实验三 蛋白质的颜色反应和沉淀反应

时间:2024.3.23

实验三 蛋白质的颜色反应和沉淀反应

一、目的:

1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应及其机理。

二、原理:

(一)蛋白质的颜色反应原理

蛋白质分子中的某些基团与显色剂作用,可产生特定的颜色反应,不同蛋白质所含氨基酸不完全相同,颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应,一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应,因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。

(二)蛋白质的沉淀反应原理

蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体,这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团,如—NH3+,—COO-,—SH,—CONH2等和水有高度亲和性,当蛋白质与水相遇时,就很容易被蛋白质吸住,在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开,颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因,是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷,使蛋白质颗粒之间相互排斥,保持一定距离,不致相互凝集沉淀。

蛋白质由于带有电荷和水膜,因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷,则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。

三、仪器、试剂和材料

1. 卵清蛋白液:将鸡蛋白用蒸馏水稀释20~40倍,2~3层纱布过滤,滤液冷藏备用。

2. 饱和硫酸铵溶液:称硫酸铵850g 加于1000mL 蒸馏水中,在70~80℃下搅拌促溶,室温中放置过夜,瓶底析出白色结晶,上清液即为饱和硫酸铵溶液。

3. 1%醋酸铅溶液

4. 1%硫酸铜溶液

5. 0.1%茚三酮溶液:0.1g 茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。

6. 浓硝酸:比重1.42。

7.试管及试管架、吸管、量筒、布氏漏斗。

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四、操作步骤

(一)蛋白质的沉淀反应

1.盐析作用:取1支试管加入3mL 蛋白质氯化钠溶液和3mL 饱和硫酸铵溶液,混匀,静置约10min,球蛋白则沉淀析出。过滤后向滤液中加入硫酸铵粉末,边加边用玻璃棒搅拌,直至粉末不再溶解达到饱和为止,析出的沉淀为清蛋白,再加水稀释,观察沉淀是否溶解。

2.乙醇沉淀蛋白质:取1支试管架蛋白质溶液1mL,加晶体氯化钠少许(加速沉淀并使沉淀完全)待溶解后再加入95%乙醇2mL 混匀。观察有无沉淀析出。

3.重金属盐沉淀蛋白质取:2支试管各加蛋白质溶液2mL,一管内滴加1%醋酸铅溶液,另一管内滴加1%硫酸铜溶液,观察沉淀生成。

(二)蛋白质的颜色反应

1.双缩脲反应

①取少许结晶尿素放在干燥试管中,微火加热,尿素溶化并形成双缩脲,释出的氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现,停止加热,冷却。然后加10%NaOH 溶液1mL 混匀,观察有无紫色出现。

②另取一试管,加蛋白质溶液10滴,再加10% NaOH 溶液10滴及1%CuSO4溶液4滴,混匀,观察是否出现紫玫瑰色。

注意事项:硫酸铜不能多加,否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42+,妨碍此颜色反应的观察。

2.蛋白质的黄色反应

在一试管内,加蛋白质溶液10滴及浓硝酸3~4滴,加热,冷却后再加10%NaOH 溶液5滴,观察颜色反应。

3.茚三酮反应

取1mL 蛋白质溶液置于试管中,加2滴茚三酮试剂,加热至沸,即有蓝紫色出现(注意:此反应必须在pH5~7进行)。

五、思考题:

1. 能否利用茚三酮反应可靠鉴定蛋白质的存在?为什么?

2. 为什么蛋清可以作为铅或汞中毒的解毒剂?

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第二篇:沉淀反应


       免疫学试验计划

 实验二 沉淀试验——双向免疫扩散试验

一、目的要求:

1、掌握双向免疫扩散试验的原理和用途;

2、熟悉双向免疫扩散试验的操作方法。

二、实验原理:

1、沉淀反应:可溶性抗原(如血清、细菌的外毒素、内毒素、菌体裂解液、病毒、组织浸出液等)与相应的抗体相遇,当二者比例适当,在一定温度、pH并有电解质存在下,就可能形成肉眼可见的白色沉淀,称为沉淀反应。根据抗原与抗体的不同反应与其它因素,沉淀反应分为:凝胶内沉淀反应(单向琼脂扩散、双向琼脂扩散等)、免疫电泳技术(对流免疫电泳、火箭免疫电泳、免疫琼脂扩散电泳等)、液相内沉淀反应(环状沉淀反应、免疫浊度试验、絮状沉淀反应等)。单向沉淀、双向沉淀。

2、抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应. 它既可发生在体内,也可发生在体外。 体外的抗原抗体反应表现为沉淀、凝集、细胞溶解、补体结合、中和反应等反应现象。沉淀反应(precipitation)是可溶性抗原与相应抗体在电解质存在的条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。如图所示:

3、影响沉淀反应的主要因素:(1).抗原(Ag)、抗体(Ab)反应的浓度、比例(2).电解质(3).温度(4).酸碱度

4、双向免疫扩散试验:将可溶性抗原和抗体分别加到含适量电解质的琼脂板上相应的小孔中,使两者各自向四周自由扩散,若抗原与抗体相对应,两者相遇即发生特异性结合,并在比例合适处发生沉淀,此沉淀物因颗粒较大而不扩散,故形成沉淀带。沉淀物形成的主要原因是因为抗原与抗体分子表面的疏水基团相互接近而有效的排出它们之间的水分。

利用琼脂凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂凝胶,其内部为多孔网状。而且孔径很大,可以允许大分子物质(分子量自十几万到几百万以上)自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上,所以它们在琼脂凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点,因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。

5、抗原抗体反应的特点:1.特异性 2.比例性 3.可逆性

6、带现象:Ag 与 Ab 比例不适而不出现可见反应。前带(prozone):抗体过量时;后带:(postzone)抗原过量时。

7、沉淀反应的抗原可以是多糖、类脂、蛋白质或它们的结合物等。与相应的抗体相比,抗原的分子量小,单位体积内所含抗原量多,具有较大的反应面积。因此,在作定量沉淀试验时,为了不使抗原过剩而生成不可见的可溶性复合物,通常应稀释抗原。沉淀反应的血清稀释倍数在1::6内即可得效价。

8、每一对应抗原和抗体可出现一条沉淀线, 出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即为抗体效价。 若同时含有若干对抗原抗体系统,因其扩散速度的不同,可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况,还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以,可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份,并用以测定抗原或抗体的效价。

9、参与沉淀试验的抗原称沉淀原,抗体称为沉淀素。

三、应用:

沉淀试验广泛应用于病原微生物的诊断(鸡马立克氏病、法氏囊病、炭疽杆菌抗原),各种免疫血清效价和毒素、抗毒素的测定;检测未知抗原或抗体、抗原性质分析、抗体效价滴定、抗原或抗体纯度鉴定等方面。

四、材料:

1、耗材:平皿1个、100ml量筒1个、吸管、1ml移液管1个、枪头若干、300ml锥形瓶1个、记号笔1支、标签纸若干、洗耳球1个、试管7个;

2、试剂:琼脂粉、8.5% 高渗盐水、待测血清、标准血清、猪口蹄疫抗原(本校实验室制作)、25ug/ml溴酚蓝;

3、仪器:微波炉、3mm打孔器、20ul移液枪、湿盒、电子天平、恒温恒湿培养箱(型号:HWS-27,厂家:宁波市科技园区新江南仪器有限公司)。

五、实验方法:

1、琼脂板的制备:1 克琼脂粉溶于 100ml 8.5% 高渗盐水装入锥形瓶中,加热煮沸至充分溶解,加25ug/ml溴酚蓝0.4ml。待温度降至 55℃左右时, 用吸管吸取6ml左右趁热浇于平皿上,制成琼脂板(滴加时要小心,勿溢出并避免产生气泡)。

2、打孔:在琼脂板上打孔(中间一个、周围七个),孔径为 3mm,中间空和周围孔间的距离大约为5mm,并用枪头挑去孔内琼脂。注意周围的孔距离平皿边缘距离要大于3mm.

3、加样:将待检血清作倍比稀释,即 1:1、1:2、1:4、1:8、1:16,分别加至1—5孔中,6孔加标清,7孔加生理盐水作对照,中间加猪口蹄疫抗原。每孔各加15ul左右,注意不要溢出。

4、作用:将琼脂板水平放置湿盒中,在 37℃ 恒温箱中作用 24h。观察结果。

5、预期结果:抗原抗体在凝胶内扩散,在两孔之间比例最适合的位置出现沉淀带,出现沉淀带的抗体最大稀释倍数即抗体效价。

六、实验结果判定:

1、观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1 至5孔(1:1、1:2、1:4、1:8、1:16) 的待测血清与中央孔(猪口蹄疫抗原)之间是否可出现清晰的乳白色沉淀线。6孔是高渗盐水,为阴性对照,与中间空间无白色沉淀线。

2、相应抗原抗体所形成的沉淀线,如二者浓度相当,沉淀线在孔中央,二者浓度不当时,则沉淀线偏向浓度低的一侧 。

七、注意事项:

1、切勿剧烈震荡未凝固的琼脂板,避免气泡出现。

2、打孔加样时,不要将琼脂划破,以免影响沉淀线的形成。孔间距要相等。

3、加样时不同浓度抗体和抗原不要混淆,影响试验结果。

4、反应时间要适宜。若时间过长,沉淀线可解离而导致假阴性、不出现或不清楚。

5、溴酚蓝起对照作用,便于观察。但应注意其加入量。

6、准备材料时多准备一组材料,避免不够用。

  生物科学1102班    小组成员:

       组长 xxx 

       组员分工     试验计划拟定   xxx

                 模拟购买物品   xxx 

                 实验用品准备   xxx                

             实验结果记录   xxx               

             试验卫生安全   xxx    

             试验具体操作   xxx

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