质粒DNA的提取
一、实验方法
碱裂解法抽提质粒DNA
二、实验原理
基于质粒DNA与染色体DNA变性与复性的差异。
三、实验步骤
1)质粒提取
1. 10,000g,1min离心收集1.5-5ml菌液沉淀于1.5ml离心管中。
2. 加入100ml溶液1,振荡至彻底悬浮。
3. 加入200ml溶液2,立即轻柔颠倒离心管6次,使菌体充分裂解,随后将离心管冰上放置3分钟
4. 加入150ml溶液3,立即温和颠倒离心管数次,冰上放置3分钟,10,000g离心10min。
5. 将步骤4的上清转移至新的离心管(尽量去除杂质),加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合均匀10,000g离心5min。
6. 将步骤5的上清转移至新的离心管,加入2倍体积的无水乙醇,室温放置5-10min,沉降DNA
7. 10,000g离心10分钟,弃乙醇,保留沉淀,加入1ml 70%的乙醇洗涤沉淀, 10,000g离心5分钟
8. 倒掉乙醇溶液,用吸水纸吸净管壁上的水珠,室温蒸发痕量乙醇
9. 加入适量含RNase的TE或灭菌双蒸水溶解质粒DNA
2)质粒鉴定®琼脂糖凝胶电泳
灌胶:胶中加入荧光染料(SYBR Green I)
加样:质粒+上样缓冲液®混匀
电泳
结果观察:UV灯下
四、实验结果
五、实验分析
裂解细胞中除含有质粒DNA外,还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂类等物质,因此用碱裂解法除去杂质
1、防止DNA裂解:Solution 1
1)、所含糖增加溶液黏度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切作用降解
2)、所含EDTA抑制酶活性
2、溶解与变性:Solution2
1)强碱使质粒DNA和染色体DNA变性
2)离子型表面活性剂SDS可溶解膜蛋白
3、沉降与复性:Solution3
1)质粒DNA复性
2)在钾盐中,染色体DNA形成缠连的不溶性网状结构,和不稳定的大分子RNA以及变性的蛋白质和细菌碎片等一起沉淀
预期结果为剩余质粒DNA
4、琼脂糖凝胶电泳
1)荧光染色
染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间
2)琼脂糖可起到电泳和分子筛的作用,因所带电荷、分子量大小和构型不同,泳动速度不同
六、误差分析
实验失败,本组实验出现4条带,3明1暗,明亮处应为DNA分子数最多的,为质粒DNA,质粒DNA前有较暗的两条带,推测其中一条为未复性质粒DNA,可能Solution2处变性过长,不易复性,或Solution3处时间过短,复性不充分。另一条,RNA-DNA杂交链?因染料分子可嵌入双链DNA分子配对碱基之间。因还有一条在亮带后,推测为染色体DNA,推测很大可能性是Solution3处时间过短,沉降不完全。
第二篇:DNA提取+PCR+电泳实验报告
题目:水稻DNA提取,扩增与电泳实验
组别:第三组
一、1掌握DNA的提取技术2掌握PCR的相关操作3掌握了解电泳操作方法和步骤
二、实验原理:1、提取DNA一般用水稻幼叶,先用机械方法液氮研磨植物组织使组织细胞破碎,然后加TPS抽提液水浴提取DNA,最后用无水乙醇沉淀DNA即可。(DNA提取原理)
2、DNA在高温时可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。(PCR原理)3、琼脂糖凝胶电泳:借助琼脂糖凝胶的分子筛作用,核酸片段因其分子量或分子形状不同,电泳移动速度有差异而分离。
三、实验仪器和药品
液氮、镊子、手套、移液枪、枪头2ML和1.5ML离心管、水稻幼叶、研磨棒、琼脂糖、天平、PCR仪、Loading Buffer染色剂、灭菌双蒸水、摇床、离心仪、Taq酶、Mg2+Buffer、dNTP溶液、引物、TPS抽提液、无水乙醇、电泳槽、GoldView、TBE溶液、微波炉、锥形瓶、量筒、PCR板、PCR盖、水浴箱、Marker
四、实验步骤
1、DNA提取
(1)取水稻叶子少量置于2ML离心管内,加入液氮研磨,带磨成粉状后,加1MLTPS抽提液,然后将离心管放入75℃恒温水浴箱中至少半小时。同时将无水乙醇放入-40℃下冷冻
(2)水域结束后,取出离心管放入离心仪中,13600r/min离心12min,然后小心的取出离心管,将上清液转移到1.5ml离心管中0.5ml,加入600ul冷冻的无水乙醇,放入-80℃下冻10min,拿出放入离心仪13600r/min离心5min
(3)到处上清液,倒置,晾干约3h
(4)加入双灭菌水60ml,放入摇床中振荡一夜。
2、PCR
(1)按所需配料表,向PCR板中加入双蒸水,mix,前引物,后引物,然后加入提取的DNA,混匀
(2)将PCR板放入PCR仪中运行SSR程序
3、电泳
(1)称取0.3g琼脂糖和30mlTBE溶液。混匀倒入锥形瓶中,加热溶解混匀。待冷却至不烫手时加入GoldView,混匀,倒入已经插好梳子的配胶槽中,冷却30min至1h
(2)将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中(将有点样孔的一端靠近负极)然后按照顺序点样,每个样的用来那个为4ul,在中间的空上点Marker溶液3ul
(3)打开电泳开关,电泳32min左右
(4)电泳结束后,将胶取出,放入透视镜下照射,拍照,读带
五注意事项
1、 提取dna的时候用乙醇是沉淀时,必须将乙醇冰冻
2、 在PCR之前加2ulDNA时要将枪头插入液面下