学院：环境科学与工程学院    班级：11级环境科学（2）班

姓名：李宝携   学号： 3111007398

实验3  多管发酵法检测水中的大肠菌群

一、实验目的

（1）了解饮用水和水源水大肠菌群的原理和意义。

（2）学习检测水中大肠菌群的方法。

二、实验原理

大肠菌群是评价水质好坏的一个重要的卫生指标，也是反映水体被生活污水污染的一项重要监测项目。

大肠菌群是一群以大肠埃希氏菌为主的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在37℃生长时，能在48小时内发酵乳糖并产酸产气。我国生活饮用水卫生标准中规定一升水样中总大肠菌群数不超过三个。

多管发酵法包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管。当发酵产酸时，溴甲酚紫可由紫色变为黄色，乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气。

三、实验材料

1、水样

中心湖湖水

2、试剂

三倍浓缩乳酸蛋白胨培养液

3、仪器及其他用品

试管、发酵管、烧杯、量筒、移液枪、高压灭菌锅

四、操作过程

1、取16支发酵管，其中5支加入5mL三倍乳糖蛋白胨培养液。取35mL三倍乳糖蛋白胨培养液于烧杯中，量取70mL水进行稀释，将三倍乳糖蛋白胨培养液稀释成一倍的乳酸蛋白胨培养液，分别取10mL一倍的乳酸蛋白胨培养液与10支试管中，最后， 1支加入9ml自来水。

2、完成后包装好，于121℃高压灭菌锅中灭菌30min左右。

3、灭菌完毕，冷却后，在无菌操作条件下，向装有三倍的乳酸蛋白胨培养液的5支试管加入10ml水样，向装有一倍的乳糖蛋白胨培养液的5支试管中加入1ml水样。取1mL的水样于装有9mL自来水的试管中，混合摇匀，并分别移1mL于另外的5支10mL的试管中。

4、 将各试管充分混均，包装完成，将其置于37℃恒温箱中培养24h。

5、取出培养液，观察试管的颜色及其中的气泡数并记录数据。

6、观察完毕，清洗仪器并整理数据。

五、实验结果

实验现象：有些试管的颜色变成黄色，并且有些试管中的发酵管的底部存在气泡，说明存在产酸产气的大肠杆菌。

表1—实验数据记录

查表得每升水源的大肠菌群数，并将结果填入表中

表2-水源水样中大肠菌群

六、思考题

1、为什么要选择大肠菌群作为水源被肠道病原菌污染的指示菌？

答：（1）大肠杆菌与消化道病原菌的来源一致，如果水源中检测出大肠菌落，则说明很大可能存在肠道病原菌。

（2）大肠杆菌具有较强的抗逆性。

（3）大肠杆菌存在的可能性比较大，而肠道病原菌数量少，即使检出为阴性，也很难保证没有病原菌存在。

（4）大肠杆菌的特性比较特殊，比较容易检测。

七、实验心得

这次试验比较简单，主要是了解大肠杆菌作为指示菌的特性，产酸产气、和它新城代谢的产物所表现出来的特定现象，即倒扣的发酵管中的气泡和黄色。

第二篇：实验二 多管发酵法测定水中大肠菌群总数

实验二  多管发酵法测定水中大肠菌群总数

    一．实验目的和要求

1．掌握多管发酵法测定水中大肠菌群的技术。

2．巩固细菌学检验法的内容。

二．原理

总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（most probable number），简称MPN表示。

三．仪器

(1)高压蒸气灭菌器。

(2)恒温培养箱、冰箱。

(3)生物显微镜、载玻片。

(4)酒精灯、镍铬丝接种棒。

(5)培养皿（直径100mm）、试管（5×150mm），吸管（1、5、10mL）、烧杯（200、500、2000mL）、锥形瓶（500、1000mL）、采样瓶。

四．测定步骤

1．生活饮用水：

①初发酵试验：在两个装有已灭菌的50mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的大试管或烧瓶中（内有倒管），以无菌操作各加入已充分混匀的水样100mL。在10支装有已灭菌的5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），以无菌操作加入充分混匀的水样10mL混匀后置于37℃恒温箱内培养24h。

②复发酵试验：上述涂片镜检的菌落如为革兰氏阴性无芽孢的杆菌，则挑选该菌落的另一部分接种于装有普通浓度乳糖蛋白胨培养液的试管中（内有倒管），每管可接种分离自同一初发酵管（瓶）的最典型菌落1～3个，然后置于37℃恒温箱中培养24h，有产酸、产气者（不论倒管内气体多少皆作为产气论），即证实有大肠菌群存在。根据证实有大肠菌群存在的阳性管（瓶）数查附表1“大肠菌群检数表”，报告每升水样中的大肠菌群数。

2．水源水

①于各装有5mL三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入10mL水样；于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL水样；再于各装有10mL乳糖蛋白胨培养液的5个试管中（内有倒管），分别加入1mL 1∶10稀释的水样。共计15管，三个稀释度。将各管充分混匀，置于37℃恒温箱内培养24h。

②根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表2“最可能数（MPN）表”，即求得每100mL水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L为报告单位，故MPN值再乘以10，即位1L水样中的总大肠菌群数。

例如，某水样接种10mL的5管均为阳性；接种1mL的5管中有2管为阳性；接种1∶10的水样1mL的5管均为阴性。从最可能数（MPN）表中查检验结果5～2～0，得知100mL水样中的总大肠菌群数为49个，故1L水样中的总大肠菌群数为49×10=490个。

对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应做1∶10、1∶100、1∶1000或更高倍数的稀释，检验步骤同“水源水”检验方法。

如果接种的水样量不是10mL、1mL和0.1mL，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得MPN指数，再经下面公式换算成每100mL的MPN值：

附表1  大肠菌群检数表

接种水样总量300mL（100mL2份，10mL10份）

附表2  最可能数（MPN）表

（接种5份10mL水样、5份1mL水样、5份0.1mL水样时，不同阳性及阴性情况下100mL水样中细菌数的最可能数和95%可信限值）

五、试验结果计算及分析。