基因组DNA抽提操作流程
一、 原理与意义
先用细胞裂解液对已制备好的组织匀浆充分裂解,然后用蛋白酶去除其中的蛋白,再用氯仿一次抽提(无需用酚抽提)、预备液沉淀、RNase去除RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。该方法适用于从人或动物的各种组织、血液、培养细胞、G+/G-细菌中快速抽提基因组DNA。抽提出来的DNA能用于几乎所有的分子生物学实验,如DNA梯度分析、PCR、限制性内切酶反应、克隆、Southern Blot分析等。
二、 试剂及其配制
抽提试剂盒购于上海生工公司,内含以下试剂:
1. TE缓冲液:PH8.0,由10 mM Tris HCl和1 mM EDTA配成。
2. RNase A(3 mg):使用前加入300 ?l无菌双蒸水,煮沸10 min后使其自然冷却后使用,-20 ℃冻存。
3. Proteinase K(12 mg):使用前加入600 ?l无菌水,分装成小份,-20 ℃冻存。
4. Cell Lysis Solution与Precipitation Solution:溶液出现絮状沉淀50 ℃加热溶解后使用。
5. 1.2 mol/L NaCl。冰冷乙醇和氯仿自备。
三、 实验器材
水浴锅、普通冰箱、1.5/2 ml离心管、移液器及枪头、紫外分光计、离心管架、剪刀、镊子、滤纸等。
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四、 操作步骤
1. 组织匀浆制备:取30 mg左右新鲜组织,加600 ?l TE缓冲液,手工匀浆数次。
2. 细胞裂解:吸取300 ?l匀浆加600 ?l Cell Lysis Solution,混匀。
3. 消化蛋白:再加入9 ?l Proteinase K(可适当增加)混匀,置于55 ℃水浴30 min以上(可达2.5 h),其间上下混匀几次。
4. 氯仿抽提:加入600 ?l氯仿(用户自备),轻柔上下混匀,不能太剧烈,以保证DNA的完整性。
5. 沉淀:在台式离心机上,10000转/分,室温离心2 min。此时应分成三层,基因组DNA在上层中,如未能分层,表明样品与氯仿未混匀(可通过延长离心时间或增加离心速度获得上清)。取500 ?l上清液,置于无菌1.5 ml离心管中,加入500 ?l Precipitation Solution,混匀多次至出现絮状物,室温静置2 min。10000转/分,离心2 min。
6. 去除RNA:弃除上清,注意不要倒掉沉淀,立即加入100 ?l 1.2 mol/L NaCl,轻轻振荡直至DNA样品完全溶解,加入3 ?l RNase A,置于37 ℃ 10 min,以去除RNA。
7. 沉淀DNA:加入300 ?l冰冷乙醇(终浓度为75%,沉淀效果最佳),-20 ℃放置10 min。10,000转/分,离心2 min。倒掉乙醇,倒置室温干燥10~15 min。若DNA量多,可再重复沉淀一次。DNA用TE缓冲液或100 ?l三蒸水溶解。
五、 注意事项
1. 应避免多次冻融样品,因为每次冻融都大大降低完整DNA的产率。
2. 加氯仿充分混匀,若离心后上清不到500 ?l,可适当延长离心时间或增加离心速度。
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3. 吸取DNA上清时,可用剪刀稍剪枪头尖部,以防止虹吸现象。
4. 操作步骤中许多数值可进行成比例改变,如上清与预备液按1:1,氯化钠与无水乙醇按1:3等。
5. 转录活性很高的组织或细菌中通常含有大量的RNA,他们可能与DNA一起被分离出来。RNA的存在并不影响PCR反应。如果需要制备RNA-free的基因组DNA。可在第6步加入200 ?l的RNase A,37 ℃保温10 min即可。
6. 用分光光度计测量DNA含量按1 OD260=50 ?g基因组DNA;进行0.7%琼脂糖凝胶电泳判定DNA的完整性,也可以判定样品中是否有RNA。本试剂盒可抽提长抵达50kb以上的DNA。一般在DNA样品中,OD260/OD280比值大于1.8,可能存在RNA;OD260/OD280比值小于1.6,可能存在蛋白质或酚。但RNA样品中OD260/OD280比值小于2可能存在蛋白质或酚,均需要进一步纯化。
7. 通常50?l体系PCR反应中用1~5 ?l DNA。
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