严重畸形精子症助孕方式探讨

【黑龙江虹桥医院】 目的探讨严重畸形精子症患者合理助孕方式。方法 回顾性分析20xx年2月-20xx年10月就诊我中心女方正常、男方为严重畸形精子症的18对不孕夫妇的助孕结局，助孕方式8例（17个周期）AIH（2例共4个周期改为指导同房）、4例（4个周期）IVF、4例（4个周期）ICSI，1例（1个周期）R- ICSI，1例（1个周期）half -ICSI。 结果 11对夫妇获得妊娠，7例已分娩，新生儿发育正常，2例孕早期胚胎停育，其余孕期产前检查均正常。成功妊娠者中AIH 8例（自然周期指导同房2例），IVF 2例（1例停育）;ICSI 1例（胚胎停育）。不同助孕方式组间妊娠结局构成比差异有统计学意义（χ2=11.59，P<0.01;χ2=18.00，P<0.01），精卵自然结合的AIH组比例高、IVF组次之，ICSI组未孕比例较高。精卵自然结合AIH/IVF组与显微受精的ICSI组间生化妊娠率、临床妊娠率比较差异有统计学意义（P=0.043;P=0.013）;极严重畸形精子症患者自然流产率高，助孕结局差。结论 ICSI并不是严重畸形精子症患者的唯一助孕方式;女方正常的严重畸形精子症患者精卵自然结合的助孕方式是较ICSI更有效、安全、经济的首选方法。极重度畸形精子症作为ICSI指针可能是一个更加合适、严谨的选择。

【关键词】 严重畸形精子症;妊娠;辅助生殖技术;体外受精; ICSI

精子形态是影响受精的重要因素之一［1］，一般认为正常形态精子<15％，则体外受精能力下降，被认为是严重畸形精子症列入卵胞浆内单精子注射（ICSI）助孕的指征。然而一些临床实践表明ICSI并不是严重畸形精子症唯一最佳助孕方式［2-3］，一些严重畸形精子症患者采用更自然的夫精人工受精（AIH）等助孕方法较ICSI可获得更好的治疗结局，现将我院开展辅助生殖技术以来18例畸形精子症患者的助孕方案及其结局分析报告如下。

1 资料与方法

1.1 资料来源

20xx年2月-20xx年10月期间在本院生殖医学中心接受助孕治疗的双方染色体、自身抗体、TORCH等正常的18对夫妇，其男方多次精子形态分析为严重畸形精子症（正常形态精子均为4％～10％），####常规正常或轻中度少弱精子症（密度≥10×106·mL-1，a+b级精子≥50％）;女方均有排卵、子宫内膜及至少一侧输卵管正常，自然周期B超、尿LH等动态监

测正常，指导同房3次未孕者建议促排卵（COH）或促排卵-AIH助孕;3次未孕建议体外受精（IVF）/ICSI助孕。助孕后均予黄体支持，AIH或胚胎移植后14～16d后检测HCG，HCG阳性后20d超声监测胎心及胚胎发育情况并随访至出生。

1.2 促排卵及助孕技术

1.2.1 促排卵-AIH 采用克罗米芬、来曲唑、HMG等促使1～3个优势卵泡发育，优势卵泡直径达16～20mm时，结合尿LH监测注射HCG5000-10000U，24～28h后男方手淫取精,经密度梯度离心或上游法处理####，收集精子液行AIH;优势卵泡未消失者48h内再次AIH。

1.2.2 IVF/ICSI助孕 采用促性腺激素释放激素类似物（GnRH-a）/HMG/FSH长方案或短方案诱导促超排卵，当优势卵泡直径16～20mm时，结合血激素测定适时注射HCG10000 U，36 h后取卵，取卵当日男方以手淫法采取####;####处理后收集精子IVF/ICSI助孕。IVF/ICSI均由有经验的操作者按照我院操作常规进行，受精后第2或第3天行胚胎移植。

1.3 畸形精子症检查、标准及分类

####质量及形态检查方法及标准按WHO第四版《人类####及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》推荐的方法［4］。每份标本染色后连续计数分析200个精子形态，正常形态精子标准和异常精子标准及分类参见文献［4］。正常形态精子百分率<30％为畸形精子症，<15％为严重畸形精子症，<5％ 为极重度畸形精子症。正常####密度≥ 20×106·mL-1，≥10×106·mL-1为中度少精子症。

1.4 统计学方法

SPSS 10.0统计软件进行各数据处理。计量资料结果以（±s）表示，两组间均数比较用t检验，计数资料采用χ2检验、Fisher‘s精确概率法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 18例严重畸形精子症患者助孕方法及结果

18例畸形精子症患者年龄25～40（33.56±3.67）岁;女方年龄24～38（31.29±4.08）岁;不

孕时间0.5～14（5.08±3.18）年，原发不孕10例（55.6％，10/18），继发不孕8例（44.4％，8/18）。所有患者均自然周期排卵后第7天监测E2、P正常，其中AIH 8例（17个周期，其中2例为拟AIH改行自然周期指导同房妊娠）、IVF 5例（5个周期），其中1例授精6h全部受精失败行早期补救ICSI（R- ICSI）、ICSI 4例（4个周期）、half -ICSI 1例（1个周期）。

18例患者中11例获得妊娠，7例已分娩，出生儿随访正常，2例孕早期胚胎停育（空孕囊、无胚芽），其余目前均为晚孕阶段，产前检查正常。妊娠者中AIH助孕治疗8例（其中第1周期AIH助孕3例，1例为双胎妊娠;第2、3周期AIH助孕妊娠者各2例;第4次AIH助孕1例，该患者第1周期AIH助孕妊娠胚胎停育，目前婴儿已出生3个月，发育正常。IVF助孕2例（1例患者既往无妊娠史，既往男方####密度5～8×106·mL-1，取卵日####密度13×106·mL-1故行IVF助孕有多枚有效胚胎，鲜胚移植妊娠目前婴儿已出生数月，发育正常，其余胚胎冻存;另1例曾有人工流产和宫外孕史，IVF助孕有多枚有效胚胎，鲜胚移植妊娠后胚胎停育。ICSI助孕1例（该患者AIH助孕2次均发现精子畸形率高，ICSI妊娠后胚胎停育，有冻存胚胎）。

另1例多次指导同房、3次AIH助孕失败的畸形精子症患者行ICSI助孕获MⅡ卵子8枚仅1枚受精，无可移植胚胎。经Half-ICSI治疗患者既往有多次促排卵指导同房/AIH未孕史，为避免IVF受精失败行Half-ICSI助孕IVF及ICSI均有受精;经R-ICSI治疗患者既往有2次流产史，自然周期、促排卵AIH 2次未孕后行IVF助孕受精后6h发现全部卵子未受精行早期补救ICSI。

2.2 严重畸形精子症患者助孕成功相关因素

畸形精子症患者助孕成功组与未成功组各参数比较，女方年龄（32.63±3.96）岁 vs （30.20±4.05） 岁、男方年龄（34.63±2.26 ）岁 vs （32.70±4.42） 岁、不孕年限（6.50±3.85）岁vs （3.95±2.09）岁比较差异无统计学意义（t=1.27、1.12、1.80;P均>0.05）。原发、继发不孕与不同妊娠结局;流产次数、男方精索静脉曲张史在畸形精子症患者不同妊娠结局组间比较差异无统计学意义（t=1.27、1.12、1.80;P均>0.05）。

AIH 、IVF 、ICSI组生化妊娠、临床妊娠情况详见表1，三组间妊娠结局构成比差异有统计学意义（χ2=11.59，P<0.01;χ2=18.00，P=0.01），AIH组妊娠比例高、IVF组次之，而ICSI组妊娠比例较低。AIH与IVF均为精卵自然结合，将其合并为一组，AIH/IVF组与显微受精的ICSI组间妊娠结局：生化妊娠、临床妊娠率比较差异有统计学意义（P=0.043;P=0.013）。

此外本资料虽未显示严重畸形精子患者精子畸形比率与不受精的关系，但与非极重度畸形精子（正常精子百分比5％～14％）比较极重度畸形精子症（正常精子百分比<5％）最终妊娠结局均不理想。4例患者均行AIH助孕2～4个周期均未孕，改体外受精助孕受精率低，1例（曾自然流产2次）IVF未受精行R-ICSI鲜胚、冻胚移植均未孕，3例ICSI助孕除1例受精率极低无可移植的有效胚胎外，其余2例受精正常，1例妊娠后胚胎停育，1例鲜胚移植未孕。表1 严重畸形精子症患者不同助孕方式与其结局的关系

2.3 严重畸形精子症与自然流产

我们的资料中9例患者有既往妊娠史，其中7例有自然流产史，4例有2次自然流产史提示重度畸形精子症患者有自然受精的几率;畸形精子症患者自然流产率较高（7/18）;但既往有无妊娠史、有无自然流产史与患者不同妊娠结局组间比较差异无统计学意义。

3 讨论

3.1 ICSI不是重度畸形精子症患者的唯一助孕方式 正常的精子形态和结构是保证精子完成受精的基础。WHO资料认为当正常形态精子<15％，则体外受精能力下降，因此大多数生殖中心都将其列为ICSI助孕技术的适应证［1-2］。出于对ICSI技术弊端的担忧和患者的条件、意愿，我们对18例严重畸形精子症患者采用不同的助孕手段，尽管病例数不多但结果显示，重度畸形精子症患者以精卵自然结合的指导同房、AIH和IVF方式助孕较ICSI获得更好的治疗结局，表明ICSI助孕并不是重度畸形精子症患者的唯一助孕方式。这与国内杨琼［5］等研究显示对重度畸形精子症患者用同周期卵母细胞按比例分别采取IVF和ICSI两种方式受精后，两种受精方式的受精率，其中同期同年龄段IVF及ICSI组的妊娠率差异均无统计学意义，结局一致。方丛［6］等研究也提示仅在低受精密度≤1.2×109·L-1时精子形态才对IVF受精率有一定影响, 提高受精密度后，精子形态对受精率影响减小，较高的IVF受精密度可能弥补了精子形态方面的不足。此外，我们的资料中9例有既往妊娠史者也提示畸形精子症患者有自然受精的可能性，因此对于精子数量及活率正常的重度畸形精子症将ICSI作为其唯一受精方式的观点值得商榷。我们临床结果也与目前最新研究显示的精子DNA完整率才是比精子形态更优越的精子受精能力评估指标的进展［7］一致。

3.2 ICSI是否是所有畸形精子症的最佳选择 我们的资料中9例严重畸形精子症患者中7例有自然流产史，4例自然流产2次，显示严重畸形精子症患者自然流产率较高。彭海英［8］

等研究显示，体细胞染色体正常的畸精症患者精子性染色体的遗传异常（非整倍体率为15.3％），高于正常对照。Giorlandino C［9］研究也表明在畸精症患者精子中2l号染色体和性染色体的非整倍性远高于正常人，认为男性不育中精子染色体异常是引起不育、流产、死胎、先天缺陷、脑发育迟缓的一个重要原因。因此，精子染色体异常可能是严重畸形精子症自然流产率高的这一临床现象的主要原因。

畸形精子症患者####中包括染色体或遗传物质、受精能力、形态上分别正常、异常的精子。而精子形态、活力、受精能力与精子染色体是否正常的关系并不一致，理论上1个卵子只需1个正常的精子。ICSI虽可克服受精对精子数量要求及众多受精失败的机制，但ICSI时操作者无法凭精子活动力、大体形态判断精子的染色体是否正常，对精子的选择仅仅基于精子活力和大体形态，而越过了自然选择的过程，可能会介入受损的父代基因［10-11］，无法保证选择遗传正常的精子以降低ICSI的流产率。因此充分给予患者精卵自然结合的受孕机会，严格制定、把握畸形精子症ICSI指针对避免异常遗传基因的传递、提高辅助生殖技术的安全性可能有积极的意义。

我们的资料还显示极重度畸形精子症自然受孕结局差，非极重度畸形精子症自然受孕结局良好，这与一些研究者［1］发现的极重度畸形精子症受精率低，需ICSI助孕的观点一致，因此我们认为将极重度畸形精子症作为ICSI指针可能是一个更加合适、严谨的选择，而对非极重度畸形精子症患者应根据患者夫妇双方具体病情，选择最恰当的助孕方式：女方输卵管正常者首选自然周期或促排卵指导同房/AIH，输卵管阻塞者可首选IVF，必要时行早期补救ICSI或half-ICSI，充分给予患者精卵自然结合的受孕机会可以减少或避免ICSI助孕后代相关风险，防止ICSI指征不合理扩大或技术滥用，提高辅助生殖技术的安全性。

3.3 畸形精子症的处理及受精能力判断 彭影等［12］研究发现上游法和密度梯度离心法对改善精子畸形率的作用有限;还发现不同的精子畸形顶体发育、顶体酶活性高低不一其体外受精或人工授精治疗结局不同，认为尽管目前普遍采用精子总畸形率决定是否使用ICSI技术，但需要对各种畸形精子受精能力给于新的评估。

总之，我们认为重度畸形精子症患者有精卵自然选择受精、受孕得到正常后代的可能，应根据患者夫妇具体病情充分给于患者自然助孕的机会，选择最适宜、自然的助孕技术。重度畸形精子症者的精子可能存在遗传缺陷，目前技术无法筛选受精、遗传物质正常的畸形精子助孕，严格把握畸形精子症ICSI助孕指针才可能有助于提高辅助生殖技术的安全性，使其真正造福人类。单纯将正常形态精子<15％一项作为ICSI指征可能扩大了ICSI指征;将正

常形态精子<5％定为ICSI的绝对指征可能是合适的。更好的畸形精子的受精能力评估指标可能有助于明确患者ICSI助孕的选择。

【参考文献】

［1］ 崔险峰. 应用严格精子形态学测定法评估精子形态对体外受精率的影响［J］. 中华男科学杂志, 2006,12（9）:842-283.

［2］ 王瑞雪,刘睿智. 精子形态与精子功能关系研究进展［J］. 中华男科学杂志, 2007

（4）: 348- 351.

［3］ Adler A，LaBella PA， McCaffrey C，et a1.Poor spermm morphology, is it only ICSI，or is there another alternative? ［J］. Fertil Steril，2000，74（3）：s219.

［4］ 谷翊群，陈振文，于和鸣，译.人类####及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册［M］. 4版.北京：人民卫生出版社，2001：l5-####.

［5］ 杨琼, 童先宏, 刘雨生, 等. 体外成熟卵母细胞及畸形精子症体外受精方式的探讨［J］. 实用医学杂志, 2007,23（14）:2144-2146.

［6］ 方丛,庄广伦,张敏芳,等. 精子形态对体外受精的影响作用［J］. 中华泌尿外科杂志, 2001, 22（6）:367-369.

［7］ 陈振文.精子染色质结构检测在男性不育诊疗中的应用［C］.中华医学会第四次生殖医学学术年会暨首届中国-东盟生殖医学论坛，2010:79-80.

［8］ 彭海英, 张昌军, 熊进. 不育伴畸形精子症患者精子中性染色体的非整倍性一例分析报告［J］. 中国优生与遗传杂志, 2008, 16（6）:70.

［9］ Giorlandino C，Calugi G，Iaconianni L，et a1.Spermatozoa with chromosomal abnormalities may result in a higher rate of recurrent abortion［J］.Fertil Stefil,1998，70（3）：576-577.

［10］ 邵法明, 朱晓斌, 李铮. 男性不育症ICSI治疗的遗传风险分析［J］. 中华男科学杂志, 2008, 14（1）: 71-74.

［11］ 郑菊芬, 陈佩, 向祖琼,等. 隐匿精子症和严重弱精子症的ICSI术前准备和疗效分析［J］. 上海交通大学学报：医学版, 2008, 28（3） :247-249.

［12］ 彭影, 郭通航, 刘雨生,等. 两种方法处理后精子形态的变化［J］. 临床输血与检验, 2007, 9（3）:205-207.

第二篇：精子畸形试验

十三、精子畸形试验

Sperm Malformation Test

1 范围

本规范规定了动物精子畸形试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。

2 引用标准

GB 14924 试验动物与饲料标准

GB 15193·94 食品安全性毒理学评价程序

3 定义

精子畸形 （sperm malformation）

指精子形态的异常改变。

4 原理

已知精子畸形是决定精子形成的基因发生突变的结果。常染色体和Y-性连锁基因突变及某些染色体重排，如性-常染色体易位，也可使精子发生畸形。

小鼠精子畸形试验能评价受试物对精子生成、发育的影响，可检测受试物在体内对生殖细胞的遗传毒性作用。

5 试验的基本原则

通过适当的途径使动物接触受试物，经过一定时间后处死动物，取其附睾，制备涂片，经固定、染色，在显微镜下计数畸形精子。

6 仪器和器械

生物显微镜、解剖剪、镊子、表面皿、离心管、小漏斗、吸管、滴管、载玻片、擦镜纸等。

7 试剂

称取伊红1g溶于100mL蒸馏水中。

7.2 生理盐水、甲醇（A.R）

8 实验动物和饲养环境

常规使用动物是雄性小鼠。6周~8周龄，体重为30g ~35g。

实验动物及实验动物房应符合国家相应规定。

9 剂量分组

受试物至少设三个剂量组。分别取1/2、1/5、1/10或1/20LD50剂量。当受试物的LD50大于5g/kg体重时，可取5g/kg体重为最高剂量。另外设阴性（溶剂）对照组和阳性物对照组。常用溶剂为水、生理盐水、植物油（玉米油、花生油）等。阳性物对照组可采用环磷酰胺40mg/kg/7.1 1%伊红染色液 128

日。每组至少有5只存活动物。

10 染毒途径和方式

染毒途径视实验目的而定。常用途径为经口灌胃方式。受试物各剂量组、阴性对照组和阳性物对照组的动物，均连续染毒5d，每日一次。一般于首次染毒后的第35d处死动物。

11 试验方法

11.1 制片

用颈椎脱臼法处死小鼠，剖开腹腔，暴露睾丸，分离两侧附睾，用眼科剪剖开附睾组织，与适量生理盐水混匀，涂片。

11.2 固定

待涂片干燥后，放入甲醇（A.R）液中固定5min。取出晾干。

11.3 染色

将涂片于1%伊红染液中染色1h，然后用蒸馏水轻轻冲洗，晾干。

11.4 观察与计数

首先，在低倍镜下选择背景清晰、精子分布均匀、重叠较少的区域，然后，在高倍镜下观察结构完整的1000个精子，计数其中畸形的精子。精子畸形主要表现在头部。按Wyrobeks的分类标准，主要类型有：无钩、香蕉形、无定形、胖头、尾折叠、双头及双尾。无尾精子、头部重叠的或整个与另一个重叠的精子均不计数。判断双头、双尾精子时，要注意与两条精子的部分重叠相区别。

12 数据处理和结果判断

每只动物应按精子畸形类型分别记录，以便计算各实验组的精子畸形发生率和精子畸形类型的构成比。

利用Wilcoxon秩和检验法和其他适当的统计学方法。将受试物各剂量组精子畸形发生率分别与阴性对照组进行比较。

精子畸形试验阳性的判断标准是畸形发生率至少为阴性对照组的倍量或经统计学处理有显著性差异，并存在剂量-反应关系者。

一般正常小鼠的精子畸形率为0.8%~3.4%，但每个实验室应有自己稳定的精子自发畸形率。

13 试验报告

试验报告应包括以下内容：

（1）受试物名称、理化性状、配制方法、所用溶剂；

（2）动物种属和品系、体重、数量、来源（注明合格证号和动物级别）；

（3）实验动物饲养环境，包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物室合格证号；

（4）剂量分组，染毒途径和方式；

（5）试验方法：简述操作步骤，所用统计学方法；

（6）结果：以列表方式报告受试物对动物精子畸形发生率和精子畸形类型分析的结果 （表1和表2）；

（7）结论。

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表1 ×××精子畸形发生率

组 别

受 试 物

溶剂对照

阳性物对照(mg/kg)

表2 ×××精子畸形类型分析

组 别

剂量 动物数 (g/kg) (只)

受 试 物

溶剂对照

阳性物对照(mg/kg)

受检精子总数(个)

精子畸形分类及比例（%）

无钩

香蕉形

胖头

无定型

其他

总计

剂量 (g/kg)

动物数 (只)

受检精子总数 畸变精子数

(个) (个)

畸变率

（%）

P值

注：畸变率以均数?标准差表示。

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