实验四 酵母菌的形态观察, 死活细胞鉴别,微生物测量技术,显微镜直接计数法

姓名：李昳昕 年级专业：08药学节次：周一90节组数：第五组

一、实验目的

1．观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

2．了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造及使用原理，掌握测定微生物细胞大小的方法。

3．了解血球计数板的构造和使用方法,学会用血球计数板对酵母细胞进行计数。

二、实验原理

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。用美蓝对酵母的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型。因此，具有还原能力的酵母细胞是无色的，而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色。

微生物细胞的大小是微生物重要的形态特征之一，由于菌体微小，只能在显微镜下测量。用于测量微主物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成50等分，或把 10 mm长度刻成 100等分。测量时，将其放在接目镜中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间物像重叠)用于测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 (目镜微尺)

镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的专用载玻片，一般将lmm等分为100格，每格长10μm，每格长（0.01mm），是专门用来校正目镜测微尺的。校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成像进入视野，即镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞大小。

（镜台微尺）

（目尺校准）

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（ 0．1mm2），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。

血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室，微生物的计数就在计数室中进行。

计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格。

 （血球计数板）

（血球计数板计数室）

每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0．1mm，所以计数室的容积为0．1mm3。

在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，因1ml=1cm3=1000mm3，那么，一个大方格中的总菌数，故。1ml菌液中的总菌数=A/5×25×10×1000×B。同理，如果是16个中方格的计数板，设五个中方格的总菌数为A’，则 1ml菌液中的总菌数=A’/5×16×10×1000×B。

三、实验器材

1、菌种: 培养48h的酵母菌．

2、染色液和试剂：0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝．

3、 器材：显微镜、血球计数板、目镜测微尺、镜台测微尺、盖玻片、吸水纸、计数器、移液器、擦镜纸．

四、实验方法

1、目微尺的校正：

把Olympus目镜的下部罗圈旋下，将目镜测微尺的刻度朝下轻轻地装入目镜的隔板上，把镜台测微尺置于载物台上，刻度朝上。先用低倍镜观察，对准焦距，视野中看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使两尺重叠，再使两尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度，计数两重合刻度之间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。因为镜台测微尺的刻度每格长10μm，所以由下列公式可以算出目镜测微尺每格所代表的实际长度。

用同法分别校正在低倍镜下和高倍镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度（μm）=

2、酵母菌形态观察及死活细胞鉴别

1）制片：在一个载玻片上分别滴0.05%、0.1%吕氏碱性美蓝各1滴，无菌操作取酵母菌，在染液中分别混匀，盖上盖玻片，静置5分钟。

2）镜检：在显微镜高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽生殖方式。

3）计数死活细胞：死细胞为染为兰色的细胞，活细胞为无色细胞，分别计数，并隔5-15分钟检测一下死活细胞数，比较其死活细胞的比例变化。

3、细胞大小的测定：

移去镜台测微尺，换上酵母菌染色片，先在低倍镜下找到目的物，然后在高倍镜下用目镜测徽尺来测量酵母菌菌体的长，宽各占几格（不足一格的部分估计到小数点后一位数）。测出的格数乘上目镜测微尺每格的校正值，即等于该菌的长和宽。一般测量菌体的大小要在同一个标本片上测定10～20个菌体，才能代表该菌的大小。待测微生物需用培养至对数生长期的菌体进行测定。

4、显微镜直接计数酵母菌液浓度：

1）酵母菌液的制备：无菌操作用接种环从斜面中取一环酵母菌，置于无菌水中振荡制成菌悬液．

2）加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的吸头将酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。

3）显微镜计数：静置5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。

五、实验结果

1、绘图说明酵母菌形态及出芽方式

2、目镜测微尺校正结果（填表）

3、酵母菌大小测定结果（填表）

4、显微镜直接计数实验结果（填表并计算浓度）

六、思考题

1、为什么目测尺使用前必须校正？

由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。

2、不同美蓝浓度和作用时间对酵母菌死活细胞的比例有何影响？

美蓝浓度越高，作用时间越长，酵母菌死活细胞的比例越高。

3、根据你实验的体会，说明用血球计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？

1菌液浓度过高或过低，应调整菌液浓度，使每小格内约有5—10个菌体；

2测量时间不宜过长，防止菌体自然裂解；

3测量时镜头必须干净，计数板应干燥；

4接种过程在酒精灯旁无菌操作，同时向血球计数板加样时在边缘滴一滴让其自行进入，防止出现气泡；

5菌体培养时间不宜过长，防止过多芽体产生。

第二篇：微生物大小及数量的测定

微生物大小及数量的测定

摘要：本实验主要学习并掌握显微测微尺测定微生物大小的方法和如何使用血细胞计数板计量微生物细胞数量。

关键词：显微测微尺   显微计数法    血细胞计数板

前言

（一）微生物大小的测定

微生物细胞大小，是微生物的形态特征之一，也是分类鉴定的依据之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测量微生物细胞大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺。

镜台测微尺（图1）是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般将1mm等分为100格，每格长度等于0．01mm（即10⁶μm）。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是专用于校正目镜测微尺每格的相对长度。

目镜测微尺（图1）是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，有等分50小格或100小格两种，每5小格间有一长线相隔。由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同。因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小。在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。

图1  测微尺及其安装和校正

（二）微生物数量的测定

显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上(又称计菌器)，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。目前国内外常用的计菌器有：血细胞计数板、Peteroff-Hauser计菌器以及Hawksley计菌器等，它们都可用于酵母、细菌、霉菌孢子等悬液的计数，基本原理相同。后两种计菌器由于盖上盖玻片后，总容积为0.02mm³，而且盖玻片和载波片之间的距离只有0.02mm，因此可用油浸物镜对细菌等较小的细胞进行观察和计数。除了用这些计菌器外，还有在显微镜下直接观察涂片面积与视野面积之比的估算法，此法一般用于牛乳的细菌学检查。显微镜直接计数法的优点是直观、快速、操作简单。但此法的缺点是所测得的结果通常是死菌体和活菌体的总和。目前已有一些方法可以克服这一缺点，如结合活菌染色微室培养（短时间）以及加细胞分裂抑制剂等方法来达到只计数活菌体的目的。本实验以血球计数板为例进行显微镜直接计数。

用血细胞计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。该计数板是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各列有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图2。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格(图2)；另一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格，但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为lmm，则每一个大方格的面积为lmm²，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.lmm，所以计数室的容积为0.lmm³(万分之一毫升)。

计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上25或16，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。

以25个中方格的计数板为例，设5个中方格中的总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：1mL菌液中的总菌数=A/5×25×10⁴_­­­×B=50000A·B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，1mL菌液中的总菌数=A/5×16×10⁴×B=32000A·B（个）。

图2  血细胞计数板构造示意图

1材料

1.1菌种

酿酒酵母，枯草芽孢杆菌。

1.2溶液和试剂

碱性美蓝染液,香柏油，二甲苯。

1.3仪器和其他用品

目镜测微尺，镜台测微尺，普通光学显微镜，血细胞计数板，计数器，载玻片，盖玻片，擦镜纸，接种环，酒精灯，毛细滴管，试管等。

2实验步骤

2.1微生物大小的测定

2.1.1目镜测微尺的安装

取出接目镜，把目镜的上透镜旋开，将目镜测微尺轻轻放入目镜的隔板上．然后旋上目镜透镜，再将目镜插回镜筒内(见图1)。

2.1.2校正目镜测微尺

将镜台测微尺放在显微镜的载物台上，使有刻度的一面朝上，并将刻度对准视野中央。先用低倍镜观察，对准焦距，待看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度相平行。利用推进器移动镜台测微尺，使两尺在某一区域内两线完全重合，记录两次重叠刻度间目镜测微尺与镜台测微尺的格数（图1）。

用同样的方法换成高倍镜和油镜进行校正，分别测出在高倍镜和油镜下，两重合线之间两尺分别所占的格数。

按下列公式分别计算出不同放大倍数下，目镜测微尺每格所代表的长度。

目镜测微尺每格长度（μm）=

2.1.3菌体大小测定

将镜台测微尺取下，分别换上枯草芽孢杆菌染色装片及酵母菌涂片，先在低倍镜和高倍镜下找到目的物，然后在油镜下用目镜测微尺测量枯草芽孢杆菌和酵母菌的宽度和长度。测定时，通过转动目镜测微尺和移动载玻片，测出菌体宽和长所占目镜测微尺的格数。最后将测得的格数乘以目镜测微尺（用油镜时）每格所代表的长度，即为该菌的实际大小。

2.1.4测定完毕

测量完毕后取出目镜测微尺，将接目镜放回镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭干净，放回盒内保存。

2.2显微计数法

2.2.1菌悬液的稀释

将酿酒酵母菌悬液进行适当稀释。

2.2.2检查血细胞计数板

在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。

2.2.3加样品

将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，一般计数室均能充满菌液。加样后静置5分钟，时细胞或孢子自然沉降。

取样时先要摇匀菌液；加样时计数室不可有气泡产生。

2.2.4显微镜计数

将加有样品的血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。调节显微镜光线的强弱适当，对于用反光镜采光的显微镜还要注意光线不要偏向一边，否则视野中不易舌清楚计数室方格线，或只见竖线或只见横线。

在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5~10个菌体为宜。每个计数室选5个中格(可选4个角和中央的一个中格)中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。

2.2.5清洗

使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干，放回盒中。

3实验结果

3.1微生物大小的测定

3.1.1校正目镜测微尺

目镜测微尺校正结果

注：目镜放大倍数为10倍。

3.1.2各菌测定记录

注：目镜放大倍数为10倍，物镜放大倍数为100倍。

3.1.3各菌测定计算结果

3.2显微镜计数结果

3.3结果分析

在测量细菌大小的实验中，菌体的大小随菌龄和环境条件而异,或读数不准确均会造成误差。在显微镜计数的实验中，对菌液稀释时稀释倍数的不准确把握和实验的重复次数较少都会影响实验结果。

3.4思考题

3.4.1在不改变目镜和目镜测微尺，而改用不同放大倍数的物镜来测定同一细菌的大小时其结果不相同，因为物镜放大倍数不同，使得目镜测微尺每格代表的数值不同，精确度不一样，因此数值不同。

3.4.2血细胞计数板计数时的误差来源： 计数室内有气泡将影响菌悬液随机分布而使计数产生误差，并且改变了菌悬液的总浓度；重复计数；遇到有出芽的酵母菌计为两个。

4小结

使用镜台测微尺进行校正时，若一时无法直接找到测微尺，可先对刻度尺外的圆圈线进行准焦后再通过移动标本推进器进行寻找。细菌在不同的生长期细胞大小变化很大，测定时应选择处于对数生长期的菌体细胞材料。

血细胞计数板计量酵母菌数量时，应注意位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。

参考文献：

1.沈萍 陈向东.微生物实验[M].4版.高等教育出版社，2007.47-53页