围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结
实验一:细胞传代培养
材料:15ml离心管、枪(头1ml、200ul、10ul)、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等
步骤:(以下均在超净台内,酒精灯旁操作)(SKOV-3)
1、打开超净台,将离心管、枪(头)、吸管等工具置于紫外线下照射30min;含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶(密度适中,细胞成梭形连接,贴壁良好),弃旧培养基,PBS 2ml 清洗2次(切勿用力吹打)。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入,然后放平培养瓶,使贴壁细胞与trypsin充分接触,置于CO2培养箱2min左右(时间不能太长,以免损伤细胞)。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml,随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中,离心1000 r/min,5min。
5、弃上清液,加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装,按1:2~3传代,每瓶4~5ml。倒置显微镜下观察(细胞突起消失变圆形,细胞间隙等距),标记。
7、放入CO2培养箱中培养,第二天观察生长状况。
总结:1、在用离心机时,看清楚是RCF还是RPM;调节Temp.以及Time。
2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后,须知用少量培养液清洗一下培养瓶,并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器,拧开或者拧上盖子时,注意在酒精灯上旋转一圈。另外,记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中,动作轻柔,避免产生气泡等。
实验二:细胞冻存
材料:15ml离心管、枪(头1ml、200ul、10ul)、无菌吸管、冻存管、RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等
步骤:(以下均在超净台内,酒精灯旁操作)(OVCAR-3)
1、打开超净台,将离心管、枪(头)、吸管等工具置于紫外线下照射30min;FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶(密度适中,细胞成梭形连接,贴壁良好,汇合度达到95%左右),弃旧培养基,PBS 2ml 清洗2次。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入,然后放平培养瓶,使贴壁细胞与trypsin充分接触,置于CO2培养箱2~3min。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml,随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中,离心1000 r/min,5min。
5、取冻存管一个,往里面分别加入100ul DMSO(须避光保存)、200ulFBS、700ul 1640,用移液枪轻轻吹打混匀。标记好细胞类型,时间等。
6、弃上清液,加入冻存液使成细胞悬液。
7、细胞悬液加入冻存管后,放在降温盒中,置于-80°C冰箱过夜,第二天再放入液氮罐中保存。
总结:1、常用细胞保护剂有甘油和二甲基亚砜(DMSO),可使冰点降低,在缓慢解冻过程中,能够使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
2、细胞冻存和复苏应遵循缓慢降温、快速复苏的原则。细胞冻存中DMSO浓度一般为5%—15%,常用10%。冻存液中血清可促进细胞复苏后的存活率。
2、细胞置于-80°C可保存半年左右,液氮长期保存。
3、冻存细胞从-80°C低温冰箱中转移到液氮罐中,这个操作应该在2min内完成。(冻存管会以10°C/min的速度升温,若温度上升超过-50°C,细胞会迅速恶化)
实验三:细胞复苏
材料:15ml离心管、枪(头1ml)、无菌吸管、培养瓶、RPMI—1640(OVCAR-3)、FBS、PBS等
步骤:(以下均在超净台内,酒精灯旁操作)(OVCAR-3)
1、打开超净台,将离心管、枪(头)、吸管等工具置于紫外线下照射30min;FBS、RPMI—1640放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、快速(2min内)从低温冰箱中取出OVCAR-3细胞置于37°C水浴箱内解冻。
3、往培养瓶中加入1640 10ml,随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中,离心1000 r/min,5min。
4、弃上清液,加入新的培养基,用移液枪轻轻吹打混匀成悬液。
5、按照1:2分装到培养瓶中,做好标记。
6、置于CO2培养箱中培养观察。
总结:1、细胞在-5°C—0°C最易受损,故复苏时应快速置于37°C水浴箱中(尽量2min内完成)。
2、由于DMSO突然稀释会给细胞造成严重的渗透性伤害,稀释细胞存活率降低,复苏后应该缓慢稀释细胞悬液,
3、冻存细胞从-80°C低温冰箱中转移到液氮罐中,这个操作应该在2min内完成。(冻存管会以10°C/min的速度升温,若温度上升超过-50°C,细胞会迅速恶化。)
4、倘若细胞冻存状态不是很好,可用含血清培养基稀释DMSO至终浓度为1%,或者低速离心800rpm左右。
实验四:细胞铺板及siRNA转染
材料:15ml离心管、枪(头1ml、200ul、10ul)、无菌吸管、EP管、6孔板、siRNA、10%FBS的RPMI—1640(SKOV-3)、M5A(OVCAR-3)、PBS、trypsin、SiRNA转染试剂等
步骤:(以下均在超净台内,酒精灯旁操作)
(本实验采用OVCAR—3,VRoche :M siRNA=5:1,培养基V=1ml)
1、打开超净台,将离心管、枪(头)、吸管等工具置于紫外线下照射30min;1640、trypsin、FBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的OVCAR—3细胞培养瓶(密度适中,细胞成梭形连接,贴壁良好),弃旧培养基,PBS 2ml 清洗2次。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入,然后放平培养瓶,使贴壁细胞与trypsin充分接触,置于CO2培养箱2~3min。(细胞突起消失,渐变圆形,细胞间隙增大停止消化)
4、加入1640 1ml配成悬液,随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中,离心1000r/min,5min。
5、弃上清液,加入1640混成1ml悬液;细胞计数。
6、取6孔板分别标记为CTL、NC、S2,孔板先加培养基1ml/孔,然后细胞100ul/孔。倒置显微镜下观察(细胞突起消失变圆形,细胞间隙等距),标记日期,姓名,细胞种类等。
7、取6个无酶EP管,分别标记为CTL、CTL1、NC、NC1、S2、S2a。CTL管、NC管、S2管分别加入无血清的Opti-MEMI培养基100ul,然后用移液枪往三管中各加入10ul的SiRNA转染试剂(Roche); CTL1管、NC1管、S2a管分别加入无血清Opti-MEM I 培养基100ul,然后NC1管、S2a管依次加入7.58ul的NC、7.58ul SiRNA(S2)。最后,CTL1移入CTL、NC1移入NC、S2a移入S2,用移液枪吹打混匀。
7、按CTL组每孔105ul CTL管液;NC组每孔108.79ul NC管液、S2组每孔108.79ul S2管液,依次加入。
8、充分混匀后,放入CO2培养箱中培养48h,western blotting用。
实验五:western印迹法
材料:EP管、15ml离心管、枪(头1ml、200ul、10ul)、高速离心机、分光光度仪、—20°C低温冰箱、摇床、垂直板电泳转移装置、96孔板、PBS(0.01mol/L PH7.3)、细胞裂解液(RIPA+PMSF+磷酸酶抑制剂)、碧云天SDS-PAGE试剂盒、甲醇、PVDF膜、4xSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转膜缓冲液、丽春红染液、考马斯亮蓝溶液、脱脂奶粉、TBST、抗体、显影液等
液体配制:
1×电泳缓冲液:Tris 3.03g + 甘氨酸14.4g + SDS 1g 加蒸馏水至1L(溶解后常温保存,可重复使用3—5次)
10×电泳缓冲液:Tris 30.3g + 甘氨酸144g 加ddH2O,定容至1000ml(此储存液可长期常温保存。配置时,可先加入700ml去离子水,待全部溶解后,加水至1000ml)
转膜缓冲液:Tris 5.8g + 甘氨酸2.9g + SDS 0.37g + 甲醇 200ml 加蒸馏 水1L(溶解后常温保存,可重复使用3—5次)
封闭液(5%):脱脂奶粉5g +TBST 100ml(溶解后4°C保存)
TBST :20x TBS 25ml+ 蒸馏水475ml+ Tween-20 500ul(0.05‰~1‰)
细胞蛋白提取
步骤:
1、准备材料,配备好细胞裂解液(RIPA : PMSF : 磷酸酶抑制剂=100:1:1),置于4°C冰上待用。
2、将六孔板的培养基去掉,用预冷的PBS 1ml/孔,洗2次。
3、加入预冷的细胞裂解液,70ul/孔;置于冰上30min,裂解过程中经常弹一弹使细胞充分裂解。EP管标记为CTL、NC、S2。
4、用细胞塑料刮将贴壁细胞轻轻地刮下。用移液枪将已裂解的细胞分别移入预冷的已标记好的EP管中。
5、将分装标记好的EP管置于—80°C保存待用。
蛋白含量测定
步骤:
1、取已冻存的蛋白液室温融化后,4°C离心12000rpm,30min。
2、将EP管置于4°C冰上,弃去沉淀, 吸取上清液于新的预冷EP管中,分别标记为CTL1、NC1、S2a。
3、取 一个96孔板,采用其中6孔作为标准孔分别加入各种试剂(ul)。
(Total volume:25ul )
4、往三个加样孔中分别加入22. 5ul ddH2O(DDI),CTL1、NC1、S2a三管中各取2.5ul蛋白液分别加入到三个加样孔中。按照反应液A∶B=50∶1,三个样品孔和六个标准孔中分别加入200ul AB混合液。
5、混匀后,放在37°C培养箱中30min。
6、在生物分光光度计上比色分析,制作标准曲线。随后得到样品蛋白质浓度。按照上样蛋白35ug计算蛋白上样体积,加入蛋白上样缓冲液制成电泳上样品,100°C金属浴10min左右即可,—80°C保存备用。
总结:1、当反应液和待测蛋白放在37°C培养箱中30min后,尽快测定蛋白浓度(随反应时间推移,所测蛋白浓度会增高)。
SDS-PAGE电泳
步骤:
1、清洗玻璃板
玻璃板两面先用洗衣粉或者清洁剂轻轻擦洗,然后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后置于烤箱中烘干。
2、灌胶与上样
(1)玻璃板对齐放入夹中卡紧(以免漏胶),然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(2)目的蛋白为:CSTB14KD β-actin43KD,按照碧云天的操作说明,根据蛋白分子量选定分离胶浓度为12%。加入10%AP和TEMED后立即摇匀灌胶(操作过程中避免产生气泡),待胶面升至绿带中间线位置即可停止灌胶,注入适量异丙醇或者蒸馏水(加入时要慢,以免胶被冲变形,确保分离胶在一条水平线上),等待凝胶,此过程约30min—45min。
(3)待异丙醇和胶之间有一条折线时,倒去胶上层异丙醇或者蒸馏水并用吸水纸将水吸干。
(4)按照碧云天说明书配浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀,将剩余空间灌满浓缩胶后将梳子水平插入浓缩胶中(梳子底端离分离胶应该适当距离),待浓缩胶凝固,此过程约30min。
(5)按照小玻璃板面朝内,大玻璃板面向外的原则,将其放入电泳槽中;槽那一边要垫一块塑料板且有字的一面朝外。
(6)测完蛋白含量后,计算含ug蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品至0.5ml离心管中,加入4*SDS上样缓冲液至终浓度为1*。
(7)在电泳槽内加入事先配制好的新鲜电泳液,至少要漫过内侧的小玻璃板,捏住梳子两端竖直向上轻轻将其拔出(加样孔内不能有气泡)。用微量加样器贴壁缓慢吸取样品,插至加样孔中缓慢加入样品(避免产生气泡,加样不要太快,勿交叉使用枪头);最后于电泳外侧槽加入适量电泳液。
3、电泳
浓缩胶跑80V,20--30min。全部酚蓝进入分离胶,绿色的marker出现后,可适量提高电压至120V。电泳至酚蓝距分离胶底部约1cm时即可终止电泳(整个过程需约2h),然后进行转膜。
转膜
步骤:
1、准备6张适当大小的滤纸,和一张PVDF膜;PVDF膜至于甲醇中使整个膜浸湿(约30s)。转膜用的夹子,两块海绵垫,玻璃棒,滤纸均放在转膜液中充分浸泡。
2、将夹子打开使黑的一面保持水平,在上面垫一张海绵垫,随后垫子上垫三层滤纸,一手固定滤纸,一手用玻璃棒赶走里面的气泡。
3、在两个边上轻轻地反复撬玻璃板至松动,直至撬去玻璃板。将浓缩胶轻轻地刮去。小心剥离分离胶,按照marker条带分子量,取胶盖于滤纸上,使其与滤纸对齐。将PVDF膜盖于胶上,轻轻地用玻璃棒擀去气泡。最后分别盖上另外三层滤纸和海绵垫,合起夹子。整个操作在转膜液中进行,要不断擀去气泡。
4、将夹子放入转移槽中,使夹的黑面对槽的黑面,白面对槽的红面。在槽的两边放入一些冰块降温。用70V转移60min左右。
5、转完后将膜用1*丽春红染液在脱色摇床上摇5min,看是否转上蛋白。
封闭、孵抗体与曝光显影
步骤:
1、将膜用TBST浸湿后,移至含5%脱脂奶粉的TBST的缓冲液中,室温下脱色摇床封闭1h。
2、将膜置于兔源anti-CSTB的脱脂奶粉缓冲液中,4°C保存,过夜。
3、次日,将孵有anti-CSTB的膜拿至室温水平摇床在室温下再孵育1h。
4、用TBST在室温下摇床洗三次,每次10min。
5、用含抗一抗的脱脂奶粉缓冲液与膜充分接触,在摇床上摇动1h。
6、用TBST在室温下摇床洗 三次,每次10min。
7、按照显影试剂要求进行化学发光反应。
8、将PVDF膜用TBST清洗三次,每次10min。将将孵有鼠源anti-β-actin的膜拿至室温水平摇床在室温下孵育1h。
9、用TBST在室温下摇床洗三次,每次10min。
10、用抗一抗的脱脂奶粉缓冲液与膜充分接触,在摇床上摇动1h。
11、用TBST在室温下摇床洗三次,每次10min。
12、按照显影试剂要求再次进行化学发光反应。
13、结合两次曝光,记录分析。
第二篇:Western Blot实验步骤
Western Blot实验步骤
蛋白抽提
①把组织剪切成细小的碎片。
②融解Western及IP细胞裂解液,混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。
③按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液(如果裂解液不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量)。
④用玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解。在冰上放置30min。
⑤充分裂解后,4oC 13000g离心30分钟,取上清,其中一部分按1uL样品+4uLPBS稀释后取2uL用于测蛋白浓度。另一部分煮沸10分钟-20oC保存。
蛋白质定量:采用BCA蛋白测定法
①根据样品数量,按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液,充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。
②完全溶解蛋白标准品,取10微升稀释至100微升,使终浓度为0.5mg/mL。用PBS稀释标准品。
③将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20微升加到96孔板的标准品孔中,加用于稀释标准品的溶液补足到20微升。
④加上述稀释5倍的样品2uL加到96孔板的样品孔中,加用于稀释标准品的溶液到20微升。
⑤各孔加入200微升BCA工作液,37oC放置30分钟。
注:也可以室温放置2小时,或60oC放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时,吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低,适量在较高温度孵育,或延长孵育时间。
⑥测定A562的波长,根据标准曲线计算出蛋白浓度。
SDS-PAGE电泳
①根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度,配制SDS-PAGE浓缩胶与分离胶:本实验浓缩胶为3.9%,分离胶为8%和10%。使用Whatman 3 mm 滤纸吸去分离胶上层覆盖的所有溶液,如上配制浓缩胶。用10mL注射器将浓缩胶加入板中至顶端,小心插入梳子,注意不要产生气泡。凝胶聚合1小时左右。凝胶电泳前,拔去梳子。每孔均用1×电泳缓冲液清洗。上、下层电泳槽中加入1×电泳缓冲液,上层槽中缓冲液液面需超过上样孔顶端1-2cm。BioRad电泳槽中需加入500mL的1×电泳缓冲液(50mL的10×储存液+450mL ddH2O)。
②上样:首先将上述160uL样品加入40uL 5×上样缓冲液再加入10uLβ-巯基乙醇煮沸6分钟,根据不同目的蛋白在总蛋白中的含量,一般总蛋白在10-150ug之间都可以,上样的体积根据不同浓度确定,一般<50uL。将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样,标准加进第一个孔中。
③电泳:事先配好电泳缓冲液先60V,待样品到达分离胶即可将电压调至120V,当溴芬兰指示剂到达胶的底部时即可停止电泳。
蛋白质转移:
①如试剂制备中所述,制备足够转移缓冲液以充满转移槽,另外准备200mL用于平衡胶和膜以及润湿滤纸。
②从玻璃板上取下凝胶,去除所有浓缩胶。
③将滤纸、硝酸纤维素膜(事先裁好)、海绵夹浸泡在转移缓冲液中30分钟。
④按照泡沫、滤纸、凝胶、转印膜、滤纸、海绵夹的顺序组装转移夹层。
⑤将转移夹放入转移槽中,确保转移夹的凝胶侧面向阴极(-)而膜侧面面向阳极(+)。向转移槽中加入适量缓冲液,确保转移夹完全浸没。将黑色电极引线(-)插入转移装置的阴极插孔,红色电极引线(+)插入阳极插孔。连接阳极和阴极引线至对应的电源输出端。转膜装置置于冰水中,打开电源100V电泳1小时转移完成后,从槽中取出转移夹,用镊子小心打开转移叠层,纤维素膜,在膜的靠近胶的一面的右上角剪个记号。
免疫检测:
①封闭:取出转好的硝酸纤维素膜,放在5%脱脂奶粉中封闭1-2h,将膜裁剪成一定的大小(利于节省抗体),准备上抗体。
②配一抗:将一抗用一抗稀释液配好。
③上一抗,将抗体放入事先准备的特制小船中,将膜倒扣在抗体上,将小船放在培养皿中,放在垂直摇床上,1h后将之收入4度冰箱过夜。
④将膜取出正面向上后放在塑料盒子中,用事先配好的洗液TBST洗10min×3次。
⑤上二抗及GAPDH(GAPDH 1:10000),方法同一抗,摇床摇1h后取出。
⑥TBST洗10min×3次。
⑦取等量的ECL发光剂A,B(放在不同的管子中),将硝酸纤维素膜正面向上放在保鲜膜上,将A,B液取出混匀滴在膜上,1min左右后将膜上的发光剂去掉(注意:不可干掉),将膜放置LAS-4000 mini(Fujifilm)中显影成像。
所用试剂
(1) Western及IP细胞裂解液:碧云天生物技术研究所
(2) PMSF
(3) PBS
(4) BCA法蛋白定量试剂盒:碧云天生物技术研究所
1) ddH2O
2) 30%丙烯酰胺:碧云天生物技术研究所
3) 1mol.L-1 Tris-HCl(pH6.8):碧云天生物技术研究所
4) 1.5 mol.L-1 Tris-HCl(pH8.8):碧云天生物技术研究所
5) 10%SDS:SDS 10g,加ddH2O至100mL,调pH值至7.2
6) 10%AP:过硫酸铵1g,加ddH2O至10mL,4oC保存
7) TEMED
8) 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液:Tris 15.5g,甘氨酸94g,10%SDS 50mL,加ddH2O至1L
9) 5×上样缓冲液:碧云天生物技术研究所
10) 蛋白Marker:Thermo公司
11) 转膜缓冲液:Tris碱0.03g,甘氨酸 14.4g,甲醇200mL,加ddH2O至1L
12) 甘氨酸:国药集团化学试剂有限公司
13) 吐温-20:国药集团化学试剂有限公司
14) Tris:上海爱紫特生物科技有限公司
15) 甲醇:国药集团化学试剂有限公司
1) 封闭液:称取5g脱脂奶粉溶入100mlTBST中,4oC保存
2) Western一抗稀释液:碧云天生物技术研究所
3) 单/多克隆抗体:abcam公司/Sigma公司/Cayman公司
4) GAPDH:康成生物
5) 10×TBST:NaCl 90g,Tween-20 10mL,1mol.L-1 Tris-HCl(pH7.5)250mL,加ddH2O至1000ml,临用时稀释10倍
6) ECL发光剂