生物学大实验（二）

实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验

实验目的 通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。

实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。

实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状DNA在外界环境恢复正常的时候不能够复性 而质粒DNA可以复性，从而可以实现质粒DNA和染色体DNA的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的DNA系列之内或其附近的特异位点上，并切割DNA。当对提取的质粒DNA进行电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

实验步骤：

一 质粒扩增

（1）普通LB固体培养基制备：

    制备LB培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。

（2）将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分)

二 质粒DNA的提取(碱法)

1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中， 12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；
2、 将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、 加入100μl用冰预冷的溶液I，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、 加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。
5、 加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴5分钟。
6、 取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链DNA，然后4℃，12000rpm离心10min。
7、 弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加 入预冷的1ml 70％乙醇。
8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置DNA干燥5～10分钟。

9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10 、  将沉淀溶于34υlTE缓冲液或灭菌水（pH8.0）中，储于-20℃冰箱中
三DNA酶切反应

1、  将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入DNA（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。

2、  混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。

3、  每管加入2υl0.1mol/L EDTA（pH8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。

四 DNA的琼脂糖凝胶电泳

1、  取5×TBE缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。

2、  胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入300ml 0.5×TBE稀释缓冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。

3、  胶版的制备：想冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（EB）溶液使其终浓度为0.5υlg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5υ×TBE稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面

4、  加样：取20υl的酶解液与2υl10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿

5、  电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳

6、  观察和拍照

五 实验结果

 六 实验结论

通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。结果显示，第三条中酶切效果良好，RNA被降解的很完全，第四根没有被酶切，质粒DNA跟RNA同时存在，出现了两条亮带，质粒DNA跟RNA分离效果较好。

本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项：

（1）       取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固，拔梳子是一定要手稳，而且要垂直拔出；

（2）       点样要细心，枪头不要碰到凝胶，以免点样枪刺破凝胶；

（3）       电泳时，电极一定要连接正确

（4）       染色剂溴化乙锭是强诱变剂，有致癌性和强毒性，使用时一定要带一次性手套，使用后废液不可不可随意丢弃。

    生物科学 071班   姓名：刘欢  学号：20073305

第二篇：粗盐提纯实验报告

一、实验目的：

1.掌握溶解、过滤、蒸发等实验的操作技能．

        2.理解过滤法分离混合物的化学原理．

        3.体会过滤的原理在生活生产等社会实际中的应用．

二、实验原理：

粗盐中含有泥沙等不溶性杂质，以及可溶性杂质如：Ca2+,Mg2+,SO42- 等．不溶性杂质可以用过滤的方法除去，然后蒸发水分得到较纯净的精盐．

三、实验仪器和药品：

药品：粗盐，水

         器材：托盘天平，量筒，烧杯，玻璃棒，药匙，漏斗，铁架台（带铁圈），蒸发皿，酒精灯，坩埚钳，胶头滴管，

      滤纸，剪刀，火柴，纸片

四、实验操作：

五、实验总结

过滤操作中的问题:

(一)、怎样组装过滤器?

首先，将选好的滤纸对折两次，第二次对折要与第一次对折的折缝不完全重合．当这样的滤纸放入漏斗中，其尖角与漏斗壁间有一定的间隙，但其上部却能完好贴在漏斗壁上．对折时，不要把滤纸顶角的折缝压得过扁，以免削弱尖端的强度,便在湿润后，滤纸的上部能紧密地贴在漏斗壁上．

    其次，将叠好的滤纸放入合适的漏斗中，用洗瓶的水湿润滤纸，用手指把滤纸上部1/3处轻轻压紧在漏斗壁上．把水注入漏斗时，漏斗颈应充满水，或用手指堵住漏斗颈末端，使其充水至漏斗顶角稍上部为止．漏斗颈保持有连续的水柱，会产生向下的引力，加速了过滤过程

(二)、怎样正确地进行过滤？

    在过滤时，玻璃棒与盛有过滤液的烧杯嘴部相对着；玻璃棒末端和漏斗中滤纸的三层部分相接近，但不能触及滤纸；要保持垂直（笔者认为玻璃棒斜立易导致过滤液外溢）；漏斗的颈部尖端紧靠接收滤液烧杯嘴部的内壁．每次转移的液体不可超过滤纸高度的三分之二，防止滤液不通过滤纸而由壁间流出．对于残留在烧杯里的液体和固体物质应该用溶剂或蒸馏水按少量多次的原则进行润冲，将洗液全部转移到漏斗中进行过滤．

（三）、过滤时，滤液过多而超出滤纸边缘或滤纸被划破怎么办？

     可用少量原溶剂冲洗漏斗和滤纸2到3次，原滤液连同洗液重新进行过滤．

（四）、怎样检验沉淀物是否洗净？

     可根据沉淀物上可能检出的杂质类别，在最后一次洗出液中加入适宜的试剂，来检验洗涤程度．如过滤Na2SO4、BaCl2两溶液恰好完全反应后的混合物时，要检验沉淀物是否洗净，应选择AgNO3溶液．若在最后一次洗出液中加入AgNO3溶液无沉淀（AgCl2）生成，则说明沉淀已洗净．

（五）、注意：

1.一贴二低三靠

①“一贴”是指滤纸折叠角度要与漏斗内壁口径吻合，使湿润的滤纸紧贴漏斗内壁而无气泡，因为如果有气泡会影响过滤速度．

②“二低”是指滤纸的边缘要稍低于漏斗的边缘，二是在整个过滤过程中还要始终注意到滤液的液面要低于滤纸的边缘。这样可以防止杂质未经过滤而直接流到烧杯中，这样未经过滤的液体与滤液混在一起，而使滤液浑浊，没有达到过滤的目的

③“三靠”一是指待过滤的液体倒入漏斗中时，盛有待过滤液体的烧杯的烧杯嘴要靠在倾斜的玻璃棒上（玻璃棒引流），防止液体飞溅和带过滤液体冲破滤纸；二是指玻璃棒下端要轻靠在三层滤纸处以防碰破滤纸（三层滤纸一边比一层滤纸那边厚，三层滤纸那边不易被弄破）；三是指漏斗的颈部要紧靠接收滤液的接受器的内壁，以防液体溅出。

2.玻璃棒作用：

1.溶解时：搅拌，加速溶解　　

2.过滤时：引流

3.蒸发时：搅拌，使液体均匀受热，防止液体飞溅