实验一、质粒DNA的提取及检测

【实验目的】

1、掌握碱裂解法提取质粒的原理和步骤

2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术

3、学会PCR操作的基本技术

第一部分 质粒DNA的提取

一、实验原理：

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0～12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

二、仪器与试剂

1、仪器 恒温摇床、台式离心机

2、试剂 溶液I、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ、无水乙醇、TE缓冲液、胰RNA酶、酚、氯仿

三、实验步骤

1、 将2mL含相应抗生素（Amp:50μg/mL）的LB液体培养基加入到试管中，接入含pUC19

质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

2、 取1.5mL培养物倒入微量离心管中，4000r/min离心2min。

3、 吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4、 将细菌沉淀悬浮于100μL溶液I中，充分混匀，室温放置10 min。

5、 加200μL溶液Ⅱ（新鲜配制），盖紧管皿，混匀内容物，将离心管放冰上5min。

6、 加入150μL溶液Ⅲ（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀。冰上放置15min。

7、 12000r/min，离心15min，将上清转至另一离心管中。

8、 向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1）（去蛋白），反复混匀，12000r/min，离心5min，

将上清转移到另一离心管中。

9、 向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后，室温放置5～10min。12000r/min，离心5min。

倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10、用1mL70℅乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干

燥。

11、加20μLTE缓冲液，其中含有20μg/mL的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。

第二部分 琼脂糖凝胶电泳检测DNA

一、实验原理：

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如实验提取的pUC19质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA1条链断裂，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA2条链发生断裂。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

二、仪器与试剂

1、仪器 琼脂糖凝胶电泳系统、紫外线透射仪、电炉子

2、试剂 5×TBE、凝胶加样缓冲液（6×）、琼脂糖、溴化乙锭溶液（EB）

三、实验步骤

（一） 制备琼脂糖凝胶

称取0.1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入10mL 0.5×TBE 缓冲液，加热至完全溶化（加EB），摇匀，则为1℅琼脂糖凝胶液。

（二） 胶板的制备

1、 取有机玻璃内槽，洗净，晾干。

2、 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并放好样品梳子。

3、 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层

均匀的胶面（注意不要形成气泡）。

4、 待胶凝固后，取出梳子，放在电泳槽内。

5、 加入电泳缓冲液至电泳槽中。

（三） 加样

用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔（记录点样顺序及点样量）。

（四） 电泳

1、 接通电泳槽与电泳仪的电源（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动）。

2、 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳。

四、实验结果

在紫外灯（254nm）下观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处应显出桔红色荧光条带。

第三部分 PCR扩增制备目的基因

一、实验原理：

是将待扩增的DNA模板加热变性，与其两侧互补的寡聚核苷酸引物复性，然后经过耐热的DNA聚合酶延伸。经过变性—复性—延伸的n次循环后，DNA可被扩增2n倍。

二、仪器与试剂

1、仪器 PCR仪

2、试剂 模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物、10×Buffer、DNA Marker

三、实验步骤

（1）加样：在0.2ml PCR 微量离心管中配制25μl反应体系。

ddH2O 15.25μl

10×PCR buffer 2.5μl

dNTP（2.5mM） 3.0μl

10μmol/L Primer1（2μM） 1.0μl

10μmol/L primer2（2μM） 1.0μl

模板DNA（含质粒) 2.0μl

Taq酶（5U/μl ） 0.25μl

总体积 25μl

（2）将PCR反应体系混匀，按以下循环条件在基因扩增仪上进行PCR循环： 预变性 94℃ 5min

变性 94℃ 45s

退火 56℃ 45s

延伸 72℃ 45s

完全延伸 72℃ 3min

（3）PCR结束后，取10μl产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

四、实验结果：

第二篇：实验 质粒DNA的提取与检测

实验 质粒DNA的提取与检测

一、实验目的

1、学习质粒 DNA 的提取原理与琼脂糖凝胶电泳原理；

2、掌握质粒 DNA 的提取方法；

3、掌握电泳检测DNA的方法。

二、实验原理

质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb 不等,为双链、闭环的DNA 分子,以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。在细菌细胞内,共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA 外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA 两条链中有一条链发生一处或多处断裂,分子就能旋转而消除链的张力,形成松驰型的环状分子,称开环DNA(Open circular DNA, 简称ocDNA)；如果质粒DNA 的两条链在同一处断裂,则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA 电泳时,同一质粒DNA 其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。琼脂糖主要在DNA 制备电泳中作为一种固体支持基质,其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场中,在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定: DNA 的分子大小，琼脂糖浓度，DNA 分子的构象，电源电压，嵌入染料的存在及离子强度等。

该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA 片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB） 染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng 的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。

三、材料、设备及试剂

1.材料：含pET32a的E. coli DH5α菌株，1.5ml 塑料离心管(又称eppendorf 管),离心管架。

2.设备：台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，移液枪(20μl,200μl,1000μl)及枪头，琼脂糖平板电泳装置，微波炉或电炉,紫外透射仪。

3.试剂

（1）LB 液体培养基： 酵母膏 5g ，蛋白胨 10g ，NaCl 10g，加蒸馏水至 1000ml ，用

NaOH和HCl调节pH 7.0~7.2，分装灭菌。

（2）LB 固体培养基：加1.5%琼脂粉的LB液体培养基，灭菌倒平板。

（3）氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成50mg/ml 水溶液, -20℃保存备用。

（4）溶菌酶溶液：用10mmol/L TrisHCl(pH8.0)溶液配制成10mg/ml,并分装成小份(如1.5ml)保存于-20℃。

（5）3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml 水中溶解40.81g NaAc?3H2O,用冰醋酸调pH 至5.2, 加水定容至100ml, 分装后高压灭菌,储存于4℃冰箱。

（6）溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15 分钟,储存于4℃冰箱。

（7）溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH 母液稀释)，1％ SDS。

（8）溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。

（9）RNA 酶A 母液：将RNA 酶A 溶于10mmol/L TrisHCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl 中,配成10mg/ml的溶液,于100℃加热15 分钟,使混有的DNA 酶失活。冷却后用1.5ml eppendorf 管分装成小份保存于-20℃。

（10）酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1(V/V/V)。

（11）TE 缓冲液：10 mmo/L TrisHCl (pH8.0)，1 mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃ 冰箱中。

（12）电泳所用试剂：

①.TBE 缓冲液(5×)：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA(pH8.0) 20ml，定溶至1000ml。

②.上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚蓝，40% (w/v) 蔗糖水溶液。

③.溴化乙锭(:将EB 配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。 四、操作步骤

1. 细菌的培养和收集

将含有质粒pET32a 的DH5α菌种接种在LB 固体培养基(含50μg/ml Amp)中, 37℃培养12-24 小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ml LB 液体培养基(含50μg/ml Amp)中,37℃振荡培养约12 小时至对数生长后期。

2. 质粒DNA快速提取

（1）取1.5ml 培养液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 离心30 秒。

（2）弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。

（3）菌体沉淀重悬浮于100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10 分钟。

（4）加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 分钟。

（5）加入150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10分钟,4℃下12000g 离心5-10 分钟。

（6）上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心5分钟。

（7）将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20分钟，然后4℃下12000g 离心10 分钟。

（8）弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下12000g 离心5-10 分钟。

（9）吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10 分钟或室温干燥。

（10）将沉淀溶于20μl TE 缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。

3. 质粒DNA的检测

1、取5×TBE 缓冲液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。

2、胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。

3、胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm 左右的间隙。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧,待琼脂糖溶液凝后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内,使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低,否则凝固不均匀,速度也不可太快,否则容易出现气 泡。待胶完全凝固后拨出梳子,注意不要损伤梳底部的凝胶,然后向槽内加入0.5×TBE 稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。因边缘效应样品槽附近会有一些隆起,阻碍缓冲液进入样品槽中,所以要注意保证样品槽中应注满缓冲液。

4、加样：取10μl DNA与2μl 6×载样液混匀,用微量移液枪小心加入样品槽中。每加完一个样品要更换tip 头,以防止互相污染,注意上样时要小心操作,避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

5、电泳：加完样后,合上电泳槽盖,立即接通电源。控制电压保持在60-80V,电流在40mA 以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm 时,停止电泳。

6、染色：未加EB 的胶板在电泳完毕后移入0.5μg/ml 的EB 溶液中,室温下染色20-25 分钟。

7、观察：在波长为254nm 的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB 的电泳胶板。DNA 存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。紫光灯下观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃面罩,以免损伤眼睛。

五、实验结果及分析

六、思考题

琼脂糖凝胶电泳过程中影响DNA迁移率的因素有哪些？