醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白
目的和要求
掌握醋酸纤维薄膜电泳的原理及操作方法
原理
带电质点在电场中向着反向电极移动的现象称为电泳，其移动方向及速度取决于本身所带电荷的性质和数量、电场强度以及溶液pH等因素。蛋白质分子在溶液中的电泳是因其分子具有一些游离的可解离基团如-COOH、-NH2、-OH等，因而在某种pH值溶液中蛋白质分子带有一定的电荷。混合蛋白样品中由于各蛋白质的等电点不同，在同一pH溶液中所带的电荷性质及电荷数目不同，因此在电场中各种蛋白质泳动的方向和速度也不同，从而使蛋白质混合样品得以分离。
血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等，其氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、等电点及形状等均有所不同。由下表可见，血清中5种蛋白质的等电点大多低于pH7.0，在pH8.6的缓冲液中都电离成负离子(羧基解离)，故在电场中均向阳极移动。
在一定范围内，蛋白质的含量与结合的染料量成正比，故可将各蛋白质区带剪下，分别用0.4 mol/L NaOH溶液浸洗下来，通过比色法或将染色后的薄膜直接用光密度计扫描，以测定特定电泳区带的蛋白质相对含量。
本实验采用的醋酸纤维薄膜电泳法是以醋酸纤维薄膜为支持物。醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化后形成的纤维醋酸酯，将其溶于有机溶剂(如丙酮、氯仿、乙酸乙酯等)后于聚乙烯材料上涂成均匀的薄膜，待溶剂蒸发后即可。该膜具有均一的泡沫状结构，有强渗透性、其厚度约为120 μm。
醋酸纤维薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高、对样品无拖尾和吸附现象等优点，目前已广泛应用于血清蛋白、血红蛋白、糖蛋白、脂蛋白、结合球蛋白和同工酶的分离及测定。
操作步骤
㈠准备
醋酸纤维薄膜的润湿和选择：将薄膜裁成8×2cm状，使其漂在缓冲液液面上(若迅速湿润，整条薄膜一致而无白点，则表明薄膜质地均匀，可用于电泳实验)，然后用竹夹/镊子轻轻地将薄膜完全浸入缓冲液中，待薄膜完全浸透后使用(约0.5h)。
制作电桥：将电泳缓冲液倒入电泳槽两边并用虹吸管平衡两边液面。根据电泳槽的纵向尺寸，剪裁尺寸合适的滤纸条。取四层附着在电泳槽的支架上，使其一端与支架的前沿对齐，另一端则浸入电极槽的缓冲液内。然后用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为“滤纸桥”。按照同样的方法，在另一个电极槽的支架上制作相同的“滤纸桥”。它们的作用是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的中间“桥梁”。
㈡点样
取出浸透的薄膜，夹在两层滤纸之间吸去多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上(无光泽面朝上)，用点样器蘸取适量血清(约2~3 μl)，再“印”在薄膜的点样区(距薄膜一端1.5 cm处)。血清应均匀分布，形成具有一定宽度、粗细匀称的直线。点样切忌过量，可事先在滤纸上练习以掌握点样技术，这是获得具有清晰区带的电泳图谱的重要环节之一。
㈢电泳
将点好样的薄膜(无光泽面朝下)两端紧贴在支架的滤纸桥上(加血清端靠负极)，中部保持悬空平直。先平衡10 min，仔细检查电泳装置的线路是否正确，然后通电。打开电源开关，调节电流为0.4~0.6 mA (薄膜每厘米宽)，电压为每厘米长10~12V。在电泳过程中，应注意控制电压和电流强度，防止过高偏低。待电泳区带展开约3~5 cm时，关闭电源，一般通电时间为60 min左右。
㈣染色
电泳结束后，关闭电源，立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5~10 min。然后用漂洗液漂洗至背景无色(约3~5次)。再浸于蒸馏水中或用滤纸吸干。
㈤结果判断
一般经染色漂洗后，薄膜上可呈现5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白、γ球蛋白。
试剂和器材
试剂
1. 新鲜血清(制备时要无溶血现象)
2. 巴比妥-巴比妥钠缓冲液(pH8.6，0.075mol/L，离子强度0.06)：称取巴比妥1.66g和巴比妥钠12.76g，溶于少量蒸馏水后定容至1,000mL。
3. 染色液：称取氨基黑10B 0.5g，加入蒸馏水40 mL，甲醇50 mL和冰醋酸10 mL，混匀，贮存于试剂瓶中。
4. 漂洗液：取95%乙醇45 mL，冰醋酸5 mL和蒸馏水50 mL，混匀。
器材
醋酸纤维薄膜：市售的电泳用醋酸纤维薄膜 培养皿(直径9~10 cm)
点样器/血色素吸管 直尺和铅笔 电泳仪和电泳槽 镊子
普通滤纸 试管和试管架
思考题
1. 点样为什么要在粗糙面？电泳时为什么点样面要向下放置？
2. 如果区带的分离效果不好，试分析可能存在有哪些因素的影响？
第二篇：醋酸纤维素薄膜电泳
醋酸纤维素薄膜电泳
原理：
醋酸纤维素薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis）以醋酸纤维薄膜为支持物。它是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而制成。它溶于丙酮等有机溶液中，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1mm—0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则膜片缺少应有的机械强度则易碎。
应用：
醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、廉价。已经广泛用于血清蛋白，血红蛋白，球蛋白，脂蛋白，糖蛋 白，甲胎蛋白，类固醇及同工酶等的分离分析中，尽管它的分辨力比聚丙酰胺凝胶电泳低，但它具有简单，快速等优点。
特点：
1.（1）醋酸纤维素薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了测定的精确性。
（2）快速省时。由于醋酸纤维素薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中所容纳的缓冲液也较少，电渗作用
小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短，一般电泳45—60min即可，加上染色，脱色，整个电泳完成仅需90min左右。
（3）灵敏度高，样品用量少。 血清蛋白仅需2μl血清，甚至加样体积少至0.1μl，仅含5μg蛋白样品也可得到清晰的分离带。临床医学检验利用这一点，检测在病理情况下微量异常蛋白的改变。
（4）应用面广。某些蛋白在纸上电泳不易分离，如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋酸纤维薄膜电泳能较好地分离。
（5）醋酸纤维素薄膜电泳染色后，经冰乙酸，乙醇混合液或其它溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。
2、醋酸纤维素薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，操作简单，但分离效果不太好。如血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中，只能分离出5—6条区带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳可分离出数10条区带。 补充：
根据样品理化性质，从提高电泳速度和分辨力出发选择缓冲液的种类，pH和离子强度。选择好的缓冲液最好是挥发性强，对显色或紫外光等观察区带没有影响，若样品含盐量较高时，宜采用含盐缓
冲液。例如血清蛋白电泳可选用pH8.6的巴比妥缓冲液或硼酸缓冲液；氨基酸的分离则可选用pH7.2的磷酸盐缓冲液等。电泳时先将滤膜剪成一定长度和宽度的纸条。在欲点样的位置用铅笔做上记号，点上样品，在一定的电压，电流下电泳一定时间，取下滤膜，进行染色。不同物质需采用不同的显色方法，如核苷酸等物质可在紫外分析灯下观察定位，但许多物质必须经染色剂显色。
醋酸纤维素薄膜电泳染色后区带可剪下，溶于一定的溶剂中进行光密度测定。也可以浸于折射率为1.474的油中或其他透明液中使之透明，然后直接用光密度计测定。
它的缺点是厚度小，样品用量很小，不适于制备。
[注意事项]
1、醋酸纤维素薄膜的预处理
市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是电泳成败的重要关键之一。将干膜片漂浮于电极缓冲液表面，其目的是选择膜片厚薄及均匀度，如漂浮15s—30s时，膜片吸水不均匀，则有白斑点或条纹，这提示膜片厚薄不匀，应舍去不用，以免造成电泳后区带扭曲，界线不清，背景脱色困
难，结果难以重复。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上聚集的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹感染，取膜时，应戴指套或用镊子。
2、缓冲液的选择
醋酸纤维素薄膜电泳常选用pH8.6巴比妥溶液，其浓度为0.05mol/L—0.09mol/L。选择何种浓度与样品及薄膜的薄厚有关。选择时，先初步定下某一浓度，如电泳槽两极之间的膜长度为8 cm—10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽。当电泳达不到或超过这个值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，并由于扩散变宽；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中不易分辨。
3、加样量
加样品的多少与电泳条件、样品的性质、染色方法与检测手段灵敏度密切相关。作为一般原则，检测方法越灵敏，加样量则越少，对分离更有利。如加样量过大，则电泳后区带分离不清楚，甚至互相干扰，染色也较费时。如电泳后用洗脱法定量时，每厘米加样线上需加样品0.1μl—0.5μl约相当于5μg—1000μg蛋白。血清蛋白常规电泳分离时，每厘米加样线加样量不超过1μl，相当于
60μg—80μg的蛋白质。但糖蛋白和脂蛋白电泳时，加样量则应多些。对每种样品加样量均应先作预实验加以选择。
点样好坏是获得理想图谱的重要环节之一，以印章法加样时，动作应轻、稳，用力不能太重，以免将薄膜弄坏或印出凹陷而影响电泳区带分离效果。
4、电量的选择
电泳过程应选择合适的电流强度，一般电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm宽膜为宜。电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散。
5、染色液的选择
对醋酸纤维素薄膜电泳后染色应根据样品的特点加以选择。其原则是染料对被分离样品有较强的着色力，背景易脱色；应尽量采用水溶性染料，不宜选择醇溶性染料，以免引起醋酸纤维素膜溶解。 应控制染色时间。时间长，薄膜底色深不易脱去；时间短，着色浅不宜区分，或造成条带染色不均，必要时可进行复染。
6、透明及保存
透明液应临用前配制，以免冰乙酸及乙醇挥发影响透明效果。这些试剂最好选用分析纯。透明前，薄膜应完全干燥。透明时间应掌握好，如在透明乙液中浸泡时间太长则薄膜溶解，太短则透明度不佳。 透明后的薄膜完全干燥后才浸入石蜡中，使薄膜软化。如有水，则液体石蜡不易浸入，薄膜不易平展。