实验四 质粒DNA的提取、电泳检测和酶切
一、实验目的
学会用碱裂解法小量制备质粒DNA。
二、实验原理
质粒DNA是存在于细菌中的环状小分子DNA，不同于长链大分子的基因组DNA，游离于细胞质中。由于细胞中的RNA可以被降解，大分子DNA可与细胞碎片一起沉淀而与质粒DNA分离。质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。 其原理为：在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时，生成不溶的PDS, 这些复合物从溶液中沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNA酶（RNAase）消除。再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。
三、实验材料
含有质粒pUC19的大肠杆菌菌株DH5a。
四、实验器具、药品试剂
A、实验材料：
? DH5a受体菌
? pUC19
B、实验仪器
? 高压灭菌锅
? 超净工作台
? 恒温摇床取
? 台式离心机(冷冻或非冷冻式)
? 旋涡振荡器
? 电泳仪
? 凝胶成像系统
? 培养用试管
? 量筒
? 冰盒
? 微量取液器（2ul，20ul，150ul，1000ul）
? 吸管头若干（2ul，20ul，150ul，1000ul）
? EP管若干
? 一次性手套若干
C、溶液药品：
? LB培养基
? 氨苄青霉素(Amp,100 mg/ml)
? 20%SDS
? 4 M NaOH
? 3M NaAc (pH5.2)
? 异丙醇
? TE缓冲液(pH8.0)
?
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溶液I－GET缓冲液：
50 mmol/L葡萄糖，
10 mmol/L EDTA，
25 mMTris-HCl pH8.0。
溶液II（现配现用）－0.2 mol/L NaOH,
1%SDS
溶液III (4℃预冷)－乙酸钾溶液(3M,5M？ pH=4.8)：
60 mL的5 mol/L KAc,
11.5 ml冰醋酸，
28.5 mL H2O
TE缓冲液或双蒸水（+ 20 ?g/ml RNase ）:
10 mmol/L，Tris-HCl,
1 mmol/L，EDTA ， pH8.0,
五、实验方法
（一）质粒DNA的提取
1 在超净工作台上将2份5 ml含有50 ug /mL Amp的LB培养液加入已灭菌的试管中，
2 挑取数个单菌落（含有50ug/ml氨苄的LB平板，含pUC19质粒）的DH5a菌液，接入上述5 mL含有氨苄青霉素（50 ?g/ml）培养基中，37℃摇床150rpm培养5小时，培养基明显浑浊。
3 取1.5 ml菌液于1.5 ml离心管中，12000 r/min离心2 min，去上清液。
4 在沉淀中加入150 ?l溶液I，盖上盖后在漩涡振荡器上混匀，充分悬浮菌体，置冰上5 min。
5 加入300 ?l新配制的溶液II（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀;不要强烈混匀。置冰上5 min。
6 加入225 ?l溶液III，加盖后颠倒6-7次，加盖颠倒6-7次使之温和混匀，置冰上15 min。 RNAase A(10 mg/ml) 70%乙醇 无水乙醇 75％乙醇， NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)， EcoR I 及Dra I（Dra II？）限制性核酸内切酶（TaKaRa）， EcoRI酶解缓冲液(10×H buffer) 10%琼脂糖 电泳缓冲液 EB染色液
7 12000 r/min离心5 min，上清移入另一干净离心管，加入等体积的氯仿/异戊醇（12:1），反复倒置2 min，充分混匀；
8 12000 r/min离心10 min，上清移入另一干净离心管，并加60%体积的异丙醇混匀，12000 r/min离心10 min，弃去上清液（注意沉淀的位置）;
9 沉淀加1 ml 70-75％乙醇，倒置1-2次，10000 r/min离心5 min，弃去上清液，可见黄色沉淀块。重复上述洗盐过程一次。小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥（10-15分钟），至管壁内无水珠;
10 其中一份加入20 ?l含有20 ?g/ml RNase（无DNAse）的TE 缓冲液溶解提取物，另一份加入20 ?l TE 缓冲液溶解提取物，反复弹离心管100次，1000rpm离心20秒。（RNase处理方法：Takara，10mg/ml，先将RNase用其自身稀释液稀释50倍至200ug/ml，去2ul加入20ulTE，其终浓度为20ug/ml。）
11 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。
（二）质粒DNA质量检测
琼脂糖凝胶电泳检测，原理和方法见实验一和实验三。
电泳结果：RNase处理的结果中没有RNA，pUC19质粒两条带清晰，大小正常。没有RNase处理的结果中有大量RNA，pUC19质粒两条带存在，大小正常。
←2000bp
←1000bp
←750bp
←500bp
超螺旋快于线性，线性快于开环。（碱法提的质粒三条带中有螺旋，开环另外一条不是线性的DNA，在提
取中线性DNA容易被降解，所以两条带。
）
（三）质粒DNA的酶切
酶切体系25 μl，做4组：
第一组
质粒来源
10 × 酶切缓冲液
（M）
质粒DNA
EcoRI
Dra I
无菌双蒸水 1号管质粒 2.5 μl 第二组 1号管质粒 2.5 μl 第三组 2号管质粒 2.5 μl 第四组 2号管质粒 2.5 μl 7.5μl （0.5~1.0 7.5μl 7.5μl （0.5~1.0 7.5μl（0.5~1.0 μg） （0.5~1.0 μg） μg） μg） 1 μl 1 μl 13 μl 不加 不加 13 μl 1 μl 1 μl 13 μl 不加 不加 13 μl
酶切缓冲体系EcoRI为H，但是在M体系活性为100%；酶切缓冲体系Dra I为M，两种酶均为Takara酶。因
此，使用M缓冲体系。
混匀酶切反应物后，于37℃下酶切2 h。
←2000bp 1176bp→
799 bp→
692 bp→ ←1000bp ←750bp
←500bp
六、注意事项
用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免细菌基因组DNA污染!
七、思考题
（1）质粒的基本性质有哪些？
（2）在碱法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？
附录：
pUC18 和 pUC19质粒图谱
pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注册号为 L08752(pUC18)和 X02514(pUC19)。由 pBR322 改造而来，其中 lacZ (MSC)来自 M13mp18/19 图 3-4 是其质粒图谱。
这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。
特征序列区位：
pBR322_origin 1471 - 852
Ampicillin 2486 - 1626
lac_promoter 543 - 514
AmpR_promoter 2556 - 2528
M13_pUC_rev_primer 500 - 478
M13_reverse_primer 479 - 461
M13_forward20_primer 379 - 395
M13_pUC_fwd_primer 364 - 386
lacZ_a 398 - 250
pGEX_3_primer 51 - 29
Orf2 2486 - 1626
NOS terminator sequence:
ggatccatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttgtttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacacgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagtaatcgat
设计引物：
Forward primer: 5’ ggaGGATCCggatccatcgttcaaac 3’ (含BamH I 位点GGATCC及三个保护碱基) Reverse primer: 5’ atcGAATTCATCGATTACTAGTAACATAG 3’ (含EcoR I 位点GAATTC及三个保护碱基)
请查一下NOS终止子序列内有没有这两个酶切点。如果没有，引物合成后，以任何一种pCAMBIA为模板都能扩增到该终止子序列。
DraI在pUC19上有3个切点，分别位于1563,1582,2274，所切片段为：19,692,1975bp。 EcoR I pUC19上有1个切点，位于396，所切片段为：2686bp。
双酶切后，切点位于：396，1563,1582,2274。所获片段4个，大小分别为： 19,692,799,1176bp
第二篇：质粒DNA的提取与纯化实验教案 100字
1、质粒DNA的提取与纯化实验教案
2、质粒DNA的酶切与电泳检测实验教案
3、植物基因组DNA的提取和纯度鉴定实验教案
4、聚合酶链式反应（PCR）基因扩增实验教案
5、DNA体外重组实验教案
6、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验教案
┣ 质粒DNA的提取、纯化与鉴定 7400字
┣ 质粒DNA提取 1900字
┣ 质粒提取简介及问题分析 6900字
┣ 分子生物学实验 目录 36200字
┣ 更多质粒的提取实验报告
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