（3）欲得到较高的抗性突变率，还可尝试改变培养温度，有实验证实不同的温度培养会对细菌的突变率造成影响【2】。

（4）欲得到较好的突变率还需要较优质的菌株。因为菌株的突变主要是发生在遗传物质复制转录的过程中，所以菌株的生理活性对突变效率会有很大影响，最好选择在对数期的菌株。状况比较同步、易变异、重复性较好；同时为了保证处理时具有一定的细胞浓度,以增加可变异细胞总数,故选用对数期的细胞进行处理。

[1] 涂国全,刘　姝,黎循航. 通过获得链霉菌抗性基因突变株筛选梅岭霉素高产菌株[ J ]. 中国抗生素,2002, 27 (6) : 321 - 325.

[2]汪志芸  抗生素产生菌AP19-1的鉴定及UV诱变育种的研究[D],浙江：浙江大学生命科学学院，2003，29