第一章绪论

1.微生物发酵工程:是利用“生物细胞”的特定功能，通过现代工程技术手段（主要是发酵罐、生物反应器的自动化、高效化、功能多样化和大型化）生产各种特定的有用物质、或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种生物技术体系。

2.发酵工艺过程的主要内容：

⑴发酵原料的选择及预处理

⑵微生物菌种的选育及扩大培养

⑶发酵设备选择及工艺条件控制

⑷发酵产物的分离提取

⑸废弃物的回收和利用

3.发酵工程的特点：

①发酵工程使用的原料来源广泛，多为农副产品，其中以碳源为主，只加入少量有机和无机氮源，不含有毒物质。

②发酵工程的反应过程比较温和，通常在常温、常压下进行。而且，反应过程是以生物体的自身调节方式进行，多个反应就像是一个反应一样，可在单一设备中进行，因此一种设备可有多种用途。

③容易进行复杂的高分子化合物的生产，如酶、化学活性体等。

④能够高度选择性地进行复杂化合物在特定部位的反应。

⑤生产产品的微生物菌体本身也可作为发酵产物。例如，富含蛋白质、酶、维生素的单细胞蛋白等。

⑥发酵过程是纯种培养过程。生产中使用的设备、管道、截门和培养基都必须严格灭菌，通入的空气也应该是无菌空气。在操作中应特别注意严格防止染菌，尤其要防止噬菌体的侵入，否则，会引起重大的损失。

⑦在不增加任何设备投资的情况下，通过菌种选育，改良菌种的生产性能来提高生产能力，可以达到事半功倍的效果。

⑧在发酵生产中，还可以通过改进工艺技术和设备来提高产品的产量和质量。

第二章工业发酵菌种选育

工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵工艺和后提取工艺三个因素

1.初级代谢产物：微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，这些产物称为初级代谢产物。

2.次级代谢产物：次级代谢是指微生物在一定的生长时期（一般是稳定生长期），以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的活动没有明确功能的物质的过程，这一过程的产物即为次级代谢产物。

3.工业发酵对生产菌种的一般要求：

⑴菌种能在廉价原料制成的培养基上迅速生长和繁殖，并且生成所需的代谢产物要高。⑵菌种可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长和发酵，且所需的酶活性高。⑶菌株生长速度和产物生成速度应较快，发酵周期较短。

⑷根据代谢控制的要求，选择单产高的营养缺陷型突变菌株、调节突变菌株或野生菌株。⑸选择一些不易被噬菌体感染的菌株。

⒃生产菌株要纯粹，不易变异退化，以保证发酵生产和产品质量的稳定性。

菌种是基础，是基石，是发酵可以成功的关键！

4.自然选育：在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自发突变，而进行菌种筛选的过程，称为自然选育或自然分离

5.自然选育的主要步骤：标本采样、标本材料的预处理、富集培养、菌种初筛、菌种复筛、

第二篇：发酵工程总结2

发酵工程总结 王玉真

第一章 绪论

一．发酵工程：是应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进行酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性服务的一门科学。由于它以培养微生物为主，所以又称为微生物工程。

※从广义上讲，有三部分组成：上游工程，发酵工程，下游工程

二．发酵的定义

1.传统发酵发酵（fermentation）最初是来自于拉丁语“发泡”（ferver）这个词，是指酵母作用于果汁或发芽的谷物时产生二氧化碳的现象。

2.生化和生理学意义的发酵：指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式；或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。

3..工业上的发酵：泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程。

三．※发酵工业产业化应抓好哪三个环节？

发酵工程产业化:就是将有关应用微生物的科学研究成果转化为发酵产品，并投向市场的过程。

三个环节：投产试验、规模化生产和市场营销。

①投产试验：涉及到”上、中、下三游”工作，即研究成果的验证、小试、中试和扩大试验。

②规模化生产：值得注意的是产品质量问题，其检测必须符合相应产品标准。

③市场营销：市场开拓对技术本身影响不大，但参与市场竞争却是产业化成败的决定因素。

四．※当前发酵工业面临三大问题：1.菌种问题(纯种;遗传稳定性;安全;周期短、转化率高产率高;抗污染能力强：噬菌体、蛭弧菌);2.合适的反应器(生产规模化;原料利用量大，并且具有一定选择性;节能;结构多样化、操作制动化;节省劳力);3.基质的选择(价廉;原料利用量大，并且具有一定选择性;易被利用;副产物少;满足工艺要求)

第二章 菌种的来源

一．自然界分离微生物的一般操作步骤？

1、※菌种分离的一般过程：标本采集 → 预处理 → 富集培养 → 菌种分离（初筛、复筛）→ 性能鉴定 → 菌种保藏 目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物

2、微生物材料的标本采集：遵循原则：材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种

一般通过以下途径获得菌种：①向菌种保藏机构索取有关菌株；②由自然界采集样品，如土壤、水、动植物体等；③从一些发酵制品中分离目的菌株，如从酱油中分离蛋白酶产生菌，从酒醪中分离淀粉酶或糖化酶的产生菌。

自然界中微生物极其丰富，土壤是微生物最集中的地方，所以土壤样品往往是采集的首选目标。 土样采集应注意以

下问题：A、不同的土壤特点 B、地理和气候条件C 、微生物的生理特性 D 、极端环境条件下采样分离

3、标本的预处理：（P16 表2-2）（1）物理方法：加热(55℃,6min；100℃,1h；40℃ 2-6h)、膜过滤法、离心法、空气搅拌法（2）化学方法：含1%几丁质培养基、用CaCO3提高pH值进行培养（链霉菌属）（3）诱饵法：用涂石蜡的棒置于碳源培养基中（诺卡氏菌）、花粉（游动放线菌）、蛇皮（小瓶菌属）、人头发（角质菌属）

4、目的微生物富集的一些基本方法：

富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株。

富集的基本方法：（1）、控制营养：如以唯一碳源或氮源作底物；表2-3 P17（2）、控制培养条件：如pH、温度、通气量等；（3）、抑制不需要的种类。表2-4 P17

富集培养方法：（1）、分批式富集培养P18：指将富集培养物转接到新的同一种培养基中，重新建立选择性压力，如此重复几次后，再取此富集培养物接种至固体培养基上，以获得单菌落。转种是关键。（2）、恒化式富集培养P18：通过改变限制性基质浓度，来控制两类不同菌株的比生长速率。

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5、菌种分离：

（1）、常规分离法：平板划线法、稀释分离法和涂布法

（2）、生化反应分离法：透明圈法、变色圈法、抑菌圈法、生长圈法。

透明圈法：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，这样能分解该底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈。 圈的大小可初步反映该菌株利用底物的能力，完全可以作为菌种初筛的判断标准。如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶及核酸酶产生菌的分离，产有机酸菌的初筛。

变色圈法：对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。

抑菌圈法：若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落的周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，被鉴别出来。

生长圈法：常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素等产生菌。其工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株，由于得到所需的营养，凡是目的微生物周围便会出现一个混浊生长圈。

二。从环境中分离目的微生物时，为何一定要进行富集富集？

富集的目的：让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。

富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基或创造有利生长条件，使目的微生物数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利于分离得到所需要的菌株。

三。 ※什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？

自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程称为自然选育。

意义：自然选育是一种简单易行的方法，可达到纯化菌种、防止菌种退化、稳定生产、提高产量的目的。虽然其突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。

五。※ 什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？

诱变育种：人工利用各种诱变剂诱发基因突变，再通过适当的筛选方法获得所需要的优良菌种的育种方法，称为诱变育种。

诱变剂：能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂

物理的：紫外线、快中子、x射线等；

化学的：硫酸二乙酯、亚硝基胍、Y啶类物质等；

生物的：噬菌体、转座子

诱变剂使用方法：1、紫外线诱变:新鲜斜面菌种+生理盐水或缓冲液洗下→振荡→稀释菌悬液→取5ml菌悬液→无菌培养皿→磁力搅拌→15W、30cm紫外灯（营养体3~5min，芽孢10min）照射→黑纸包好增殖培养→挑单菌落

2、化学诱变（以亚硝酸为例）亚硝酸易分解，故常在诱变前用亚硝酸钠在pH4.5的醋酸缓冲液中生成亚硝酸的方法现配现用。

处理真菌孢子：取孢子悬液2ml，加入1ml 0.1mol/L NaNO2溶液和1ml pH4.5醋酸缓冲液，27℃保温处理若干分钟（如10min）后，取出2ml加到10ml 0.07mol/L pH8.6的磷酸氢二钠缓冲液中，pH下降至6.8左右以后中止诱变。然后稀释涂平板，培养后挑单菌落进行选择。

处理细菌 :将出发菌株接入5ml肉汤中，于370C振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，加入数亳升无菌生理盐水，洗涤一次，离心后菌体悬浮在2.5ml0.1mol/L醋酸缓冲液中（pH4.5），然后加入2.5ml0.1mol/L亚硝酸钠，在370C处理数分钟（如5min）后稀释涂皿，培养后挑取单菌落，选择突变株。

3、航天育种:所谓航天育种是利用空间环境高真空、微重力和强辐射的特点，在宇宙射线的辐射作用下，使生物的遗传性状发生变异，从而选育出优良品种。19xx年以来，国防科工委相继组织了返地卫星和高空气球搭载微生物、动物细胞和植物种子，为微生物的诱变育种提供了新的手段。

六、※诱变育种对出发菌株有哪些要求？

出发菌株：出发菌株指用于诱变育种的最初菌株或每代诱变的试验菌株。

1.对菌株产量，形态、生理等情况了解；2.生长繁殖快，营养要求低，产孢子多且早；3. 对诱变剂敏感；4 菌株要有一定的生产能力；5.多出发菌株：一般采用3~4个出发菌株，在逐代处理后，将产量高、特性好的菌株留作继续 - 2 -

诱变的出发菌株。

八、※工业上优良生产菌种应具备哪些基本特性？

1.能在廉价原料制成的培养基上生长，且大量高效地合成产物；2.遗传性能要相对稳定；3.菌种改造的可操作性要强；4.抗噬菌体及杂菌污染能力强；5.产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病菌无关）；6. 发酵条件如温度、pH、溶解氧等易控制。

九．初级代谢和次级代谢的异同：(P40)

第三章 发酵培养基

二、 常用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些？……※速效碳源、氮源？？？

1、碳源 （P82）作用： 提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分 ；提供合成目的产物所必须的碳成分。来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃

2. 糖类：① 葡萄糖（速效碳源）② 糖蜜 ③ 淀粉 、糊精

三、 什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸铵；若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。

四、 常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？（P83）

1.无机氮源：铵盐、硝酸盐和氨水；特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。但无机氮源的迅速利用常会引起pH的变化。

2.工业上常用的有机氮源都是一些廉价原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟。

作用：除提供氮源外，有些有机氮源还提供大量的无机盐及生长因子。有机氮源除了作为菌体生长繁殖的营养外，有的还是某些产物的前体。

例 玉米浆（是用亚硫酸浸泡玉米而得的浸泡液的浓缩物 ），是一种很容易被微生物利用的良好氮源： ①含丰富的氨基酸、生长因子（生物素、苯乙酸）；②较多的乳酸；③丰富的硫、磷、微量元素等。

五、 什么是前体？前体添加的方式？

※前体：指某些化合物加入到发酵培养基中后，能直接使微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。

添加方式：前体使用时普遍采用流加的方法??1. 前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07% 2.流加也有利于提高前体的转化率3.前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化

六、 什么是生长因子？生长因子的来源？

※生长因子：从广义上讲，凡是微生物生长不可缺少的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。 如以糖质原料为碳源的谷氨酸生产菌均为生物素缺陷型，以生物素为生长因子,生长因子对发酵的调控起到重要的作用 。

有机氮源是这些生长因子的重要来源，多数有机氮源含有较多的B簇维生素和微量元素及一些微生物生长不可缺少的生长因子

七、 ※举例说明培养基设计的方法与步骤？

方法：①生态模拟②参阅文献③精心设计 ④试验比较

步骤：① 根据前人的经验和培养基成分，初步确定可能的培养基成分；② 通过单因素实验最终确定出最为适宜的培养基成分；③ 当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法。

例:类胡萝卜素高产菌Y11的培养基的优化

原培养基：类球红细菌Rhodobacter sphaeroides NH4Cl 1g，丁二酸钠1g， KH2PO4 0.2g ，MgSO4〃7H2O 0.005g， Na2CO3 0.2g，酵母膏0.1g，复合无机盐溶液1 mL，水1000mL，pH7.0 。

优化后的培养基：NH4Cl 2g，乙酸钠2g， KH2PO4 0.1g ，MgSO4〃7H2O 0.01g， Na2CO3 0.1g，酵母膏0.5g，复 - 3 -

合无机盐溶液0.05 mL，水1000mL，pH7.0 。

第四章 种子的扩大培养

二、※影响种子质量的因素是哪些？

1.原材料质量： 生产过程中经常会出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动：产地、品种、加工方法等。2。种龄：种龄过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、泡沫多、发酵周期延长以及因菌体量过少而菌丝结团，引起异常发酵等等；种龄过老的种子接入发酵罐后，则会因菌体老化而导致生产能力衰退。一般以对数生长期为好。3。培养条件：培养温度过低会导致菌种生长发育缓慢，过高会使菌种过早自溶。如果不是用最适温度培养，其生产能力就会下降。选择最适种子培养pH；最后一级种子的培养基pH应接近于发酵培养基的pH，以便种子能尽快适应新的环境。通气与搅拌（aeration and agitation ）足够的通气量可提高种子质量；搅拌可以提高通气效果，如果搅拌效果不好、搅拌时泡沫过多会使菌丝黏壁，甚至菌丝结团，影响种子质量。此外，丝状真菌，一般不宜剧烈搅拌。湿度：斜面培养基的湿度对孢子的质量有较大影响，湿度低孢子生长快，湿度高孢子生长慢。在南方相对湿度控制在35％～42％。孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。 4。斜面冷藏时间：对孢子的生产能力有较大的影响，通常冷藏时间越长，生产能力下降越多。

三、※保证种子质量有哪些措施？

①菌种的稳定性；②提供种子培养的适宜环境；③无杂菌侵入。无菌检查是判断杂菌的主要依据，通常采用镜检和无菌试验相结合。

四、※工业上接种的方法有哪些？

火焰接种法、微孔法、压差法

第五章 发酵过程控制(一)

一、※名词解释：摄氧率r、呼吸熵RQ、补料分批发酵、连续发酵、比生长速率

摄氧率(r或OUR)：单位体积发酵液单位时间内所需要的氧量。mmol ·L-1·h-1

CO2

：表示单位体积发酵液单位时间内释放的CO2量。

呼吸熵反映了氧的利用状况。RQ值随微生物菌种的不同，培养基成分的不同，生长阶段的

不同而不同。测定RQ值一方面可以了解微生物代谢的状况，另一方面也可以指导补料。

补料－分批发酵：是指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。

连续发酵：又称连续流动培养或开放型培养，即培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的培养方法。

比生长速率：每单位细胞浓度的生长速度率

二、※发酵代谢参数按性质分类有哪些？

物理参数：温度、搅拌转速、罐压、空气流量、溶解氧、泡沫、表观粘度、尾气氧（二氧化碳）浓度等。 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物浓度、核酸量等。

生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等。

三、※发酵参数的检测方式有哪几种？？？？？在线、离线、原位……

代谢参数：从检测手段分又可分为：直接参数、间接参数。直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参数， 如温度、pH、搅拌转速、残糖等。间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如菌体比生长速率、摄氧率、 KLa等。

直接参数又可分为: 在线检测参数和离线检测参数

在线检测参数：指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上得到的参数，如温度、pH、搅拌转速、泡沫等；离线检测参数：指取出样后测定得到的参数，如残糖、NH2-N、菌体浓度等。

第三节 温度变化及其控制

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一．※根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？

嗜冷菌：0～260C生长，嗜温菌：15～430C生长，嗜热菌：37～650C生长，嗜高温菌：>650C生长 。

二、 发酵过程的温度会不会变化？为什么?

会变化，发酵热是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快；发酵热小，温度上升慢。

三、发酵热：是发酵过程中释放出来的净热量。什么叫净热量呢？在发酵过程中产生菌分解基质产生热量、机械搅拌产生热量、通气热，而罐壁散热、水分蒸发、空气排气带走热量。这各种产生的热量和各种散失的热量的代数和就叫做净热量。

四、※ 生物热（Q生物）的大小与哪些因素有关？

在发酵过程中，菌体不断利用培养基中的营养物质，将其分解氧化而产生的能量，其中一部分用于合成高能化合物（如ATP）提供细胞合成和代谢产物合成需要的能量，其余一部分以热的形式散发出来，这散发出来的热就叫生物热。

1．生物热与发酵类型有关：微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。

2．培养过程中生物热的产生具有强烈的时间性。

生物热的大小与呼吸作用强弱有关：在培养初期，菌体处于适应期，菌数少，呼吸作用缓慢，产生热量较少。在对数生长期，菌体繁殖迅速，呼吸作用激烈，菌体也较多，所以产生的热量多，温度上升快，必须注意控制温度。培养后期，菌体已基本停止繁殖，主要靠菌体内的酶系进行代谢作用，产生热量不多，温度变化不大，且逐渐减弱。如果培养前期温度上升缓慢，说明菌体代谢缓慢，发酵不正常。如果发酵前期温度上升剧烈，有可能染菌，此外培养基营养越丰富，生物热也越大。

五、 温度对发酵有哪些影响？

1、温度影响反应速率（产物形成）：一般，发酵温度升高，酶反应速率增大，生长代谢加快，生产期提前。但温度过高酶又很容易失去活性，表现在菌体容易衰老，发酵周期缩短，影响最终产量。

2、温度会改变发酵液的理化性质：（P94）影响基质溶解度；氧的溶解度；影响菌体对某些基质的分解吸收；间接影响产物的合成。

3、温度影响生物合成的方向（P94）如，四环素发酵生产菌金色链霉菌可同时产生金霉素和四环素，当温度低于300C时，合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例也提高，温度达到350C时，金霉素的合成几乎停止，只产生四环素。

六、※ 发酵过程温度的选择有什么依据？

1、根据菌种不同选择：微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的生长温度范围也不同。

2根据发酵阶段选择：即二阶段发酵：最适温度分最适生长温度和最适产物合成温度，两者往往不同，各阶段可用不同温度。

3、根据培养条件选择：通气条件差时:可适当降低温度，可使菌呼吸速率降低些，氧溶解浓度也相应髙些。 培养基稀薄或较容易被利用时:温度也该低些。因为温度高营养往往过早耗竭，导致菌过早自溶，产量降低。

4、根据菌生长情况：菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可高些，以利于菌的生长。

第四节 发酵过程的pH控制

一、发酵过程中pH会不会发生变化，为什么？

1.基质代谢：（1）糖代谢:特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。（2）氮代谢:当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升；NH3利用后pH下降；当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸性物质、生理碱性物质: P99 利用后pH会下降或上升。

2．产物形成：某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如：有机酸类产生使pH下降、红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。

3、菌体自溶，pH上升；发酵后期，pH上升。

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??引起发酵液pH值变化的常见因素：(1)下降：①培养基中C/N不当，有机酸积累；②消沫油加得过多；③生理酸性物质过多；(2)上升：①C/N比例不当，N过多，氨基氮释放；②生理碱性物质过多；③中间补料时碱性物加入量过大；

二、 pH对发酵的影响表现在哪些方面？（P98）

（1）影响菌体的生长；（2）pH影响酶的活性：当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。（3）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变：从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。（4）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离：从而影响微生物对这些物质的利用 。

（5）pH影响代谢方向 ：pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。（6）影响产物稳定性

三、 为了确定发酵的最佳pH，我们该如何实验？

配制不同初始pH的培养基，摇瓶考察发酵情况

四、※ 发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？

1、调节好基础料的初始pH：基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制灭菌后pH在6.0，灭菌前pH往往要调到6.5~6.8。

2、在基础料中加入维持pH的物质：如CaCO3 ，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等。

3、通过补料调节pH ：在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调节pH。通过补料调节pH值既调节了培养液的pH值，又可补充营养，进一步提高发酵产率。

4、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH ：应急措施：改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度；改变温度，以控制微生物代谢速度；改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量；改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；

5、不同调pH方法的影响：

6、发酵的不同阶段采取不同的pH值：

五、发酵用的复合pH电极有哪些要求？（P144）

1．能高温灭菌，过高的温度将对玻璃膜材质和参比电极性质产生影响，造成不可逆转的破坏。

2。具有长时间的稳定性，应保证转换系数和不对称电位能适应发酵周期长、中途不能更换和不能标定的要求

3．要求一定的液络部流通，维持的液接界电位稳定，防止使用过程中液络部被含硫物、蛋白质和非水溶液污染，造成电极测量漂移

4。外加不锈钢护套或工程塑料护套后安装于罐内

第五节 溶解氧的供需及控制

一、※比耗氧速率或呼吸强度（QO2 ）：单位重量的细胞(干重)在单位时间内所消耗的氧气，mmolO2/(g菌·h) 摄氧率(r)：单位体积的发酵液在单位时间内所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1 。

临界溶氧浓度（Critical contentration）：指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。如果对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。

氧饱和度：常指样品中的氧含量对该样品最大氧含量的百分比。

二、※影响微生物需氧的因素有哪些？供氧、需氧

菌体浓度：直接影响培养液的摄氧率。

呼吸强度QO2的影响因素：1.遗传因素：不同的微生物呼吸强度是不同的。一般为 25～100mmolO2/(L·h)。

2. 菌龄：一般幼龄菌生长旺盛，呼吸强度大；老龄菌生长慢，呼吸强度小。

3.代谢类型：若产物是通过三羧酸循环(TCA)获取，则呼吸强度高，如Glu、天冬氨酸的生产；若糖酵解途径(EMP)，则呼吸强度低，如苯丙氨酸、亮氨酸的生产。

4. 培养基的成分与浓度: 培养基成分尤其是碳源对细胞的耗氧量有很大影响。培养基的浓度也会影响细胞的耗氧速率。营养丰富，菌体生长快，耗氧量大. 此外，若培养基中含有生长抑制剂时，呼吸强度也回受到限制。

5. 发酵条件: 温度、pH通过对酶活性的影响而影响菌体细胞的耗氧；温度还影响发酵液中的溶氧浓度;有些有害物 - 6 -

质的积累，如NH3、CO2会抑制微生物的呼吸

※内源呼吸:如果外界没有供给能源，而是利用自身内部储存的能源物质进行呼吸

※外源呼吸:在正常情况下，微生物利用外界供给的能源进行呼吸

三、发酵液中的体积氧传递方程？（P104）

N?kg(p?pi)?kL(ci?c) N：传氧速率 kmol/m2.h kg: 气膜传质系数 kmol/m2.h.atm kL: 液膜传质系数 m/h

C*＝P·H，与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度

N?kL(c*?c) kL: 以氧浓度为推动力的总传递系数 (m/h)

再令：单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a (m2/m3)

Na?kLa(c*?c) Na：体积传氧速率 kmol/m3.h kLa: 以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数 h-1

如何调节摇瓶发酵的供氧水平？ 影响摇瓶kLa的因素：为装液量和摇瓶机的种类

五、如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？ ??发酵过程中溶解氧的控制：发酵液的溶氧浓度，是由供氧和需氧两方面所决定的。因此要控制好发酵液中的溶氧，需从这两方面着手。

溶氧控制的一般策略：前期大于临界呼吸溶氧浓度有利于菌体生长，中后期满足产物的形成。

一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是增大通气的时间一定要把握好。

六、如何测定发酵液中的溶氧浓度，以及发酵罐的Kla?（P122 P144-147）

第六节 发酵过程泡沫的形成与控制

一、泡沫对发酵有哪些有益之处，哪些有害之处？

因通气搅拌、产生CO2以及发酵液中糖、蛋白质等稳定泡沫的物质的存在，使发酵液含有一定量的泡沫，这是正常现象。少量泡沫可增加气液接触面积，有利于氧的传递；

但过多的泡沫是有害的。危害：1、降低生产能力：在发酵罐中，为了容纳泡沫，防止溢出而降低装液量，装料系数一般取0.6-0.7。

2、引起原料浪费：如果设备容积不能留有容纳泡沫的余地，气泡会引起原料流失，造成浪费。“逃液”

3、影响菌的呼吸：如果气泡稳定，不破碎，那么随着微生物的呼吸，气泡中充满二氧化碳，而且又不能与空气中氧进行交换，这样就影响菌的呼吸。

4、引起染菌：由于泡沫增多而引起“逃液”，于是在排气管中粘上培养基，就会长菌。随着时间延长，杂菌会长入发酵罐而造成染菌。大量泡沫由罐顶进一步渗到轴封，从轴封处落下的泡沫往往引起杂菌污染。

二、泡沫形成的原因是什么？

1、气液接触: 因为泡沫是气体在液体中的粗分散体，产生泡沫的首要条件是气体和液体发生接触。而且只有气体与液体连续、充分地接触才会产生过量的泡沫。气液接触大致有以下两类情况：（1）气体从外部进入液体，如搅拌液体时混入气体；（2）气体从液体内部产生。气体从液体内部产生时，形成的泡沫一般气泡较小、较稳定。2、含助泡物: 在未加助泡物，但并不纯净的水中产生的泡沫，其寿命在0.5秒之内，只能瞬间存在。摇荡纯溶剂不起泡，如蒸馏水，只有摇荡某种溶液才会起泡。在纯净的气体、纯净的液体之外，必须存在第三种物质，才能产生气泡。对纯净液体来说，这第三种物质是助泡物。当形成气泡时，液体中出现气液界面，这些助泡物就会形成定向吸附层。与液体亲和性弱的一端朝着气泡内部，与液体亲和性强的一端伸向液相，这样的定向吸附层起到稳定泡沫的作用。3、起泡速度高于破泡速度: 起泡的难易，取决于液体的成分及所经受的条件；破泡的难易取决于气泡和泡破灭后形成的液滴在表面自由能上的差别；同时还取决于泡沫破裂速度快慢。高起泡的液体，产生的泡沫不一定稳定。体系的起泡程度是起泡难易和泡沫稳定性两个因素的综合效果。泡沫产生速度小于泡沫破灭速度，则泡沫不断减少，最终呈不起泡状态；泡沫产生速度等于泡沫破灭速度，则泡沫数量将维持在某一平衡状态；泡沫产生速度高于泡沫破灭

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速度，泡沫量将不断增加。

三、※发酵过程中泡沫的多少与哪些因素有关？

（1）通气、搅拌的剧烈程度：通气大、搅拌剧烈可使泡沫增多。在发酵前期由于培养基营养成分消耗少，培养基成分丰富，易起泡，因此应先开小通气量，再逐步加大。搅拌转速也如此。也可在基础料中加入消泡剂。

（2）培养基配比与原料组成： 培养基营养丰富，黏度大，产生泡沫多而持久，前期难开搅拌。另外，培养基中的玉米浆>花生饼粉>黄豆饼粉、蛋白胨、酵母粉、糖蜜等是起泡的主要因素。

（3）菌种质量和接种量： 菌种质量好，生长速度快，可溶性氮源较快被利用，泡沫产生机率也就少。菌种生长慢的可以加大接种量。

（4）灭菌质量：培养基灭菌质量不好，糖氮被破坏，抑制微生物生长，使种子菌丝自溶，产生大量泡沫，加消泡剂也无效。

（５）发酵过程中发酵液随菌的代谢活动不断变化，是泡沫消长的重要因素

四、※发酵中控制泡沫的途径有哪些？(P128)

① 调整培养基的成分（如少加或缓加易起泡的原材料）、或改变某些物理化学参数（如pH、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。但效果有限。

② 选育在生长期不产生泡沫的微生物突变株。如有人已用杂交育种方法选育出不产生泡沫的土霉素菌株。

③机械消泡：优点：不需引进外界物质如消泡剂，可节省原料，减少染菌机会。缺点：效果不理想，仅可作为消泡的辅助方法，可和化学消泡法同时使用。

④化学消泡：加消泡剂，当今发酵工业中常用的方法。

第七节 中间补料及其控制

一、※中间补料的意义和原则是什么？补料方式有哪些？

意义：控制菌的生长速率以及培养中期的代谢活动；延长合成期；推迟菌体自溶。另外加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。

原则：控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中后期的生化代谢活动向着有利于产物积累的方向发展。

补料方式可分为：连续流加；不连续流加 (少量多次、大量少次)；多周期流加 连续流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响。每次流加又可分为：快速流加、恒速流加、指数速率流加、变速流加。从补加营养物成分来看，又有单组分补料和多组分补料。

第六章 有机酸生产工艺

一、※柠檬酸的产生菌有哪些？黑曲霉、酵母。？？？

二、※柠檬酸合成途径有哪些？

(1) 由葡萄糖合成柠檬酸的途径：EMP、HMP、TCA。

(2) 由乙酸合成柠檬酸途径：TCA及乙醛酸循环。

(3) 以正烷烃为碳源时的合成途径：正烷烃→脂肪酸→乙酸→柠檬酸。

三、※柠檬酸发酵工艺有哪几种？

（1）表面发酵：利用生长在液体培养基表面的微生物之代谢作用，将原料转化为柠檬酸的发酵方式。

（2）固体发酵：将发酵原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，经过微生物的代谢活动，将原料中可发酵成分转化为柠檬酸的发酵方式。1）薄层发酵2）厚层通风发酵： 特点：由容器的假底向上通风，以供氧和带走热量，机械化程度高。优点：设备占地面积少，污染杂菌的可能性较小、机械化程度高，能够形成较大规模。

（3）深层发酵 ： 菌体在液体培养基中，在通气条件下通过代谢转化可发酵原料形成柠檬酸的发酵方式。

四、※柠檬酸分离提取的方法有哪些？

１.钙盐法：原理：钙盐法是利用柠檬酸钙不溶于水， 但能溶于酸的特点来提取得到纯柠檬酸固体产品。

２.直接提取法；３.溶媒萃取法；４.离子交换法；５.渗析法

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第七章 氨基酸生产工艺

一、※试述谷氨酸生产中应注意哪些环节？

控制发酵的条件；控制细胞渗透性；降低反馈作用物的浓度 ；消除终产物的反馈抑制与阻遏作用；促进ATP的积累，以利氨基酸的生物合成

三、※在氨基酸发酵中人工控制代谢有哪些主要的手段？

改变微生物遗传特性(遗传学方法）；控制发酵条件（生物化学方法）；改变细胞膜透性；

1.遗传学方法： 营养缺陷型菌株的应用；抗反馈控制突变株的应用：抗反馈控制突变株——是指对反馈抑制不敏感或对阻遏有抗性，或两者兼有之的菌株；选育组成型突变株和超产突变株；

2.生物化学方法：（1）添加前体绕过反馈控制点：亦能使某种代谢产物大量产生（2） 添加诱导剂：从提高诱导酶合成量来说，最好的诱导剂往往不是该酶的底物，而是底物的衍生物，（3）发酵与分离过程耦合（4）控制发酵的培养基成分：

3、控制细胞膜渗透性：（1）用生理学手段—— 直接抑制膜的合成或使膜受缺损 （2） 利用膜缺损突变株 ——油酸缺陷型、甘油缺陷型

第八章 发酵工业的无菌技术※

一、※如何检查判断是否染菌？

培养液是否染菌从三个方面进行分析：显微镜检查、无菌试验、生化指标检测。

1.显微镜检查法（镜检法）通常用简单染色法或革兰氏染色法，染色后在显微镜下观察。对于霉菌、酵母发酵，先用低倍镜观察生产菌的特征，然后再用高倍镜观察有否杂菌的存在。必要时可进行芽孢染色和鞭毛染色。简单、直接，是最常用的方法之一。

2.无菌试验（1） 平板划线培养或斜面培养检查法（2）肉汤培养检查法（3）双层平板(双碟)培养法

3.生化指标检测： 溶解氧、pH值、尾气中CO2含量和菌体酶活力等变化来分析是否染菌。

二、※发酵染菌应从哪几个方面进行分析？

1、染菌对不同菌种发酵的影响：由于不同菌种发酵所使用的培养基、发酵条件、发酵周期以及产物性质不同等，染菌的类型和造成的危害程度也各不相同。

2、不同发酵时期染菌对发酵的影响：（1）种子培养期染菌：培养基营养丰富，容易染菌，而且种子染菌对发酵危害较大，应严格控制种子污染。（2）发酵前期染菌：较容易染菌，污染后杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分和氧，严重抑制生产菌的生长繁殖，最终导致产物的积累大大减少，甚至造成发酵失败。（3）发酵中期染菌：危害极大，不但影响生产菌的继续生长，还会严重干扰生产菌的产物合成代谢，减少产物的生成。而且由于营养成分大量消耗，发酵产物正在大量积累，一般挽救处理困难，危害性很大。故在实际生产中应做到早发现快处理。（4）发酵后期染菌：发酵后期产物积累较多，营养接近耗尽，此时染菌影响相对小些，一般可继续发酵；若污染严重，可采取提前放罐来减少损失。

3、染菌对产物提取和产品质量的影响： 若污染的杂菌在发酵液中分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶剂萃取非常不利，严重影响产物的提取收率。

三、※在工业生产中杂菌污染的途经及应采取哪些措施防止污染杂菌？

1.种子带菌及预防:种子带菌是导致发酵前期染菌的重要原因之一。

(1)种子培养基及用具灭菌不彻底：假压；(2)菌种移接过程中受污染：严格无菌室管理、按无菌操作规程接种、合理设计无菌室。(3)菌种在培养过程中或保藏过程中受污染：试管的棉花塞要合适；培养和保藏的温度不宜变化太大；每一级种子均应经过严格检查，确认未受污染才能使用。

2.培养基灭菌不彻底导致染菌及预防:(1)原料性状的影响:一般稀薄的培养基容易灭菌彻底。而淀粉质原料、麸皮及豆饼一类的原料，在升温过快或混合不均匀时容易结块，使团块中心部位“夹生”，包埋有活菌，蒸汽不易进入将其杀灭，但在发酵过程中这些团块会散开，导致染菌。所以，含这类物质的培养基采用实罐灭菌为好，在升温前先搅拌混合均匀；如有大颗粒，应先过筛除去。(2)灭菌时温度与压力不对应造成染菌

未充分排除罐内冷空气，造成“假压”。(3)灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：由于泡沫膜的存在及泡沫内空气传热 - 9 -

较差，使泡沫内温度低于灭菌温度，导致泡沫内有杂菌，一旦破裂就会释放出来。添加消泡剂，防止泡沫升顶。(4)灭菌后期罐压骤变造成染菌:在灭菌操作完成后，当用冷却水冷却发酵罐时，由于操作不当如冷却过快造成罐内负压而使外界带菌空气从密封不严处渗入，造成染菌。正确操作是在冷却前先通入无菌空气维持罐内一定正压，再进行冷却，就可避免染菌的发生。(5)连续灭菌维持时间不够或蒸汽压力波动大而造成染菌

3.空气带菌及预防：（1）加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口；（2）设计合理的空气预处理工艺，保持过滤介质的干燥状态；（3）设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。

4.设备的渗漏或“死角”造成的染菌及预防：（1）设备渗漏染菌：工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏而染菌。设备渗漏包括夹套穿孔、盘管穿孔、接种管穿孔、阀门渗漏、搅拌轴渗漏、罐盖渗漏和其它设备渗漏等。预防：选用优质材料，并定期进行检查。（2）设备的“死角”指由于操作、设备结构或人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能达到预定的灭菌部位或该部位的冷空气不易在加热过程中排净，从而达不到彻底灭菌要求的部位。

5.操作不当造成染菌及预防：罐压跌零使外界空气进入而染菌、泡沫冲顶、管道阀门操作不当使料液倒吸至空气过滤器等。加强技术工人的技术培训和责任心教育，提高工人素质，强化管理措施。

6.噬菌体污染及预防：在细菌发酵过程中，由于噬菌体感染力非常强，传播蔓延迅速，发酵体系容易受到噬菌体的污染。噬菌体易在空气中传播，因此，环境污染是噬菌体污染的主要根源。目前最有效的预防办法是以净化环境为中心的综合预防方法，主要有净化生产环境、消灭污染源、提高空气净化度、使用抗噬菌体的菌种、遵从操作规范等措施。

四、※工业生产中发现染菌应采取哪些措施？

1、种子培养期染菌的处理：①一旦发现种子受到杂菌污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。 ②采用备用种子，接入发酵罐继续进行发酵生产。③如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种”处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产正常进行。

2、发酵前期染菌的处理： ①如果培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基重新进行灭菌后，再接入种子进行发酵。②如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。③也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。

3、发酵中、后期染菌的处理：①可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度；也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其它措施，进行处理。②如果发酵过程的产物代谢已达到一定水平，此时产品的含量达一定值，只要明确是染菌也可放罐。③对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120℃以上、保持30min后才能排放。

4、染菌后对设备的处理： 染菌后的发酵罐在重新使用前，必须进行彻底清洗并灭菌后才能使用；也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12h以上等方法进行处理。种子罐，灭菌前放水加温至100℃，加水量至少占罐体2/3，煮罐。不用罐加热水浸泡 。 检查：A、罐体及附属设备是否渗漏； B、管道是否通畅； C、罐体有无污垢堆积； D、设备仪表管道安装是否合理； E、仪表是否失灵； F、过滤器是否失效。

5污染噬菌体处理：发酵液经灭菌后再放罐，严格控制培养液流失。清理生产环境，清除噬菌体载体——发酵液残渣。生产环境用漂白粉、新洁尔灭等消毒。调换生产菌种。培养基中加草酸。噬菌体具有专一性。暂时停产1~4周，车间用甲醛消毒。选育抗噬菌体的新菌株。

6、其它处理：（1）染菌后的培养基必须灭菌后才可放下水道：灭菌方法：可通蒸汽灭菌，也可加入过氧乙酸等化学灭菌剂搅拌半小时，才放下水道。否则由于各罐的管道相通，会造成其它罐的染菌。

(2)染菌厉害时，车间环境要用石灰消毒，空气用甲醛熏蒸。特别，若染噬菌体，空气必须用甲醛蒸汽消毒。

(3)发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，避免以后有类似情况发生，并积极采取必要措施处理。

题型：名词解释：5*2’； 填空：10’； 选择、判断：20’； 简答：40’； 问答：20’ 。

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