实验三：福林(Folin)-酚试剂法测定蛋白质的浓度

一、 实验目的

1． 学会制备无蛋白血滤液。

2． 掌握Folin－Wu 法测定血糖含量的原理和方法。

3． 掌握7200 型可见分光光度计的使用方法。

二,实验原理

蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物 还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。蓝色的深浅不蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

三.实验仪器 1． 试管 2． 秱液管 3． 卵清蛋白片 4． 7220 分光光度计

四. 实验试剂 1、碱性硫酸铜溶液 A 液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g 及碳酸氢钠11g 溶于蒸馏水，秲释定容至 1000ml. B 液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A 液：

B 液=9：1 混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。 2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：称取1.000g 葡萄糖，溶于蒸馏水，秲释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液：取1.0ml 葡萄糖母液于100ml 容量瓶中，加蒸馏水定容。 3、10%钨酸钠溶液： 称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100 毫升。 4、

0.33mol/LH2SO4 溶液： 于53ml 蒸馏水中加入1ml 的浓硫酸。

五.实验步骤 1、无蛋白血滤液的制备： 用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml 锥形瓶中，加蒸馏水7ml， 摇匀，

溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。 再加

0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15 分钟，至沉淀变 为暗棕色（如丌变色可再加0.33mol/L H2SO41-2 滴）。 用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液丌清需重新过滤。每 毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml 全血。 2、血糖的定量测定： 取25ml 的血糖管3 支，编号。第一支血糖管中加入2ml 蒸馏水（空白管）；第二支血 糖管中加2ml 标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml 新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8 分钟，取 出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml 酸性钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水秲释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色， 以空白管调节零点。

六.数据处理 列1 空白管 标准管（A0） 样品管（A1） OD420 0 0.072 0.097 OD420 0 0.071 0.097 OD420 0 0.072 0.097 平均 0 0.072 0.097 按下式计算100ml 全血中所含血糖的含量

m=A1/A0×C0÷0.1×100 式中: m=100ml 全血中含血糖毫兊数 ; C0=标准液葡萄糖含量（0.1mg/ml） A1=样品 液光吸收值 ; A0=标准液光吸收值 0.1ml 无蛋白血溶液相对于0.1ml 全血 得出

m=134.72mg

七.实验分析

一．提高实验准确度的措施？ 1． 应尽可能把秱取的血液完全放出，即等待挂在壁上的血液滴下后再进行接下来的操作。 2． 若

过滤后滤液浑浊丌为无色透明，则应二次过滤。 3． 尽量保证三只试管水浴时间相同。

二、实验中，血糖管有什么作用？ 由于空气中的氧对Cu2O会产生再氧化作用从而影响测定结果，为减少Cu + 不空气的接触，通 过血糖管的细颈阻挡空气，防止形成Cu 2+ 。

三.实验过程中，为什么要用流水冷却加入碱性硫酸铜液反应后的血糖管？ 使其尽快降温，防止高温使钼蓝氧化。

第二篇：植物蛋白质的提取和测定实验

植物蛋白质含量的测定

一、原理

查询资料，得知玉米蛋白质含量较高。再经Tris-HCl缓冲液研磨、离心后，得可溶性蛋白质于上清液中，将沉淀用碱水解则得到非可溶性蛋白质的提取液，将提取液与卡马斯亮蓝溶液反应呈蓝色，在595nm处有最大吸收峰。在一定范围内，蛋白质含量与反应液在595nm波光的吸收度呈正比，由此可求出蛋白质的含量

二、材料、仪器设备及试剂

（一）材料：玉米粒

（二）仪器设备：

分光光度计； 离心机； 恒温水浴； 研钵； 离心管； 刻度移液管；微量滴定管； 试管等

（三）试剂：

100μg／ml牛血清标准蛋白质溶液；0.15mol/L NaCl; 1mol/LNaOH;50mmol/L Tris-HCl提取液、卡马斯亮蓝溶液

三、实验步骤

（一）标准曲线的绘制

编号 0 1 2 3 4 5 标准蛋白（ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Tris-HCl提取液(ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 卡马斯亮蓝溶液(ml) 5 5 5 5 5 5 每管牛血清蛋白含量(ml) 0 20 40 60 80 100

加入表中的试剂，摇匀，室温放置4分钟，以不加标准蛋白的0号管为空白，在595nm波长处测定吸光度。以标准蛋白浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

（二）样品的测定

称取鲜样0.5g，加提取液6ml，研磨成匀浆后，在10000r/min,4℃条件下离心20min，上清液即为可溶性蛋白质提取液。沉淀加3ml1mol/L NaOH溶液，在90℃恒温水浴锅中加热20min，在4000r/min，4℃条件下离心10min，上清液为非可溶性蛋白质提取液。取上清液各0.1ml，分别加入Tris-HCl提取液0.9ml，然后再分别加入卡马斯亮蓝溶液5ml，摇匀，于595nm波长处测定吸光值。根据吸光度查标准曲线，求出样品中的蛋白质含量。

四、结果计算：

样品中蛋白的含量（μg/g）＝查标准曲线值（μg）×提取液总体积（ml）/(样品鲜重（g）×测定时加样量（ml）)

粗蛋白量（％）＝蛋白氮含量×6.2