实验八  双缩脲法测定面粉中蛋白质的含量

一、目的要求

1．学习双缩脲法的基本原理及操作。

2．通过实验学会制作标准曲线。

二、实验原理：

双缩脲（NH₃CONHCONH₃）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO₄形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。在一定的浓度范围内，紫色络合物颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系（即：颜色的深浅与蛋白质浓度成正比）而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可在540nm处比色用来测定蛋白质含量。测定范围为1－10mg蛋白质/ml。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。

    此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

三、操作方法：

1．标准曲线的制作。酪蛋白：10mg/ml（如果用干酪素来配制则需用0.05M NaOH做溶剂，也可以用酪蛋白酸水解物直接配制。）

计算出各管浓度（计算出各管浓度，再做标准曲线，那么最后计算的公式中就不用除以6了，这么做好理解些。）

混匀，放置30分钟后，在540nm处以1号管调0点，测定各管吸光度，以吸光度（OD值）为纵坐标，蛋白质浓度（酪蛋白的毫克数）为横坐标绘制标准曲线。

四、样品处理

1．0.25g小麦面粉＋0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂（四氯化碳为有机溶剂，在这里作为分散剂，使面粉不成团。）；

2．加塞，在摇床上振摇30分钟，使之充分混匀、反应，然后于实验台上静置10分钟；

3．离心，4000rPm，离心15分钟；

4．取上清比色：OD 540 nm；（在用滴管取上清时要轻、缓，避免沉淀物上浮。对照管是以介质溶液调零，即去除样品后的溶剂，在这里为0.5ml四氯化碳＋25ml双缩脲试剂。）

五、计算

OD值所对应的蛋白质毫克数×25.5/6/200 ×100％ 即面粉中酪蛋白的百分含量。

『双缩脲试剂』：取 1.5g 硫酸铜（CuSO₄·5H₂O)和 6.0g 酒石酸钾钠（NaKC₄H₄O₆·4H₂O）溶于500ml蒸馏水中,搅拌加入300ml的10％NaOH（或KOH）（可另加 lg KI以防止Cu²⁺自动还原成一价氧化亚铜沉淀），用水稀释至l000ml。此试剂存于棕色瓶中避光可长期保，若有黑色沉淀产生需重配。

【注意事项】

标准曲线绘制和样品测定应使用同一台分光光度计。注意事项

（1）本法应用范围，因不同书籍报道，数值不一。本实验方法测定范围1—10mg蛋白质/ml。

（2）须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生混浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

 

第二篇：实验十七双缩脲法测定血浆总蛋白质含量

实验十七   双缩脲法测定血浆总蛋白质含量

  蛋白质生命的基础，任何生命离不开蛋白质，本实验为了提高同学们的自主动手能力，培养同学们有序化的操作能力，以便各同学在今后的工作中有更出色的表现，不仅能够丰富各同学的知识，而且也能够增强各同学的自信心。

1、实训应用 ：检测蛋白质的含量，例如:检测食品中蛋白质含量是否达到标准，检测血清中的蛋白质是否出现异常等等。

2、实训原理

凡含有两个以上肽键的化合物在碱溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色复合物，这一反应称为双缩脲反应。蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连接起来的，因而可与双缩脲试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。

3．试剂的配制

  3.1    双缩脲试剂：称取硫酸铜1.5g加水100ml，加热助溶。另取酒石酸钾钠6.0g，碘化钾5g，溶于500ml水中。两液混匀后，在搅拌下加10%NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释至1000ml，储存在塑料瓶中。此液可以长期保存。若储存瓶中有黑色沉淀析出，需重新配置。

  3.2    1%蛋白质标准溶液。

  3.3    分光光度计。

4、主要器材

本次实训分为六大组，每大组再分成四个小组，以下为本次实训要器材及数量：试管（150支）  500ml烧杯（6个）  小烧杯（45个） 1000ml容量瓶（6个）  10ml量筒（46个）    胶头滴管（46个）  玻璃棒（6个）  塑料瓶（6个）  分光光度计（180个）  移液管或10ml量筒（46个）

5．实验安排

本班生物实验分为六大组，本次实验每大组再分成四个小组，要求自主配试剂（人员自行安排，该洗的还是要洗一下）。在配好本实验所需的试剂后，每组再分成两人一组完成本次实验.

注意事项

5.1    分光光度计的盖要轻拿轻放，拿器皿时，手必须拿在粗糙面;器皿外有水时用吸水纸吸干，用擦纸一次擦干（不能来回擦拭）。

5.2    使用时检查光测是否是透视比

5.3    使用前必须先打开盖子调0，盖上是出现100，连续两次出现0与100时，方可使用

6．实训操作 ：

6.1标准曲线的绘制：取小试管6支，按下表：

表5-1  实训的具体操作

按上表混合后，于37⁰C水浴中放置15分钟，在520nm波长下比色;以第6管调节零点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

如下图：

6.2样品测定：取血清0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于37⁰C水浴中放置15分钟，以第6管调节零点，测定吸光值，根据吸光度值查标准曲线求出血清蛋白质浓度。

思考:

血浆蛋白浓度增高和降低的原因；蛋白质测定的临床意义

7.评分标准：

7.1    实验前是否有预习……………………………………….10分

7.2    有无穿白大褂……………………………………………10分

7.3    有无玩手机,无所事事……………………………………10分

7.4    有无同学不配合不服从组长的安排……………………10分

7.5    使用分光光度计时,操作是否正确………………………30分

7.6    实验时试剂的配制是否正确，时间在20分钟内………20分

7.7    实验结束后,有无整理实验台……………………………10分