中华人民共和国国家标准
化学农药环境安全评价试验准则 GB##-2004 前言
本标准由中华人民共和国农业部提出。
本标准起草单位：国家环境保护总局南京环境科学研究所，农业部农药检定所。
本标准主要起草人：
目 录
1适用范围……………………………………………………..…….…………..3 2化学农药环境安全评价试验方法………………………..……….……..3
2.1环境行为特性试验……………………….…………………...…………..3
2.1.1土壤降解……………………….…………………….………….…………..3
2.1.2水解……………………….…………………….……..………………..……4
2.1.3光解……………………….……………………………………….….………6
2.1.4土壤吸附作用……………………….…………………….……….………8
2.1.5土壤淋溶作用……………………….……………………………………11
2.1.6挥发性……………………….………………………..………...…………14
2.1.7生物富集作用……………………….……………………….…………16
2.2对非靶生物毒性试验……………………….…………….…….…………18
2.2.1鸟类毒性试验……………………….…………….………….…………18
2.2.2蜜蜂毒性试验……………………….…………….………….…………20
2.2.3家蚕毒性试验……………………….……………..………….…………22
2.2.4鱼类毒性试验……………………….……………..………….…………24
2.2.5溞类毒性试验……………………….………………..……….…………26
2.2.6藻类毒性试验……………………….………………..……….…………29
2.2.7蚯蚓毒性试验……………………….…………………….…………….…31
2.2.8土壤微生物毒性试验……………………….………………….…………33
2.2.9天敌赤眼蜂毒性试验…………………….…………………….…………35
2.2.10天敌两栖类毒性试验……………………….…………………….……36
2.2.11作物的敏感性试验……………………….…………………….………38 参考文献……………………….………………………………………….…………41
2
1 适用范围
本准则规定了化学农药登记环境生态学试验的方法、质量控制、数据处理、评价标准及评价结论编写等基本要求。
本准则适用于为化学农药登记环境管理所需进行的环境生态学试验。 2 化学农药环境安全评价试验方法
2.1环境行为特性试验
2.1.1土壤降解
土壤降解指在土壤中残留农药逐渐由大分子分解成小分子，直至失去毒性和生物活性的全过程，农药在土壤中的降解特性是评价农药对整个生态环境影响的一个重要指标，农药在土壤中的降解速率通常用降解半衰期t0.5表示。
（1）试验材料
供试土壤：采集3种有代表性的新鲜农田耕层土壤，经风干、过2mm筛，贮于5℃冰箱内备用，并测定土壤pH、有机质、阳离子代换量和机械组成。
供试农药：将农药纯品（或原药）溶于水中，难溶于水的农药，可用少量对农药降解无干扰影响的有机溶剂助溶(如乙醇、丙酮等)，加量不超过1%。
主要仪器设备：培养箱、气相色谱、液相色谱等分析仪器。
（2）试验方法
称20g土壤于三角瓶中，先加入一定量的农药拌匀后，加水将土壤含水量调节到田间持水量的60%，塞上棉塞，不同土壤均重复处理10份样品，置于25?1℃黑暗的恒温箱中培养，定期取样，分别测定土壤中农药残留量，至土壤中农药的降解率达90%以上时终止。培养过程中及时调节三角瓶内水分含量，以保持原有持水状态。用于水田的农药，须增加渍水条件下的降解试验，即在上述试验处理基础上，三角瓶中的持水量加大到土壤表面有1cm水层，其它条件相同。
（3）数据处理
试验结果采用指数回归方程，求农药在土壤中的降解半衰期，最常用的计算公式如下：
-k tCt=C0e t0.5?Ln2 k
C0：土壤中农药初始浓度(mg/kg)
Ct：t时土壤中农药残留浓度(mg/kg)
k：降解速率常数
3
t：培养时间
t0.5：降解半衰期
（4）质量要求
① 土壤中农药残留量分析方法回收率为70~110%，最低检测浓度满足检测要求。
② 初始浓度1~10mg/kg。
③ 降解动态曲线至少7个点，其中5个点浓度为初始浓度的20~70%。 ④ 试验时间至农药降解率90%以上；对难降解农药，试验时间至少180天。
（5）评价标准
根据农药在土壤中降解(或消解)半衰期的长短，及其可能对生态环境造成的影响，将农药在土壤中的残留性划分成五个等级，见表1。
表1 农药在土壤中的残留性等级划分
等级
I
II
III
IV
V 半衰期t 0.5(月) <1 1~3 3~6 6~12 >12 降解性 易降解 较易降解 中等降解 较难降解 难降解
（6）试验报告
试验报告须包括下列内容：
① 供试农药：通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、基本理化性质。 ② 供试土壤：pH、有机质含量、阳离子代换量、机械组成。
③ 主要仪器设备：培养箱、分析仪器等。
④ 试验条件：温度、持水量、初始浓度、取样时间。
⑤ 土壤中农药残留量分析：样品前处理、测定条件、线性范围、添加回收率、相对标准偏差、最小检测量、谱图等。
⑥ 试验结果：降解曲线、半衰期、相关系数及土壤降解性评价。
2.1.2水解
水解是指物质在水中引起的化学分解现象，是农药非生物降解的主要形式之
一。农药的水解速率，通常用水解半衰期t0.5表示。
（1）试验材料
供试农药：采用农药纯品（或原药）溶于水中，难溶于水的农药，可加少量 4
对农药降解无干扰影响的有机溶剂助溶(如乙醇、乙腈和丙酮等)，加量不超过1%（V/V）。
主要仪器设备：培养箱、pH计、灭菌锅、气相色谱、液相色谱等分析仪器。 不同酸碱度的缓冲溶液：
pH5.0：500 mL 0.10 mol/L 苯二甲酸氢钾溶液加239 mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，再加蒸馏水定容至1000mL。
pH7.0：500 mL 0.10 mol/L 磷酸二氢钾溶液加296 mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，再加蒸馏水定容至1000mL。
pH9.0：500 mL 1?1的 0.10 mol/L 硼砂与0.10 mol/L氯化钾溶液中，加 213mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液，再加蒸馏水定容至1000mL。
（2）试验方法
① 预试验
分别用pH 5.0、7.0和9.0的缓冲溶液配制浓度 ? 0.01mol/L或50%饱和浓度的农药水溶液于具塞三角瓶中，难溶于水的农药助溶剂加量不超过1%。置于50?1℃恒温条件下培养5d测定农药含量，如水解率小于10%，可认为该农药具有化学稳定性，无须进一步做水解试验；如水解率大于等于10%，则须进一步进行25℃与50℃时的水解试验。
② 正式试验
配制2组pH 5.0、7.0和9.0的农药水溶液系列，分别置于25?1℃及50?1℃的培养箱中，从开始培养起，定期采集水样7次以上，测定水样中农药含量，确定其水解动态，至水解率达90%以上终止。
上述缓冲溶液与供水解试验用的容器均须经高温高压灭菌。灭菌后的溶液需重新校正pH，整个试验过程中须避光及避免氧化作用等的影响。
（3）数据处理
大多数农药的水解规律遵循一级动力学方程，试验结果可按下列公式求得水解半衰期t0.5。
-k tCt=C0e t0.5?
C0：农药的起始浓度(mg/L)
Ct：t时的农药浓度(mg/L)
k：水解速率常数
5 Ln2 k
t：反应时间
t0.5：水解半衰期
（4）质量要求
① 水中农药残留量测定方法回收率为70~110%，最低检测浓度满足检测要求。
② 试验温度误差要求?1℃。
③ 降解动态曲线至少7个点，其中5点浓度值为初始浓度的20~70%。
（5）评价标准
根据农药水解半衰期的大小，及其可能对生态环境造成的影响，将农药的水解特性划分成五个等级（表2）。
表2 农药水解特性等级划分
等级
I
II
III
IV
V 半衰期t 0.5(月) <1 1~3 3~6 6~12 >12 降解性 易水解 较易水解 中等水解 较难水解 难水解
（6）试验报告
试验报告须包括下列内容：
① 供试农药：通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、基本理化性质。 ② 缓冲溶液：pH5.0、7.0和9.0缓冲溶液的制备。
③ 主要仪器设备：培养箱、灭菌锅、气相色谱、液相色谱等分析仪器。 ④ 试验条件：农药水溶液配制方法、初始浓度、灭菌条件、酸度、温度、采样时间。
⑤ 水中农药残留量分析：测定条件、线性范围、添加回收率、相对标准偏差、最小检测量。
⑥ 试验结果：水解曲线、水解半衰期、相关系数、水解特性评价。
2.1.3光解
光解系指农药在光诱导下进行的化学反应，它是农药非生物降解的重要途径。
（1）试验材料
6
供试农药：纯品农药（或原药）用蒸馏水溶解制得农药水溶液，对难溶于水的农药可加少量乙腈助溶，不能用光敏性有机溶剂。
主要仪器设备：光化学反应装置、光源（氙灯）、气相色谱、液相色谱等分析仪器、紫外强度计、照度计等。
（2）试验方法
配制一定浓度的农药水溶液系列，于石英光解反应管中，盖紧，然后将光解管置于光化学反应装置中进行光解试验。光源采用人工光源氙灯，反应器内温度为25±2?C。试验过程中定期取水样7次以上，测定水样中农药浓度的变化，记录光照强度和紫外强度，至光解率达90%以上时终止。同时设黑暗条件下的对照试验。
整个光解试验期内隔离其它光源，以减少对试验结果的影响。
（3）数据处理
大多数农药的光解遵循一级动力学方程，试验结果可按下列公式求得光解半衰期t0.5。
-k tCt=C0e t0.5?
C0：农药起始浓度(mg/L)
Ct：t时农药浓度(mg/L)
k：光解速率常数
t：反应时间
t0.5：光解半衰期
（4）质量要求 Ln2 k
① 水中农药残留量测定方法回收率为70~110%，最低检测浓度满足检测要求。
② 光解动态曲线至少7个点，其中5点浓度值为初始浓度的20~70%。 ③ 试验用蒸馏水pH为6.0~7.5，对于有离子化或质子化反应的物质，须用两级pH溶液作试验。
（5）评价标准
根据农药光解半衰期的大小，及其可能对生态环境造成的影响，将农药的光解特性划分成五个等级（表3）。
7
表3 农药光解特性等级划分
等级
I
II
III
IV
V 半衰期t 0.5 降解性 易光解 较易光解 中等光解 较难光解 难光解 <3 3~6 6~12 12~24 >24
氙灯：受体接受光强4000Lux，紫外强度25?w/cm2。
（6）试验报告
试验报告须包括下列内容：
① 供试农药：通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、水溶解度及其它理化性质。
② 主要仪器设备：光解装置、气相色谱、液相色谱等分析仪器。 ③ 试验条件：光源、光强和紫外强度、试验温度、取样时间。
④ 水中农药残留量分析：测定条件、线性范围、添加回收率、相对标准偏差、最小检测量。
⑤ 试验结果：光解曲线、半衰期、相关系数、光解特性评价。
2.1.4土壤吸附作用
农药在土壤中的吸附作用，是物质在固液两相间的分配达到平衡时的比值，通常用吸附常数Kd表示。农药在土壤中的吸附性能，是评价农药在环境中的移动性、持留性，以及农药进入环境后的生物活性与毒性的重要指标。
（1）试验材料
供试农药：农药纯品（或原药），溶于0.01mol/L CaCl2溶液中，配成不同浓度的药液，对难溶于水的农药，可用少量有机溶剂助溶(如乙腈、丙酮)。
供试土壤：选择质地为砂土、壤土和粘土，其它性质相似的三种土壤，风干、过2mm筛待用。
主要仪器设备：恒温振荡器、高速离心机、气相色谱、液相色谱等分析仪器等。
（2）试验方法
① 预试验
分别称取一定量的三种供试土壤于具塞三角瓶中，加入一定体积浓度小于 8
5mg/L的农药水溶液（0.01mol/L CaCl2 介质），以保持水土比为5:1、10:1、20:1或100:1（视Kd值大小而定）。塞紧瓶塞，置于恒温振荡器中，于25?2?C 下，振摇24h达到平衡后，将土壤悬浮液转移至离心管中，高速离心，吸取上清液，测定清液农药含量。若吸附率大于25%，则需进行解析试验和正式吸附试验。
同时设置未加土壤的农药水溶液（0.01mol/L CaCl2介质）空白处理。 ② 解析试验
分离出上清液后，在土壤固相中加入一定体积的0.01mol/L CaCl2溶液，振摇24h后离心分离，测定上清液中农药含量。重复操作1次，合计2次清液中农药含量，求得农药解析率。若解析率小于75%，需进行质量平衡试验。
③ 质量平衡试验
选择适当的提取剂，提取（3次）测定吸附在土壤中的农药含量，以验证吸附试验过程中农药质量的平衡。
④ 正式试验
配制推荐浓度分别为0.04、0.20、1.00和5.00mg/L的农药水溶液系列（对低溶解度农药，可适当降低试验浓度），同预试验操作，进行土壤吸附正式试验，求出吸附常数。
（3）数据处理
① 吸附率（A）
吸附率可由下式计算：
A?M?Ce?V0x?100??100 MM
式中，M—未加土壤的农药水溶液平衡时农药含量（mg）
Ce—经土壤吸附平衡时水相中农药浓度（mg/L）
V0—水溶液体积（mL）
x—吸附于土壤中的农药量（mg）
② 解析率（D）
D???C1?C2?V??V0?V?Ce??100 x
其中，C1—第1次解析浓度（mg/L）
C2—第2次解析浓度（mg/L）
9
V—吸附试验后水相体积（mL）
③ 吸附常数（Kd）
分子型有机农药的土壤吸附规律，可用弗仑德利奇（FreundLich）方程来描
述：
Cs=Kd ? Ce
Cs=x/m 1/n
其中，Cs—土壤对农药的吸附浓度（mg/kg）
Kd—土壤吸附系数
1/n—Cs与Ce关系曲线斜率
m—土壤重量kg
将测定结果代入FruendLich吸附公式，可求得Kd值。
LnKd=LnCs－1/nLnCe
土壤有机质对农药吸附作用影响很大，农药在土壤中的吸附作用，也可用土
壤的吸附系数Koc表示，计算公式如下：
koc?
（4）质量要求 Kd?100 ① 土壤、水中农药残留量测定方法回收率为70~110%，最低检测浓度满足
检测要求。
② 助溶剂(如乙腈、丙酮)加量小于0.2%(V/V)。
③ 质量平衡试验回收率大于75%；对回收率小于75%农药，该方法不适用。
（5）评价标准：根据农药土壤吸附常数Kd的大小，可将农药的吸附性划
分成五个等级（表4）。
10
表4 农药土壤吸附性等级划分
等级
I
II
III
IV
V
Kd >200 50~200 20~50 5~20 <5 吸附性 易吸附 较易吸附 中等吸附 较难吸附 难吸附
（6）试验报告
试验报告须包括下列内容：
① 供试农药：通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、水溶解度和正辛醇/水分配系数。
② 供试土壤：土壤类型、pH、有机质含量、阳离子代换量、机械组成。 ③ 主要仪器设备：振荡器、离心机、分析仪器。
④ 试验条件：温度、试验浓度、水土比、振荡速率、平衡时间。
⑤ 水中农药残留量分析：测定条件、线性范围、回收率、相对标准偏差、最小检测量。
⑥ 土壤中农药残留量分析：测定条件、线性范围、回收率、相对标准偏差、最小检测量。
⑦ 试验结果：预试验结果（吸附率）、解析率、质量平衡试验及回收率、吸附浓度、平衡浓度、吸附曲线与FruendLich吸附方程、吸附常数Kd与Koc、相关系数与吸附性能评价。
2.1.5土壤淋溶作用
淋溶是农药在土壤中随水向下移动的行为特性，它是评价农药对地下水污染影响的一个重要指标。
（1）试验材料
供试农药：农药纯品或原药。
供试土壤：选择3种有代表性的不同性质土壤，常用的有砂土、砂壤土、粉砂壤土、粘壤土。经风干分别过2mm及0.25mm筛，待用。
（2）试验方法
① 土壤薄层层析法
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称一定量过0.25mm筛的土壤于烧杯中加水搅拌，直至成均匀的泥浆状，用一根玻璃棒将泥浆均匀涂布于层析玻璃板上，土层厚度随土质的粗细程度不同，控制在0.5~1.0mm之间。涂布好的土壤薄板晾干后按一般的层析法，点上药液或用放射性标记的农药，点药量要低(大约在0.5~5.0?g之间)，点药后先将溶剂挥发掉，然后放在层析槽中用纯水作展开剂展开，展开后晾干。如果用放射性标记农药作供试农药，用自显影法求Rf值；如用普通农药测定时，则将薄板上土壤按等距离分成至少六段，分别测定各段土壤中的农药含量及其在薄板上的分布。
② 柱淋洗法
称取一定量过2mm筛的土壤，装于玻璃柱或塑料管中（内径5cm、柱长38mm），装成30cm高的土柱，在上端添加1cm厚的石英砂，柱中加水至土壤饱和持水量的60%。将一定量的供试农药滴加于土柱上层，从试验开始起，每隔1小时加水30mL，共计10次，收集淋出液。淋洗完毕后，将土柱均匀切成3段，分别测定各段土及淋出液中农药含量。
（3）数据处理
① 薄层层析法
根据各段土壤中的农药含量及其在薄板上的分布，可求得Rf值。
Rf = Lmax/ Lmax
Lmax为原点至色谱斑点中心的距离；
Lmax 为原点到展开剂前沿的距离。
② 土柱淋溶法
根据三段土壤及淋出水中的农药含量，分别求出其占添加总量的百分比。
Ri= mi/ M×100%
Ri 为各组分中农药含量的比例（%）；
mi为各组分中农药含量（mg）；
i=1、2、3、4，分别表示组分0-10cm、10-20cm、20-30cm土壤和淋出水； M 为农药添加总量（mg）。
（4）质量要求
① 农药残留量测定方法回收率为70~110%，最低检测浓度满足测定要求。 ② 每个处理要求3个平行。
③ 薄层层析法对挥发性强的农药不适用。
（5）评价标准
12
① 薄层层析法
根据Rf值的大小，将农药在土壤中的移动性能划分为五个等级（表5）。
表5 农药在土壤中的移动性等级划分 等级 I II III IV V
Rf 0.90~1.00 0.65~0.89 0.35~0.64 0.10~0.34 0.00~0.09
移动性 极易移动 可移动 中等移动 不易移动 不移动
② 土柱淋溶法
根据Ri值的大小，将农药在土壤中的移动性能划分为四个等级（表6）。
表6 农药在土壤中的淋溶性等级划分
等级 I II III IV
淋溶性 易淋溶 可淋溶 较难淋溶 难淋溶
Ri（%） R4>50 R3? R4>50 R2 ?R3?R4>50
R1>50
（6）试验报告
试验报告须包括下列内容：
① 供试农药：纯度、水溶解度、吸附系数、正辛醇/水分配系数等。 ② 供试土壤：pH、有机质含量、阳离子代换量、机械组成。 ③ 主要仪器设备：层析槽、气相色谱、液相色谱等分析仪器。
④ 试验条件：土壤薄层制备及参数、点样量、展开时间；土柱内径与长度、加药量、加水量、淋出水量、淋溶时间等。
⑤ 土壤和水中农药残留量分析：测定条件、线性范围、添加回收率、相对标准偏差、最小检测量。
⑥ 试验结果：农药在不同土壤薄层中的分布曲线和Rf值、移动性评价；农药在不同土柱中的分布和移动性评价。
13
2.1.6挥发性
挥发性是指农药在自然条件下以分子扩散形式逸入大气中的现象。农药挥发作用的大小与农药蒸气压及环境条件有关。农药挥发性的大小，会影响农药在土壤中的持留性及其在环境中的再分配，挥发性大的农药一般持留时间较短，而在环境中的影响范围较大。
（1）试验材料
供试农药：农药纯品或原药。
供试土壤：选择一种有代表性的土壤。
试验装置：气流式密闭模拟装置。
（2）试验方法
农药挥发性的测定分两步进行，即估测法和吸收法。
① 估测法
根据农药的水溶性（S）、蒸气压（P）和土壤吸附常数（Kd），通过下列公式可计算求得不同介质中农药的挥发性。
农药在空气中的挥发性
V?P?M
式中，V是农药的挥发速率；P是蒸气压(Pa)；M是农药的分子量。即农药的挥发作用与农药的蒸气压与分子量的大小成正比。
农药在水中的挥发性
Vw/a6CwS?8.29?10?T?a? 6P?M?10
式中 Vw/a是农药在水中的挥发速率；S是农药在水中的溶解度(mg/L)；T为绝对温度(K)；Cw为农药在水中的浓度(mg/L)；Ca为农药在空气中的浓度(mg/L)。 农药在土壤中的挥发性（Vsw/a）
Vsw/a?Cw1(?Kd) Car
式中 Vsw/a是农药在土壤中的挥发速率；Kd为农药在土壤中的吸附常数；r为土壤中土/水的重量比。
若Vw/a<106，则需进一步采用吸收法，分别测定农药在空气、水和土壤中的挥发性。
② 吸收法
14
农药在空气中的挥发性：取一定量的供试农药于10cm直径培养皿中，置于一个由真空干燥器组成的气流式密闭系统（如图1所示）中，在20~25?C条件下起动空气泵，以500mL/min的流速通过密闭装置中的培养皿表面，使挥发出来的农药随气流通过二级吸收管，截留在吸收液中，24h后测定吸收液中的农药含量，即为农药的挥发量。同时测定培养皿中残留的农药含量。
农药在水中的挥发性：配制一定量的农药水溶液于10cm直径的玻璃培养皿中，置于气流式密闭系统运行24h后，分别测定吸收液及水中农药含量。
农药在土壤表面的挥发性：称50g土壤平铺于10cm直径的玻璃培养皿中，加10mL蒸馏水，使土壤持水量约为饱和持水量的60%。然后均匀加入一定量的供试农药，置于气流式密闭系统运行24h后，分别测定吸收液及土壤中农药含量。
进入吸收系统的空气须经过活性炭净化，以免外来污染物进入系统。整个测定过程须避光，以防光解作用的影响。 （3）数据处理
根据测定结果，分别求得挥发量、挥发率和挥发试验回收率。
Rv(%)= mv? 100
m0
R(%)=
mv?mR
? 100 m0
式中：Rv—挥发率(%)，mv—挥发量(?g)，m0—加入量(?g)；R—挥发试验回收率(%)，mR—残留量(?g)。 （4）质量要求
① 农药残留测定方法回收率为70~110%，最低检测浓度满足测定要求。 ② 挥发试验回收率70~110%。 （5）评价标准
根据Vw/a的大小，可将农药挥发性能分为四级（表6）。
表6 农药挥发性等级划分
等级 I II III IV
估算法 Vw/a <104 104~105 105~106 >106
实测法 R（%） >20 10~20 1~10 <1
易挥发 中等挥发性 微挥发性 难挥发 挥发性
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（6）试验报告
试验报告须包括下列内容：
① 供试农药：通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、水溶解度及其它理化性质。
② 供试土壤：pH、有机质含量、阳离子代换量、机械组成。
③ 主要仪器设备：气流式密闭装置、气相色谱、液相色谱等分析仪器。 ④ 试验条件：试验温度、气体流速、试验时间、避光条件。
⑤ 不同介质中农药残留量分析：提取方法、测定条件、线性范围、添加回收率、相对标准偏差、最小检测量。
⑥ 试验结果：估算结果、农药在空气、水、土壤介质中的挥发性测定结果与评价。
2.1.7生物富集作用
生物富集作用是评价环境中的残留农药对生物体及整个生态系统危害性的一个重要指标。生物富集作用通常用生物富集系数BCF表示，它是在稳定平衡状态下生物体受试物含量与试验水体中受试物浓度之比。测定生物富集系数的方法有静态法、半静态法与动态法三种，对一般农药，通常采用静态法或半静态法；对易降解与强挥发的农药，采用动态法。
（1）试验材料
供试鱼种：建议用鲤鱼、斑马鱼作试验材料。试验鱼健康，大小均匀，体长约3cm，试验前在室内驯养一周，预养期间生长正常，死亡率<5%。
供试农药：试验农药用纯品（或原药），难溶于水的可用少量低毒、不易降解的有机溶剂（如叔丁醇或二甲亚砜）助溶，加量?0.1mL/L。
（2）试验方法
试验用水为经曝气去氯处理24h的自来水，配制药液浓度分别为急性毒性LC50(96h)的1/10和1/100两个处理。每一处理不得小于20升试液，设置3个平行。每组投放20尾鱼，在22±20C的恒温条件下饲养，试验过程中定期测定水中溶解氧的含量，于0、6、24、48、96、144、192h分别从各处理中取水样测定农药含量的变化，并喂给适量饲料，至第8天时取出全部鱼样，称体重后每组分成两份测鱼体内农药含量。同时设置对照处理试液（不加入试验鱼）。
（3）数据处理
用对照组水体中农药的含量，来校正养鱼组水体中的农药含量，求出被鱼体 16
摄入农药的真实值。在试验结束时水体及鱼体中农药含量变化已达到平衡，则此时鱼体对农药的富集系数为：
BCF=Cfs / Cws
式中，Cfs—已达到平衡时鱼体内农药含量(mg/kg)
Cws—已达到平衡时水体中农药含量(mg/L)
如果在试验结束时，水体中农药浓度尚未达到平衡，则用上述公式求出的富集系数值应注明是8天的结果，即用BCF8d表示。
（4）质量要求
① 水和鱼体中农药残留量测定方法回收率为70~110%，最低检测浓度满足测定要求。
② 试验结束时，试验液农药含量不低于规定浓度的80%，空白对照供试农药损失量不显著。
③ 试验期间水中溶解氧不得低于5mg/L。
④ 试验鱼在试验期间不应有异常反应或健康状况恶化。
（5）评价标准
根据BCF值的大小，可将农药生物富集性分为三级（表7）。
表7 农药生物富集等级划分
等级
I
II
III BCF 富集等级 <10 10~103 >103 低富集性 中等富集性 高富集
（6）试验报告
试验报告须包括下列内容：
① 供试农药：通用名、化学名称、结构式、CAS号、纯度、水溶解度、物化性质、吸附性、正辛醇/水分配系数。
② 供试鱼种：种名、来源、驯化时间、驯化条件、食物种类与数量、鱼龄和规格。
③ 试验条件：试验时间、周期、温度、试验容器、农药浓度、pH、溶解氧、助溶剂及浓度、试验鱼数量、投食时间和数量等。
④ 水和鱼体中农药残留量分析方法：样品提取、测定条件、线性范围、添加回收率、最小检测量。
17
⑤ 试验结果：试验期间鱼死亡率、异常反应、表征变化；富集系数对时间的曲线、生物富集系数BCF值及生物富集性评价。
2.2对非靶生物毒性试验
2.2.1鸟类毒性试验
通过测定农药对鸟类的LC50或LD50，评价农药对鸟类的急性毒性，提供农药对生态环境影响的资料。国际上常用的试验鸟类有鸽、鹌鹑、雉、野鸭等。鹌鹑饲养方便，是理想的试验生物。
（1）试验材料
试验生物：供试鹌鹑（Coturnix coturnix japonica）用同一批大小均匀的鹌鹑蛋孵化，饲养约30天，体重约90~110克，健康、活泼、雌雄各半的鹌鹑用于试验。试验前一天停止喂食，仅供清水。
试验药品：供试药品用制剂或纯品，溶于水或植物油中，配制成一定浓度供试验用。
试验条件：室温在25±2?C，光照采用自然光照。
主要仪器设备：试验用鸟笼（大小约为300cm2/鹌鹑）、注射器、移液管、容量瓶、烧杯等玻璃器皿。
（2）试验方法
经口一次性染毒法：供试鹌鹑以经口灌注法一次性给药0.5~1.0 mL /鹌鹑，连续7 d观察受试鹌鹑的死亡情况与中毒症状。正式试验前先做预试，以较大的间距设置4~5个浓度组，求出受试物质对受试鸟的最低全致死剂量和最高全存活剂量。正式试验时，在此剂量范围内按一定间距设置5~7个剂量组，每组10只鹌鹑（雌雄各半），并设空白对照组，使用溶剂助溶的还需增设溶剂对照组。试验在25±2?C与正常的饲养条件下进行，记录试验鹌鹑的死亡数，对试验数据进行数理统计，求出LD50值及95%置信限。
喂饲法：将农药定量拌入饲料中进行喂饲，试验时间为8天。前5天喂含药饲料，后3天喂正常饲料。正式试验前先做预试，可设置4~5个浓度组，求出受试物质对受试鸟的最低全致死浓度和最高全存活浓度。正式试验时，在此浓度范围内按一定间距设置5~7个浓度组，每个处理10只鹌鹑（雌雄各半）。对照组喂正常饲料。试验在25±2?C与正常的饲养条件下进行，定期观察记录鹌鹑的中毒 18
症状和死亡情况。试验观察期为8天，死亡数字8天累计。计算并求出LC50值及95%置信限。
（3） 数据处理
鸟类半数致死剂量LD50或半数效应浓度LC50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
寇氏法：
用寇氏法可求出鸟类在24、48、72、96、120、144及168 h的LD50或LC50值及95%置信限。
Ⅰ：计算公式
LD50?LC50??Xm?i??P?0.5? log
式中，Xm—最高浓度的对数；
i—相邻浓度比值的对数；
?P—各组死亡率的总和（以小数表示）。
Ⅱ：95%置信限的计算
先求标准误：SlogLD50?LC50??i
式中，p—1个组的死亡率；
q—1-p；
i—相邻浓度比值的对数；
n—各浓度组鸟的数量。
的95%置信限?logLD50?LC50??1.96SlogLD50?LC50?
直线内插法
采用线性刻度坐标，绘制死亡百分率对试验物质浓度的曲线，求出50%死亡时的LD50（LC50）值。
概率单位图解法
用半对数纸，以浓度对数为横坐标，死亡百分率对应的概率单位为纵坐标绘图。将各实测值在图上用目测法画一条相关直线，从直线中读出致死50%的浓度对数，估算出LD50（LC50）值。
（4）质量控制
19 ?pq n
① 投喂药品期间，农药含量不能低于规定含量的80%。
② 试验结束时，对照组死亡率不超过10%。
③ 试验鸟类的生理和行为，应适应试验环境条件和基本食物。
④ 对鸟类低毒农药，设计试验剂量LD50值达1000mg/kg，可不再提高试验剂量。
（5）评价标准
根据毒性测定结果，将农药对鸟类的急性毒性划分为四个等级（见表8）。
表8 农药对鸟类的等级划分
毒性等级
剧毒
高毒
中毒
低毒 急性经口（mg/kg） LD50≤10 10＜LD50≤50 50＜LD50≤500 LD50＞500 喂饲（mg/kg） LC50≤50 50＜LC50≤500 500＜LC50≤1000 LC50＞1000
（6） 试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验生物的名称、来源、大小及饲养情况。
③ 试验条件：试验温度、方法等。
④ 24、48、72h及7d的LD50或24、48、72、96、120h及8d的LC50值和95%置信限，并给出所采用的计算方法。
⑤ 对照组及处理组是否出现死亡及异常反应。
⑥ 试验结果及毒性评价。
2.2.2蜜蜂毒性试验
蜜蜂是一类重要的环境生物，它既采花酿蜜，又传授花粉，具有重要的经济价值。通过测定农药对蜜蜂的LC50或LD50，评价农药对蜜蜂的急性毒性。采用养殖最普遍的意大利成年工蜂作试验蜂种。
（1） 试验材料
试验生物：意大利成年工蜂（Apis meLLifera L），要求供试蜜蜂健康、大小一致。
20
试验药品：供试药品用制剂或纯品。摄入毒性试验用药以蒸馏水配制成母液供试验用，易溶于水的物质直接用蒸馏水配制，难溶于水或不溶于水的可用少量毒性小的有机溶剂助溶，并在试验时设置溶剂对照组。触杀毒性试验用药以丙酮配制成一定浓度的溶液供试验用。
主要仪器设备：试验蜂笼、生化培养箱、微量注射器、烧杯等玻璃器皿。 试验条件：试验在温度25-30?C，相对湿度70-80%，微光条件下进行。
（2）试验方法
摄入毒性：将贮蜂笼内的蜜蜂引入试验笼中，每笼20只。不同浓度药液与蜂蜜以2:1混匀，制成药蜜，装入10 mL小烧杯中，杯内浸渍0.3g脱脂棉，杯口向下倒置于试验笼纱网上，通过网眼供蜜蜂摄食。正式试验前先做预试，可以较大的间距设置4~5个浓度组，求出受试蜜蜂最高全存活浓度与最低全致死浓度。正式试验时在此浓度范围内按一定间距设置5~7个浓度组，每组20只蜜蜂，并设空白对照组，使用有机溶剂助溶的还需设置溶剂对照组。对照组及每一处理组均设3个平行。记录处理24h、48h死亡数，对试验数据进行数理统计，求出LC50值及95%置信限。
触杀毒性：供试农药用丙酮溶解，配制成不同浓度的药液。将蜜蜂移入塑料网袋中，轻轻拉紧固定于点滴框上，蜜蜂被夹在两层纱网中。通过网孔对准蜜蜂前胸背板处，用微量注射器分别点滴规定浓度供试药液1.0~1.5μL，待蜂身晾干后转入试验笼中，用脱脂棉浸泡适量蜜和水饲喂。正式试验前先做预试，可以较大的间距设置4~5个浓度组，求出受试蜜蜂的最高全存活浓度和最低全致死浓度。正式试验时在此浓度范围内按一定间距设置5~7个浓度组，每笼20只蜜蜂。同时设立空白对照组及溶剂对照组，对照组及每一浓度组均设3个平行。观察24和48 h受试蜜蜂有无中毒症状及死亡现象，记录死亡数，对试验数据进行数理统计，计算LD50值及95%置信限。
（3） 数据处理
蜜蜂摄入毒性的半数致死浓度LC50和触杀毒性的半数致死剂量LD50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
（4）质量控制
① 投喂药品及饲养期间，农药含量不能低于规定含量的80%。
21
② 试验结束时，对照组死亡率不超过10%。
（5）评价标准
根据毒性测定结果将农药对蜜蜂的毒性分为四个等级（见表9）。
表9 农药对蜜蜂的毒性等级划分
毒性等级
剧毒
高毒
中毒
低毒 触杀法（μg/蜂） LD50≤0.001 0.001＜LD50≤2.0 2.0＜LD50≤11.0 LD50＞11.0 摄入法（mg/L） LC50≤0.5 0.5＜LC50≤20 20＜LC50≤200 LC50＞200
（6） 试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验生物的名称、来源、大小及饲养情况。
③ 试验条件：试验温度、试验方法等。
④ 试验液的浓度，24、48h-LC50或24、48h-LD50值和95%置信限，并给出所采用的计算方法。
⑤ 对照组蜜蜂是否出现死亡及异常反应。
⑥ 观察到的效应，如受试蜜蜂的任何不正常的行为、中毒症状等。 ⑦ 试验结果及毒性评价。
2.2.3家蚕毒性试验
通过测定农药对家蚕的LC50，评价农药对家蚕的急性毒性，提供农药对生态环境影响的资料。家蚕品种较多，选择有代表性的家蚕品种作试验材料。
（1）试验材料
试验生物：选择有代表性的家蚕品种，以二龄蚕为毒性试验材料。
试验药品：供试药品用制剂或纯品。易溶于水的用蒸馏水配制成一定浓度供试验用，难溶于水的可用少量毒性小的有机溶剂助溶，并在试验时设置溶剂对照组。
主要仪器设备：恒温培养箱、直径9 cm玻璃培养皿及烧杯等玻璃器皿。 试验条件：蚁蚕饲养温度为25±1?C，相对湿度为80~85%。
22
（2）试验方法
食下毒叶法：在直径9 cm的玻璃皿内饲养二龄起蚕，用不同浓度的药液定量浸渍桑叶，以5 mL药液浸渍5g桑叶，凉干供蚕食用。正式试验前先做预试，可以较大的间距设置4~5个浓度组，求出受试家蚕最高全存活浓度和最低全致死浓度。正式试验时，在此浓度范围内按一定间距设置5~7个浓度组，每组20头蚕，并设空白对照，加溶剂助溶的还需设溶剂对照。对照组和每一浓度组均设3个平行。整个试验期间饲喂处理桑叶，观察24 h、48 h、96 h、至三龄起，受试家蚕的中毒症状及死亡情况。试验结束后对数据进行数理统计，计算半致死浓度LC50值及95%置信限。
熏蒸法：在熏蒸箱内进行试验，熏蒸箱由燃烧室和熏蒸室两部分组成。试验蚕置于熏蒸室内，供试蚊香定量地在燃烧室内燃烧（或电热片加热），燃烧烟气通过循环泵送入熏蒸室内。从熏蒸开始，按0.5、2、4、6、8 h观察记录熏蒸试验装置内家蚕的毒性反应症状，8h后，将熏蒸试验装置内放置的培养皿取出，放置于家蚕常规饲养室作进一步观察，继续观察 24h及48h的家蚕死亡率。每个试验箱内设置九个重复，同时设置空白对照，设三个重复。
试验观察要求：观察记录项目主要包括摄食情况（减少或拒食）、不适症状（逃避、昂头、晃头、甩头、扭曲挣扎、吐水等）及死亡率。
（3）数据处理
家蚕的半致死浓度LC50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
（4）质量控制
① 空白对照组死亡率不超过10%。
② 试验期间，应保持试验室条件正常，如出现各种原因的故障，须重做试验。
（5）评价标准
农药对家蚕的毒性等级划分标准分为四级，并可根据田间施药浓度/ LC50值，进行风险性分析（见表10）:
表10 农药对家蚕的毒性与风险性等级划分
23
毒性等级
剧毒
高毒
中毒
低毒 LC50（mg/kg桑叶） LC50≤0.5 0.5＜LC50≤20 20＜LC50≤200 LC50＞200 风险性等级 极高风险性 高风险性 中等风险性 低风险性 田间施药浓度/ LC50 ＞10 1.0~10 0.1~1.0 ＜0.1
熏蒸试验是针对卫生用药模拟室内灭蚊条件下进行的试验，如果家蚕的死亡率大于10%以上时，即可视对家蚕有危害风险性，应在蚕室内及附近禁止使用。
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验生物的名称、来源、大小及饲养情况。
③ 试验条件：试验温度、试验方法等。
④ 试验液的浓度、24h、48h、96 h的LC50值和95%置信限，并给出所采用的计算方法。
⑤ 对照组家蚕是否出现死亡及异常反应。
⑥ 观察到的效应，如受试家蚕的任何不正常的行为、中毒症状等。
⑦ 试验结果及毒性评价。
2.2.4鱼类毒性试验
通过测定农药对鱼类的LC50，评价农药对鱼类的急性毒性，提供农药对生态环境影响的资料。鱼类的急性毒性测定方法有静态法、半静态法与流动法三种。最常用的是半静态法，即在试验期间每隔12h或24h更换一次药液，以保持试验药液的浓度不低于初始浓度的80％。
（1）试验材料
试验生物：试验鱼种可选用斑马鱼（Brachydonio rerio）（体长3?0.5 cm，体重0.3?0.1 g）、鲤鱼（Cyprinus carpio）的幼鱼（体长3~4 cm）等作材料。 试验用鱼健壮无病，大小一致。试验前在与试验时相同的环境条件下驯养7~14 d，驯养期间每天喂食1~2次，曝气充氧，每日光照12~16 h，及时清除粪便及食物残渣。试验前24 h停止喂食。
24
稀释水：试验用稀释水为经活性碳处理并曝气处理24h以上的自来水。水质硬度在150~300mg/L之间（以CaCO3计），pH值在6~8.5之间，溶解氧保持在
5.8mg/L以上。
试验溶液的制备：易溶于水的农药用蒸馏水配制成母液；难溶于水的用超声波粉碎法制备，也可加入低毒的有机溶剂或乳化剂（如丙酮或吐温-80）助溶，用量小于0.1 mL/L，并在试验时设置溶剂对照组。母液每日配制一次，比较稳定的物质二日配制一次，配好后低温存放。试验时用母液稀释配制成不同浓度的试验溶液。
试验条件：室温保持在20~25?C，光照采用自然光照。
参比物质：重铬酸钾（K2Cr2O7），分析纯。
主要仪器设备：溶解氧测定仪、温度计、15L玻璃缸、量筒等玻璃器皿及尼龙纱网等。
（2）试验方法
① 预试验
预试验按正式试验的条件，以较大的间距设若干组浓度。每处理组放入10尾鱼，观察并记录受试鱼96h的死亡情况和中毒症状。通过预试求出受试鱼最高全存活浓度及最低全致死浓度，为正式试验确定浓度范围。
② 正式试验
在预试验确定的浓度范围内以一定级差间距设置5~7个浓度组，并设一个稀释水对照组，使用有机溶剂助溶的增设溶剂对照组，每个浓度组重复三次。每缸放入鱼10尾，试验开始后6h内随时观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡率，其后于24 h、48 h、72h、96h观察并记录受试鱼的中毒症状及死亡率，及时清除死鱼。每天测定并记录试液温度、pH及溶解氧。
为检验本实验室的设备、条件、方法及试验鱼的质量是否合乎要求，设置“参比毒物”作方法学上的可靠性检验。在相同的试验条件下，以重铬酸钾为参比毒物，斑马鱼作试验材料，其24h-LC50必须处于200~400 mg/L之间。对照组鱼的死亡率不得超过10%，否则试验无效，须换一批鱼重做。
（3）数据处理
鱼类96h-LC50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计 25
算。
（4）质量控制
① 驯养期间死亡率不得超过5%；空白对照组死亡率不超过10%。
② 以重铬酸钾为参比物质，斑马鱼为试验材料，24h-LC50必须处于200~400 mg/L之间。
③ 试验期间，试验溶液的溶解氧含量不低于5.8 mg/L。
（5）评价标准
农药对鱼类毒性等级划分标准分为四级（见表11）：
表11 农药对鱼类的毒性等级划分标准
毒性等级
剧毒
高毒
中毒
低毒 96h-LC50 (mg/L) LC50≤0.1 0.1＜LC50≤1.0 1.0＜LC50≤10 LC50＞10
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度和理化性状。
② 试验鱼名称、来源、大小及驯养情况。
③ 试验条件：水温、光照、溶解氧、pH值、水质等。
④ 试验液浓度及试验开始后24、48、72、96h的LC50值和95%置信限、中毒症状及所采用的计算方法。
⑤ 对照组鱼的死亡率、行为反应异常的比例。
⑥ 试验结果及毒性评价。
2.2.5溞类毒性试验
溞类是重要的浮游动物，对毒物非常敏感，是评价化学物质环境生态毒性的重要的指示生物。测定农药对溞类的EC50或LC50，来评价农药对溞类的急性毒性。水溞活动受抑制的判断标准是缓慢摇动试验容器，15s内受试溞失去游动能力；水溞死亡的判断标准是其心脏停止跳动。
（1）试验材料
试验生物：大型溞（Daphnia magna straus）或其它的繁殖参数与大型溞可比的溞类。保持良好的培养条件，使大型溞的繁殖处于孤雌生殖状态。选用实验 26
室条件下培养3代以上、出生6~24 h的幼溞，幼溞必须健康、活泼。
主要仪器设备：溶解氧测定仪、数字式酸度计、玻璃器皿等。
试验用稀释水：自来水经活性碳柱过滤，去除水中余氯及杂质，再用充气泵曝气至少24 h后使用。稀释水的理化参数为：pH 6.5~8.5，水质硬度在150~300 mg/L之间（以CaCO3计），Ca/Mg比例接近于4?1，溶解氧5.8mg/L以上，并不含有任何对大型溞有毒的物质。
试验溶液的制备：易溶于水的物质溶解于蒸馏水中配成贮备液，置冰箱内低温保存。试验时取规定量的贮备液加入到稀释水中配成所需浓度的试验溶液。难溶于水的物质可加入低毒的有机溶剂或乳化剂助溶，助溶剂在试验液中的浓度小于0.1mL/L，并在试验中设稀释水对照组和最大浓度的溶剂对照组。
参比物质：重铬酸钾（K2Cr2O7），分析纯。
（2）试验方法
试验条件：试验前的培养温度与试验温度（20±20C）基本一致，自然光照。培养大型溞的实验室及生化培养箱内不含有对大型溞有害的气体、粉尘等物质。
预试验：正式试验前，为确定试验浓度范围，需先进行预试验。预试验可采用较宽的浓度间距设置若干浓度组，每一浓度放5只幼溞，求出受试物质使大型溞100%活动受抑制的最低浓度和全不抑制的最大浓度，在此范围内设置正式试验的浓度。
正式试验：根据预试验的结果确定正式试验的浓度范围，按一定间距设置5~7个浓度组。试验用100 mL的烧杯装50 mL试验液，放入幼溞10只，每个浓度设3个平行。试验设1个稀释水空白对照组，使用溶剂助溶的还需设置溶剂对照组。试验开始后于24、48 h定时观察，记录每个容器中试受大型溞活动受抑制数。
大型溞敏感性和试验步骤合格性的检验：按上述试验步骤定期测定重铬酸钾对大型溞的24h-EC50。在20?C条件下，重铬酸钾对大型溞的24h-EC50为0.6~1.7 mg/L。如测定值在此范围之外，应检查试验步骤是否严格，并检查大型溞的培养方式，必要时重新获取试验用溞。
（3）数据处理
EC50的计算可采用寇氏法或概率单位图解法计算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
（4）质量控制
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① 对照组试验不活动水溞数少于10%。
② 试验过程中受试物浓度不低于规定浓度的80%。
③ 定期进行参比物质试验，20?C条件下，重铬酸钾对大型溞24h-EC50必须处于0.6~1.7 mg/L之间。
④ 试验操作及试验过程中溞类不能离开水，转移时要用玻璃滴管。
（5）评价标准
农药对溞类毒性等级划分标准分为四级（见表12）：
表12 农药对溞类的毒性等级划分标准
毒性等级
剧毒
高毒
中毒
低毒
48h-EC50 (mg/L) EC50≤0.1 0.1＜EC50≤1.0 1.0＜EC50≤10 EC50＞10
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验溞名称、来源、溞龄及培养条件。
③ 试验条件：水温、光照、溶解氧、pH值及水质等。
④ 试验液的浓度、试验开始后24、48h的EC50值及95%置信限及中毒症状，并给出所采用的计算方法。
⑤ 试验结果与毒性评价。
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2.2.6藻类毒性试验
藻类生长抑制试验用于评价农药对藻类在种群水平上的影响。通过测定农药对藻类的EC50，评价农药对藻类的急性毒性，提供农药对生态环境影响的资料。农药对藻类的EC50用藻类生长抑制率表示。
（1）试验材料
受试藻种：试验可采用普通小球藻（ChLoreLLa vuLgaris）、斜生栅列藻（Scenedesmus obLiquus）、羊角月芽藻（Seoenastrum capricornutum）。
主要仪器设备：数字式酸度计、血球计数板、分光光度计、显微镜、生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅及玻璃器皿等。
培养基：推荐选用水生4号培养基，也可选用其它培养基，但要提供培养基名称和配方。
水生4号培养基配方：
硫酸铵 (NH4)2SO4 0.200 g
过磷酸钙 [Ca(H2PO4)2·H2O·（CaSO4·H2O）]饱和液 1mL 硫酸镁 MgSO4?7H2O 0.080 g
碳酸氢钠 NaHCO3 0.100 g
氯化钾 KCl 0.025 g
三氯化铁 FeCl3 1% 溶液 0.150mL
土壤浸出液 0.500 mL
蒸馏水 1000 mL
土壤浸出液用园田土和水以1?1混合，充分摇匀，静置澄清24 h，取上清液过滤。滤液高压蒸汽灭菌后贮存备用，使用期一年。
按以上配方配制成10倍的贮备液高压灭菌，使用时用无菌蒸馏水稀释。 待测样品的制备：可溶于水的样品用无菌蒸馏水配制成一定浓度的母液，置于冰箱内保存备用。难溶于水的样品可使用助溶剂、乳化剂或分散剂助溶，但助溶剂的浓度不得超过0.1 mL/L，且不能影响培养液的透光性。
藻种的预培养及培养条件：试验藻种以无菌操作法接种到装有培养液的三角瓶内，在规定的条件下培养。每隔96 h接种一次，反复接种2~3次，使藻类基本达到同步生长阶段，以此作为试验藻种。每次接种时在显微镜下观察，检查藻种的生长情况。在24?2?C，白色荧光灯连续光照下培养，光强4000~6000 Lux（?10%），也可以14?10或12?12光暗比光照。振荡培养或静置培养时，每天需 29
定时摇动5~6次。
（2）试验方法
预试验：藻类的培养用250 mL三角瓶，每瓶中加入培养液100 mL，使其起始浓度达104个/mL，在无菌条件下培养。预试验的目的在于探明受试物质对藻类生长抑制的半抑制浓度EC50的大致范围，可以较大的间距设置4~5个浓度组，尽可能使EC50值落在所设置的浓度范围内。
正式试验：根据预试验的结果设置5~7个浓度组，并设一个空白对照组，使用助溶剂的还须增设溶剂对照组，各浓度组设3个重复。试验历时96 h，每隔24h取样，在显微镜下用血球计数板准确计数藻类的细胞数，或用分光光度计在波长600~750nm处直接测定藻类的吸光率。用血球计数板计数时，同一样品至少计数两次，如计数结果相差大于15%，应予重复计数。
（3）数据处理
确定受试物质的浓度与藻类生长抑制的浓度效应关系，可采用生物量比较法，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
生物量的比较：处理组藻类生物量抑制的百分率按下式计算：
B?N空白?N处理
N空白 ?100
式中，B—处理组生物量抑制的百分率，%；
N空白—空白对照组测定的藻类细胞数，个/mL；
N处理—处理组测定的藻类细胞数，个/mL。
在半对数纸上以浓度对数为横坐标，以B为纵坐标，用直线内插法求出生物量抑制50%的毒物浓度，即为EC50。
（4）质量控制
① 试验用藻必须是处于对数生长期的纯种藻。
② 对照组和各浓度组的试验温度、光照等条件完全一致。
③ 试验起始藻量应控制在1×104个/mL以内。
（5）评价标准
农药对藻类毒性等级分为三级（见表13）：
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表13 农药对藻类的毒性等级划分标准
毒性等级
高毒
中毒
低毒 96h-EC50 (mg/L) EC50≤0.3 0.3＜EC50≤3.0 EC50＞3.0
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度和。
② 试验生物名称、来源、培养基及培养方法。
③ 试验条件：试验期和持续时间、温度、光强和光质、试验容器（容量、型号、密闭方法）、静置、振荡或通气方式、测试液体积、pH、溶剂及其浓度、藻类生长的测定方法等。
④ 受试样品的浓度与抑制曲线图，得出的EC50值并注明计算方法。
⑤ 观察到的效应：细胞颜色、形态和大小变化；粘连或聚结情况；死亡情况、抑藻或杀藻效应等。
⑥ 试验结果与毒性评价。
2.2.7蚯蚓毒性试验
蚯蚓是土壤生态系统中一个重要的组成部分，在生态食物链中，它是陆生生物与土壤生物之间物质传递的桥梁。通过测定农药对蚯蚓的LC50，评价农药对蚯蚓的急性毒性，提供农药对生态环境影响的资料。供试土壤的种类不同，导致农药对蚯蚓的毒性程度也有差别。试验可采用有代表性的耕地土壤或用人工配制的标准土壤作为试验材料。
（1） 试验材料
试验动物：推荐选用赤子爱胜蚯蚓（Eisenia foeLide）
试验用土：采用有代表性的耕地土壤或用人工配制的标准土壤，土壤经风干磨细，过5mm筛。
主要仪器设备：培养箱、标本瓶。
试验条件：培养箱内温度20?1?C、湿度80~85％。
（2）试验方法
供试农药用制剂或纯品，对难溶于水的农药，可用丙酮助溶。采用耕地土壤时须用酸性、中性、偏碱性的三种土壤。按正式试验方法先做预试，求出农药对 31
蚯蚓全致死的最低浓度和全存活的最高浓度，正式试验在此范围内按浓度级差设置5~7处理组，并设一组不加农药的空白对照，每个处理均设3个重复。在标本瓶中放500g土，加入农药溶液后充分拌匀（如用有机溶剂助溶时，需将有机溶剂挥发净），加适量蒸馏水，调节土壤水分含量达20％。每个处理放入蚯蚓10条，用纱布扎好瓶口，将标本瓶置于20?1?C、湿度80~85％的培养箱中。试验历时二周，于第7天和第14天倒出瓶内土壤，观察记录蚯蚓的中毒症状和死亡数字，及时清除死蚯蚓。根据蚯蚓7天和14天的死亡率，求出农药对蚯蚓的毒性LC50值及95％置信限（mg/kg土壤）。
（3）数据处理
LC50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
（4）质量控制
① 空白对照组死亡率不超过10%。
② 试验期间，应保持试验室条件正常，如出现各种原因的故障，须重新试验。
（5）评价标准
按照LC50值的大小将农药对蚯蚓的毒性划分为四个等级（见表14）：
表14 农药对蚯蚓的毒性等级划分标准
毒性等级
剧毒
高毒
中毒
低毒 LC50 (mg/L) LC50≤0.1 0.1＜LC50≤1.0 1.0＜LC50≤10 LC50＞10
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验蚯蚓名称、来源、大小及健康情况。
③ 试验条件：试验温度、光照等。
④ 试验液的浓度及试验开始后7天及14天的LC50值和95%置信限，并给出所采用的计算方法。
⑤ 对照组蚯蚓的死亡率、行为反应异常的比例。
⑥ 供试土壤采用耕地土壤时，需附上土壤理化性质资料，采用人工土壤时， 32
需注明配方与配制方法。
⑦ 试验结果与毒性评价。
2.2.8土壤微生物毒性试验
土壤微生物的活性是土壤肥力的一个重要指标，而农药施用直接影响土壤微生物活性，因此农药对土壤微生物的影响是评价农药对生态环境安全性的重要指标。一般以土壤微生物呼吸作用即CO2的释放量来衡量土壤中微生物的总活性。本准则采用直接吸收法（密闭法）测定CO2的释放量。
（1）试验材料
供试土壤：两种有代表性的新鲜土壤，提供土壤pH、有机质、代换量、土壤机械组成等数据。
试剂：0.1mol/L氢氧化钠溶液，用无CO2的蒸馏水配好后进行标定； 0.05 mol/L盐酸溶液，配好后需标定；
1 mol/L氯化钡溶液，用无CO2的蒸馏水配制，以防止干扰； 1%酚酞指示剂。
供试农药：用制剂，也可用原药或纯品。
主要仪器设备：培养箱、标本瓶及玻璃器皿。
（2）试验方法
试验装置及试验条件：采用容积为2L的标本瓶，标本瓶内放置两只100mL的小烧杯，其中一只盛放土壤，另一只盛放碱液用以吸收土壤微生物呼吸所释放的CO2。本试验在生化培养箱中进行，温度为25?10C，不需光照。
试验操作：每种土壤设三种不同浓度处理，以模拟农药常用量、10倍量、100倍量时土壤表层10cm土壤中的农药含量，同时设不加农药的对照，每组重复三次。难溶于水的农药，可用丙酮助溶，将药液先与少量土混匀，待丙酮挥发净后，再均匀拌入到处理的土壤中。每个处理用土50克，将土壤含水量调节成田间持水量的60%（试验过程中保持土壤含水量一致），装于100mL小烧杯中，与另一个装有标准碱液的小烧杯一起置于2升容积的密闭瓶中，于25±1℃的恒温箱中培养。试验开始后的第1，2，4，7，11，15d时更换出密闭瓶中的碱液测定吸收的CO2含量。当打开密闭瓶更换碱液时，同时更换了密闭瓶中的空气，以保证密闭瓶中的氧压维持在一定水平。将取出的碱液放入100 mL三角瓶中，加入BaCl2溶液，再加入酚酞指示剂，用标准HCl溶液滴定至红色消失。
33
（3）数据处理
CO2释放量的计算
CO2释放量（mg/g）=?V1??C1?V2?/C2??C2?22 m
式中：V1?氢氧化钠吸收液体积，mL；
V2?滴定时消耗盐酸的体积，mL；
C1?标定盐酸的浓度，mol/L；
C2?标定氢氧化钠的浓度，mol/L；
m?实验土壤质量，g。
影响率计算
影响率（%）=处理组CO2释放量?对照组CO2释放量?100% 对照组CO2释放量
影响率指农药对土壤微生物呼吸强度的影响率。影响率包括抑制率和促进率，农药处理土壤呼吸强度低于对照土壤时，表现为抑制；农药处理土壤呼吸强度高于对照土壤时，表现为促进。
（4）质量控制
① 各处理土壤中，农药的加入量、农药在土壤中的均匀度要保持一致。 ② 培养期间，各标本瓶要保持密闭。
③ 滴定操作时，对滴定终点的判断要准确一致。
（5）评价标准
将农药对土壤微生物的毒性划分成三个等级。土壤中农药加量为常量，在15天内对土壤微生物呼吸强度抑制达50%作为高毒；土壤中农药加量为常量10倍，能达到上述抑制水平的划分为中毒；土壤中农药加量为常量100倍，能达到上述抑制水平的划分为低毒。
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验土壤的来源、理化性质及土壤类型。
③ 试验条件：采用的稀释水、培养箱温度等。
④ 试验期间各处理土壤中加水的频率和方法
⑤ 每一浓度受试土壤的量、重复数、溶剂（如果用到）、培养时间
34
⑥ 数据分析方法、土壤CO2释放量随时间变化的曲线图、农药对对土壤微生物呼吸强度的影响率。
⑦ 试验结果与毒性评价。
2.2.9天敌赤眼蜂毒性试验
农药田间施用时容易造成对非靶生物天敌的危害，非靶生物天敌种类很多，赤眼蜂在我国分布很广，且已有人工养殖，供试蜂种为稻螟赤眼蜂与欧洲玉米螟赤眼蜂。
（1）试验材料
供试生物：供试蜂种为稻螟赤眼蜂与欧洲玉米螟赤眼蜂。
供试寄主：米蛾卵
试验器皿：直径为9cm的培养皿、指形管
试验条件：试验温度25±2℃、相对湿度70-80%。
（2）试验方法
供试农药按一定浓度级差配制成5~7个处理组，并设溶剂与空白对照，每组用100~200粒寄生卵作试验，赤眼蜂的发育期分为卵、幼虫、预蛹和蛹及成蜂五个阶段。田间施用农药时，各个发育期均有可能遭受危害。试验均以米蛾卵为寄主，对稻螟赤眼蜂接种后24h内为卵期，至96h内为预蛹期，至168h内为蛹期；将接种好的卵置于培养皿内，按上述时间范围内，分别于各发育期定量喷洒农药，晾干后装于指形管中培养，观察记录其羽化率。成蜂的毒性试验，先将农药溶于丙酮中，定量的加入指形管中滚吸成药膜管，然后将蜂放入药膜管中爬行1h后转入无药指形管，封紧管口，并饲喂蜂蜜，24h检查统计管中死亡和存活蜂数。求出LC50值和95%的可信限值。
（3）数据处理
LC50的计算可采用直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
（4）质量控制
① 空白对照组死亡率不超过10%。
② 试验期间，应保持试验室条件正常，如出现各种原因的故障，需重新试验。
（5）评价标准
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农药对赤眼蜂的毒性评价目前国内外尚无统一的标准，可用安全系数评价农药使用对赤眼蜂的安全性，安全系数为赤眼蜂的半致死浓度LC50与该药的田间推荐施用浓度的比值或农药对赤眼蜂的半致死量LD50与该药的田间推荐施用浓度和虫体接触液量（接触量以室内点滴试验时用0.5?L/头量计）之积的比值，可用如下公式来表示：
赤眼蜂的毒性LC50(mg/L)
安全系数= 或
田间实际使用浓度(mg/ L)
赤眼蜂的毒性LD50(?g/头)
安全系数= 田间实际使用浓度(mg/L)?虫体接触液量(?L/头)?10-3
将农药对赤眼蜂的危害影响风险性等级划分为四级（见表15）：
表15 农药对赤眼蜂的风险性等级划分标准
风险性等级
极高风险性
高风险性
中风险性
低风险性 安全系数 安全系数≤0.05 0.05＜安全系数≤0.5 5＜安全系数≤0.5 安全系数＞5
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度。
② 试验物种名称、来源、培养方法。
③ 试验条件：试验温度、光照等。
④ 试验液的浓度及试验开始后24、96及168h的LC50值和95%置信限，并
给出所采用的计算方法。
⑤ 对照组赤眼蜂的死亡率、行为反应异常的比例。
⑥ 试验结果与毒性评价。
2.2.10天敌两栖类毒性试验
蛙类是两栖类中最常见的害虫天敌，是自然保护的主要对象之一。蛙类的生长分为卵、蝌蚪、幼蛙和成蛙四个发育阶段，其中以蝌蚪期对农药的反应最敏感。农药对两栖类的毒性试验，选用泽蛙的蝌蚪为试验材料。
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（1）试验材料
供试生物：采用泽蛙（Rana Limnocharis）蝌蚪，蝌蚪龄期为孵化10天左右，平均长度（连尾）约16mm。试验前在室内预养3天，试验前一天停止喂食，试验中亦不喂食。
试验药品：供试药品用制剂或纯品，溶于水或植物油中，配制成一定浓度供试验用。对难溶于水的农药，可用少量丙酮或吐温-80助溶，用量不得>0.1mL/L。
试验容器：10L玻璃缸。
试验用水：试验用稀释水为经活性炭处理、存放并曝气处理24 h以上的自来水。水质硬度在150~300 mg/L之间（以CaCO3计），pH在6.0~8.5之间，溶解氧保持在5.8mg/L以上。
试验条件：试验温度20℃左右，自然光照，光暗时间比为16：8，自然交替。
（2）试验方法
试验采用每隔24h更换一次药液的半静态法。正式试验前先作预试，然后在最高安全浓度与最低全致死浓度范围之间按等比级差设5~7个处理，并设空白对照，每缸分别配制不同浓度的药液各5L，充分搅拌均匀，每个处理均设三个重复。在每个试验缸内投放蝌蚪20尾，调节试液温度在20℃左右。试验历时二天，隔24h更换一次药液，试验过程中记录24h与48h蝌蚪的中毒情况和死亡数字，及时清除死蝌蚪，并测定溶解氧和pH。 求出LC50值与95%的可限值。
（3）数据处理
LC50的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算（具体计算方法参见2.2.1数据处理），也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。
（4）质量控制
① 驯养期间死亡率不得超过5%；空白对照组死亡率不超过10%。
② 试验期间，试验溶液的溶解氧含量应不低于5.8 mg/L。
（5）评价标准
农药对蛙类毒性等级划分标准，一般按LC50(48h)值划分为四个等级（见表
16）。
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表16 农药对蛙类的毒性等级划分标准
毒性等级
剧毒
高毒
中毒
低毒 48h-LC50 (mg/L) LC50≤0.1 0.1＜LC50≤1.0 1.0＜LC50≤10 LC50＞10
（6）试验报告
① 受试样品名称、来源、纯度和理化性状。
② 试验生物名称、来源、大小及驯养情况。
③ 试验条件：试验温度、光照等，所采用稀释水的温度、溶解氧浓度及pH
等。
④ 试验液的浓度及24h、48h的LC50值和95%置信限，并给出所采用的计
算方法。
⑤ 对照组蝌蚪的死亡率、行为反应异常的比例。
⑥ 试验结果与毒性评价。
2.2.11作物的敏感性试验
通过研究作物发育阶段对农药的敏感性，评价长残留农药对主要后茬作物的危害影响。测定作物敏感性的方法有土培法和水培法。
（1） 供试材料
供试植物:选择对农药最敏感的植物或直接受影响的植物作为试验材料。选择三种主要敏感作物进行试验。
试验农药: 采用制剂进行试验。
（2） 试验方法
土培法：选用直径20cm的盆钵，装入土壤，土壤用定量的供试农药充分拌匀，播入10粒种子，然后将盆钵置于温室中，土壤保持一定的含水量，浇水时从底部吸湿法加水。定期（7天、14天，必要时延长时间）观察记录出苗率、苗高、植物受害率。试验结束时，记录出苗率、苗高、苗鲜重、植物受害率、植物死亡数。对抑制根系生长的药物，须记录根鲜重、长度。利用概率统计法计算EC50和95%置信限。
试验时先通过预试确定毒性影响范围，正式试验时，在此范围内按一定的比 38
例级差设置若干组不同浓度的处理（以mg/kg干土表示），另设一组空白对照，每
个处理设3个重复。
水培法：选用籽粒饱满、大小一致的植物种子，先在合适的条件下催芽，选择根长0.2~0.4cm的发芽种子待用。在培养皿中垫5张滤纸（或石英砂、玻璃珠），加入配制好的农药药液，每皿播10粒已催芽的种子，在25℃恒温箱中先避光培养72h，再光照24h，培养过程中需适量加水，以保持滤纸湿润，培养4d后取出测主根长度。试验时先通过预试确定毒性影响范围，正式试验时，在此范围内按一定的比例级差设置若干组不同浓度的处理（以mg/L表示），另设一组空白对照，每个处理设3个重复。用概率统计法求出农药对根长的半抑制浓度EC50值与95%的可信限，用EC50值的大小评价农药对植物的毒性大小。
（3）数据处理
用概率统计法求出EC50值及95%可信限。
（4）质量控制
① 发芽率低的种子不能用于试验。
② 记录试验土壤的类型、基本性质；记录试验期间光强、温度、湿度、光周期、浇水周期及方法、害虫控制等。
③ 试验设计最小设五个处理浓度，试验必须做出相应的曲线能得到EC50及EC10值。
（5）评价标准：
农药对作物的毒性评价目前国内外尚无评判标准，可用安全系数评价农药使用对作物的安全性，安全系数为农药对作物的EC10与后茬作物种植前土壤中农药浓度的比值，可用如下公式来表示：
作物的EC10
安全系数
土壤农药浓度
将农药对作物的危害影响风险性等级划分为四级（见表17）：
表17 农药对作物的风险性等级划分标准
风险性等级
极高风险性
高风险性
中风险性
低风险性
39 安全系数 安全系数≤1 1＜安全系数≤2 2＜安全系数≤10 安全系数＞10
（6）试验报告
① 供试植物：学名，来源。
② 供试农药：含量，来源，主要使用情况。
③ 供试土壤：pH、有机质含量、阳离子代换量、机械组成等。 ④ 主要仪器设备：培养箱、分析仪器等。
⑤ 试验条件：温度、持水量、试验浓度。
⑥ 试验结果：各处理浓度及处理的出苗率、苗度、苗干重、根长、受害程度、死亡数、EC50、EC10等。
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参考文献
1. 蔡道基等.国家环境保护局. 化学农药环境安全评价试验准则. 1989
2. 阎雷生等.国家环境保护局化学品测试准则.北京：化学工业出版社，1990
3. 国家技术监督局,国家环境保护局. 水质—物质对溞类(大型溞)和淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法. 中华人民共和国国家标准GB/T 13266-13267-91
4. 蔡道基.农药环境毒理学研究[M].北京:中国环境科学出版社,1999.128~134
5. 中国科学院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物学研究法.北京:科学出版社,1985.217~21
6. OECD. OECD Guidelines for testing of chemicals: Hydrolysis as a function of pH. No111, 1981
7. USEPA. Sediment and soil adsorption/desorption isotherm. EPA712-C-96-298，April 1996
8. USEPA Ecological effects test guidelines OPPTS 850.1730. Fish BCF EPA712-C-96-129，April 1996
9. ISO6341. Water quality-determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus. Second edition, 1989-10-01
10. USEPA. Ecological effects test guidelines. OPPTS 850.1010 Aquatic invertebrate acute toxicity test, freshwater Daphnids.EPA712-C-96-114, April 1996
11. OECD. OECD guidelines for testing of chemicals 202. Daphnia sp., acute immobilization test and reproduction test.1984
12. USEPA. Ecological effects test guidelines. OPPTS 850.5400 Algal toxicity, tiersⅠand Ⅱ.EPA712-C-96-164, April 1996
13. OECD. OECD guidelines for testing of chemicals 201.Alga, growth inhibition test.1984
14. USEPA. Ecological effects test guidelines. OPPTS850.3020. Honey bee acute contact toxicity. 1996, EPA712-C-96-147
15. OECD. OECD Guidelines for the testing chemicals, Honeybees, acute contact toxicity test, OECD214, 1998
16. OECD. OECD Guidelines for the testing chemicals, Honeybees, acute oral toxicity test, OECD213, 1998
17. USEPA. Standard evaluation procedure, Honey bee acute contact LD50 test. report 41
No. 1985, EPA-540/9-85-002
18. OECD. OECD Guidelines for testing of chemicals. 207 Earthworm acute toxicity tests
19. USEPA. Ecological effects test guidelines. OPPTS850.5100.Soil microbial community toxicity test. EPA712-C-96-161, April 1996
20. Guidelines on environmental criteria for the registration of pesticides. Food and agriculture organization of the United Nations, Roma-March 1985
21. J.F.McCarthy and R.A.Robinson:评估农药对环境影响的方法，19xx年美国FMC公司农药部在中国举办的技术交流资料。
22. USEPA. Ecological effects test guidelines. OPPTS 850.4100 Terrestrial plant toxicity, Tier I (Seedling Emergence). EPA 712-C-96-153, April 1996
23. USEPA. Ecological effects test guidelines. OPPTS 850.4200 Seed germination/root elongation toxicity test. EPA 712-C-96-154, April 1996
24. USEPA. Ecological effects test guidelines. OPPTS 850.4225 Seedling emergence, Tier II.EPA 712-C-96-363, April 1996
25. USEPA. Ecological effects test guidelines. OPPTS 850.4230 Early seedling growth toxicity test. EPA 712-C-96-347, April 1996
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