一）实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

（二）试剂与器材

1.试剂：

（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH配制。

（2）双缩脲试剂：称以1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。

2.器材：

可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。

（三）操作方法

1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20~25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。

2、样品的测定：取2~3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。

三、Folin—酚试剂法（Lowry法）

（一）实验原理

第二篇：双缩脲法测葡萄酒中蛋白质

双 缩 脲 法 测 定 葡 萄 酒 中 的 蛋 白 质

一、 实验目的

蛋白质是引起葡萄酒 ,尤其是白葡萄酒沉淀的主要因素之一。葡萄酒中的蛋白质主要来 源有两个:一是来源于葡萄;二是来源于加胶处理的胶剂。葡萄酒在装瓶甚至制成成品酒之前,通过测定酒中蛋白质的含量,可以防患于未然。

双缩脲法较为方便、准确，能够很好满足日常检验和指导生产的需要。

二、 基本原理

蛋白质用磷钼酸沉淀 ,再用双缩脲反应显色 ,用标准线法定量。 所谓双缩脲反应是指尿素加热至180℃时 ,两分子尿素缩合放出一个分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性溶液中与铜离子结合 , 生成复杂的紫红色化合物的反应。其反应式如下 :

而蛋白质中含有多个与双缩脲结构相似的键。因此 ,也能有双缩脲反应 ,形成紫红色络合物 ,在一定的范围内 ,其颜色的深浅与蛋白质含量成正比 ,可用于肽含量的比色测定。

三、 主要仪器

1. 离心机 15000r/min

2. 分光光度计 可见光范围

四、 主要试剂

1. 磷钼酸试剂 : 5 .00g磷钼酸溶于水中，加15 ml硫酸、5.00g

硫酸钠以0.25g葡萄糖 ,溶后稀释至100ml。

2. 0. 30 mg/ ml蛋白质标准溶液 : 称取0 . 3000g蛋白质 ,溶

于水中 ,稀释1000 ml 。

3. 3 .0% ( w /v )氢氧化钠溶液 :称取3 .0g氢氧化钠溶于水

中 ,稀释至100ml。

4. 2 0% ( w / v )硫酸铜溶液 :称 20g硫酸铜容于水中，稀释

至100ml 。

五、 实验步骤

1. 标准曲线的制备 :在10个100 ml的容量瓶中 ,用吸管分别吸入10 、 20 、 30 、 40 、 50 、 60 、 70 、 80 、 90 、 100 ml蛋白质标准溶液 ,用水稀释至刻度(相当于蛋白质含量30 、 60 、 90 、 120 、 150 、 180 、 210 、 240 、 270 、 300m g / L ) , 吸取20 ml稀释后的各标准溶液 ,各加 30 . 0ml磷钼酸溶液 ,放置15 -20h。 以 15000r/min速度离心15min , 滗出一层清液 ,用10 m l乙醇溶解残留物 ,混匀 ,再次离心10 m in , 滗去乙醇溶液 ,加入 0 . 50 ml 3.0%氢氧化钠溶液 , 激烈振荡1min ,放置2h 后 . 再离心10min, , 并用滤纸过滤。在波长530mm ,用10mm比色皿 , 测定每一显色后标准溶液的吸光度 ,以吸光度对标准溶液浓度作图 , 绘制标准曲线 。

2 . 测定 :取20 .0 ml试样与30 .0 m l磷钼酸混合 ,按标准曲线制

备的方法继续操作，测量吸光度。

3 . 空白试验 :如果所得蛋白沉淀的颜色较深 ,则另取一份20 . 0

ml试样 ,除不加硫酸铜和加入总量为10 . 25 ml 3 .0%氢氧化钠溶液外 ,其余按测定操作制成空白溶液 , 也在同样条件下测量吸光度。

4． 结果计算 :由试样吸光度或试样吸光度与空白吸光度之差 ,

从标准曲线中查得蛋白质浓度 , 即为每升试样中含蛋白质的毫克数 。