实验三 双缩脲法测定蛋白质含量
目的
1．掌握双缩脲法测定蛋白质的具体操作和原理；
2．了解蛋白质测定在生命科学中的应用。
原理
双缩脲反应是指双缩脲在硷性溶液中能与Cu2+络合生成紫红色物质。双缩脲可由脲缩合而成。
蛋白质分子的肽链结构在硷性中也能与Cu2+络合生成紫红色络合物，因其反应机制相似，就把蛋白质的这一反应称为蛋白质的双缩脲反应。
由于参与反应的是蛋白质的肽链结构，与组成蛋白质分于肽链氨基酸残基的侧链功能基关系较小。因此，不同蛋白质的双缩脲反应基本相似。利用双缩脲反应生成的有色物质作蛋白质的比色测定受蛋白质种类的影响较小。这是本法的优点之一。此外试剂和操作的简单也是其优点。缺点是灵敏度较低，能测出的蛋白质浓度约须在0.5mg／ml。
本实验用双缩脲法测定血清的总蛋白质浓度。如结合盐析法(饱和硫酸钠)分离白蛋白和球蛋白还可用于血清白蛋白和球蛋白浓度及其比值(A／G)的测定。
器材
1．试管及试智架
2．0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)
3．1ml、2ml、5ml刻度吸管
4．721型分光光度计
试剂
1．0.9％NaCl
2．双缩脲试剂 称取CuSO45H2O结晶(AR级试剂)1.5g,酒石酸钾钠(AR级试剂)6.0g溶于500ml水中，添加10％NaOH 300ml及KI1.0g．混匀后加水稀释至1000ml。本试剂可长期保存。
3．牛血清白蛋白标准液 此溶液可用于替代标准血清。称取试剂级冻干牛血清白蛋白300mg置lOOml容量瓶中，用0.9％NaCl溶解后稀释至刻度，避免振摇起泡，置4℃冰箱保存。此标准液浓度为300mg／m1。
4．被检血清样本
操怍
1. 取试管1支，以0.2m1微量吸管(或200ul微量加液器)吸取被检血清0.200ml(吸管外壁须用滤纸片拭净)。慢慢放入试管底部。最后一点液体应吹出，靠落在试管壁上。
2．加入0.9%NaCl 3.80ml,充分混匀但不要振摇起泡。
3．另取试管二支，标上号码，其一用吸管加入操作2所准备的血清样本稀释液1.00ml另一管加入牛血清白蛋白标准液1.00ml。二管各加入双缩脲试剂4.00m1，混匀，放置半小时后以1m1蒸馏水加4m1双缩脲试剂作空白调节比色计零点，选用蓝色滤光片或500nm波长光作比色。
4．计算
思考题
1.为什么稀释血清样本时应避免振摇起泡?
2.是否可用硫酸铵盐析分离白蛋白和球蛋白结合用双缩脲法分别测定这两个血清蛋白质的组份试讨论之。
第二篇：实验十七双缩脲法测定血浆总蛋白质含量
实验十七 双缩脲法测定血浆总蛋白质含量
蛋白质生命的基础，任何生命离不开蛋白质，本实验为了提高同学们的自主动手能力，培养同学们有序化的操作能力，以便各同学在今后的工作中有更出色的表现，不仅能够丰富各同学的知识，而且也能够增强各同学的自信心。
1、实训应用 ：检测蛋白质的含量，例如:检测食品中蛋白质含量是否达到标准，检测血清中的蛋白质是否出现异常等等。
2、实训原理
凡含有两个以上肽键的化合物在碱溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色复合物，这一反应称为双缩脲反应。蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连接起来的，因而可与双缩脲试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
3．试剂的配制
3.1 双缩脲试剂：称取硫酸铜1.5g加水100ml，加热助溶。另取酒石酸钾钠6.0g，碘化钾5g，溶于500ml水中。两液混匀后，在搅拌下加10%NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释至1000ml，储存在塑料瓶中。此液可以长期保存。若储存瓶中有黑色沉淀析出，需重新配置。
3.2 1%蛋白质标准溶液。
3.3 分光光度计。
4、主要器材
本次实训分为六大组，每大组再分成四个小组，以下为本次实训要器材及数量：试管（150支） 500ml烧杯（6个） 小烧杯（45个） 1000ml容量瓶（6个） 10ml量筒（46个） 胶头滴管（46个） 玻璃棒（6个） 塑料瓶（6个） 分光光度计（180个） 移液管或10ml量筒（46个）
5．实验安排
本班生物实验分为六大组，本次实验每大组再分成四个小组，要求自主配试剂（人员自行安排，该洗的还是要洗一下）。在配好本实验所需的试剂后，每组再分成两人一组完成本次实验.
注意事项
5.1 分光光度计的盖要轻拿轻放，拿器皿时，手必须拿在粗糙面;器皿外有水时用吸水纸吸干，用擦纸一次擦干（不能来回擦拭）。
5.2 使用时检查光测是否是透视比
5.3 使用前必须先打开盖子调0，盖上是出现100，连续两次出现0与100时，方可使用
6．实训操作 ：
6.1标准曲线的绘制：取小试管6支，按下表：
表5-1 实训的具体操作
按上表混合后，于370C水浴中放置15分钟，在520nm波长下比色;以第6管调节零点，测得各管的吸光度值。以各管的吸光值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
如下图：
6.2样品测定：取血清0.1ml，加生理盐水0.9ml，再加双缩脲试剂4.0ml，于370C水浴中放置15分钟，以第6管调节零点，测定吸光值，根据吸光度值查标准曲线求出血清蛋白质浓度。
思考:
血浆蛋白浓度增高和降低的原因；蛋白质测定的临床意义
7.评分标准：
7.1 实验前是否有预习……………………………………….10分
7.2 有无穿白大褂……………………………………………10分
7.3 有无玩手机,无所事事……………………………………10分
7.4 有无同学不配合不服从组长的安排……………………10分
7.5 使用分光光度计时,操作是否正确………………………30分
7.6 实验时试剂的配制是否正确，时间在20分钟内………20分
7.7 实验结束后,有无整理实验台……………………………10分