实验一、动物的一般操作技术
1.实验目的和要求*
毒理学研究需要用实验动物来进行各种实验，通过对动物的实验观察和分析来研究毒作用，获得毒物的毒性、剂量—反应关系、毒作用机制等方面的资料，因此动物实验是毒理学研究中重要的手段之一。
通过本次学习毒理学实验中有关动物实验的基本操作技术，掌握实验动物的选择、动物抓取和分组等技术。
2.实验原理
做毒理学实验，首先要了解实验动物选择的要求，实验动物分组、实验样品的采集、实验动物处死方法等。
3．实验仪器设备：
小鼠若干，手套15副，苦味酸酒精饱和液，0.5％中性红或品红溶液，棉签，解剖剪刀10把，感应量为0.1g的天平一台。
4．实验内容步骤：
(一)健康动物的选择
无论选择哪种种属品系的动物进行实验，均要求选择健康的实验动物。健康动物检查时要求达到：外观体形丰满，被毛浓密有光泽、紧贴体表，眼睛明亮，行动迅速，反应灵活，食欲及营养状况良好。选择时重点检查以下几项：
l．眼睛 明亮，瞳孔双侧等圆，无分泌物。
2．耳 耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮。
3．鼻 无喷嚏，无浆性粘液分泌物。
4．皮肤 无创伤、无脓疮、疥癣、湿疹。
5．颈部 要求颈项端正，如有歪斜提示可能存在内耳疾患，不应选作实验动物。
6．消化道 无呕吐、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。
7．神经系统 无震颤、麻痹。若动物(大鼠、小鼠)出现圆圈动作或提尾倒置呈圆圈摆动，应放弃该动物。
8．四肢及尾 四肢、趾及尾无红肿及溃疡。
(二)实验动物的性别鉴定
小鼠 主要依据肛门与生殖孔间的距离区分，间距大者为雄鼠，小者为雌性。成年雄鼠卧位可见睾丸，雌性在腹部可见乳头。
(三)抓取方法
正确地抓取固定动物，是为了在不损害动物健康、不影响观察指标、并防止被动物咬伤的前提下，确保实验顺利进行，
小鼠的抓取方法 先用右手抓取鼠尾提起，置于鼠笼或实验台上向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓住小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，以无名指按住鼠尾，小指按住后腿即可。
（四）编号、标记方法
1、称重鼠称的感应量在0.1g以下。o
2、标记方法
染色法：采用染料(苦味酸酒精饱和液)涂擦动物皮毛标记的方法进行编号。用毛笔或棉签蘸取染料涂于动物的不同部位，以苦味酸黄色斑点染料标记来表示不同号码。一般习惯涂在左前腿为1，左腰部为2，左后腿为3，头部为4，背部为5，尾基部为6，右前腿为7，右腰部为8，右后腿为9。如果动物编号超过10，需要10~100号码时，可采用在上述动物的不同部位，再涂染另一种涂料斑点，即表示相应的十位数，即左前腿为10，左腰部为20，以此类推。
（五）实验动物的随机分组方法（随机数字表法）
为了得到客观的剂量－反应关系，应将一群动物按统计学原则随机分配到各个试验组中。
将实验单位随机分成三组
设有动物X只，随机等分成Y组。将动物编号后，按上述方法，从随机数字表抄录X个数字，将各数一律以Y除之，并以余数1、2、3……Y代表各组。
动物号码 １ ２ ３ ４ ５
随机数目
除Y后的余数
要使各组的动物数相等，须把原归某组的动物改配到其它组去。可以随机数字表继续按斜角线抄录一个数字，得60，以有多出的一组现有只数除之，余数为几，就可以把第几个移入其它组。
5．注意事项：
在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失。同时要遵守实验操作规程。
6．实验结果：
掌握实验动物的一般操作、实验样品采集、实验动物处死方法等。
7．实验报告要求：
实验报告应包含如下内容：
原理、仪器和试剂、步骤、原始数据、计算结果。
实验二 动物染毒途径和方法
1．实验目的要求
掌握常用的动物染毒途径和方法。
2．实验原理：
实验动物的一般染毒途径主要是皮下注射、皮内注射、肌内注射、静脉注射、腹腔注射、经口染毒,皮肤染毒和呼吸道染毒。
3．实验仪器设备：
实验动物：成年、健康小鼠。
器材：注射器(0.5，1ml)、消毒棉球、手套、50ml烧杯。
试剂：0.9％生理盐水(100ml，灭菌)。
4．实验内容步骤：
染毒的途径和方法多种多样，可根据实验目的、动物种类和药物剂型等情况确定。
1．皮下注射 注射时以左手拇指和食指提起皮肤，将连有针头的注射器刺入皮下。注射部位一般在大腿外侧、内侧、背部、耳根部、腹部。
2．皮内注射 皮内注射时需要将注射的局部脱去被毛，消毒后，用左手拇指和食指按住皮肤使之绷紧，在两指之间，将连有针头的注射器紧贴皮肤表层刺入皮内，然后再向上挑起并再稍刺入，即可注射药物，此时可见皮肤表面鼓起一白色小皮丘。
3．肌内注射 肌内注射应选用肌肉发达、没有大血管通过的部位，一般多选臀部。注射时垂直刺入肌肉，回抽针栓无回血，即可进行注射。
4．静脉注射 一般采用尾静脉注射，鼠尾静脉有三根，左右两侧尾静脉比较容易固定，多采用。操作时先将动物固定操作时先将动物固定在鼠筒内或扣在烧杯中，使尾巴露出，尾部用温水浸润或用酒精擦拭，以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧，中指从下面托起尾巴，以无名指和小指夹住尾巴的末梢，右手持注射器，使针头与静脉平行，从尾下四分之一处进针，先缓慢注入少量药液，如无阻力，可继续注入。注射完毕后把尾部向注射侧弯曲以止血或用消毒棉球压迫针眼止血。
5．腹腔注射 用小白鼠做实验时，以左手抓住动物，使腹部向上，右手将注射针头于左或右下腹刺入皮下，使针头向前推进0.5～1.0cm，再以45度角穿过腹肌，固定针头，缓慢注入药液。
6．经口染毒 （见实验五）
7. 皮肤染毒 （见实验四）。
8. 呼吸道染毒 （见实验六）。
5．注意事项：
在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失。同时要遵守实验操作规程。
6．实验结果：
掌握实验动物染毒的常用的方法及其操作。
7．实验报告要求：
实验报告应包含如下内容：
原理、仪器和试剂、实验操作步骤。
实验三 动物生物材料采集、准备
1．实验目的要求
掌握动物生物样品采集方法及实验动物的处死方法。
2．实验原理：
动物生物样品的采集对实验结果十分重要，各脏器的比重和血液指标反映了动物染毒后的生理变化。
3．实验仪器设备：
实验动物：成年、健康小鼠。试 剂：酒精棉球。
器 材：酒精棉球、解剖剪刀、血色素吸管、干棉球、注射器、镊子。
4．实验内容步骤：
（一）采血方法
1．鼠尾采血方法：适用于血量少的实验。方法：将动物固定后，把鼠尾浸入 45～50℃温水中使尾静脉充血，擦干皮肤后，再用酒精棉球擦拭消毒。剪去尾尖(约 0.2～0.3cm)，拭去第一滴血，用血色素吸管(根据需要事先在吸管内加入与不加抗凝剂)吸取一定量尾血，然后用干棉球压迫止血。也可以不剪尾，以1ml注射器连上7—8号针头直接刺破尾静脉进行定量采血。
2．眼眶静脉丛采血法：操作者以左手拇指、食指紧紧握住小鼠颈部压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血(注意用力要恰当， 以防止动物窒息死亡)，右手持玻璃毛细管从一侧眼内眦部以45度角刺人，捻转前进。如无阻力继续刺人，有阻力就抽出玻璃毛细管调整方向后再刺入，直至出血为止。右手持容器收集血液后，拔出毛细管，用干棉球压迫止血。
3．腹主动脉或股动(静)脉采血法：为一次性采血方法。大、小鼠麻醉后，仰卧位固定动物，剪开腹腔，剥离暴露腹主动脉或暴露股动(静)脉，用注射器刺人采血。
4．断头采血法：操作者左手握住动物，右手持剪刀，快速剪断头颈部，倒立动物将血液滴人容器。注意防止剪断的毛发掉入接血容器中。
（二）处死方法
1．脊椎脱臼法 左手按住鼠头，右手抓住鼠尾猛力向后拉，使动物颈椎拉断脱节而立即死亡。此法多用于处死小鼠。
2．断头法 操作者用右手按住大鼠或小鼠头部，左手握住背部，露出颈部，助手用大剪刀或断头器剪断颈部使之死亡。也可使用断头器。
3．急性大失血法 可用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血法使大、小鼠立即死亡(详见动物的采血方法)。
4．击打法 右手抓住鼠尾，提起，用力摔打其头部，鼠痉挛后立即死亡。也可用小木锤或器具猛力击打动物头部，使其立即死亡，常用于处死家兔或
大鼠
（三）实验动物脏器的观察和采取。
5．注意事项：
在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失；实验使用的有毒化学药品妥善处理；要遵守实验操作规程。
6．实验结果：
掌握各种采血方法、实验动物各器官的正确位置和实验动物常用的处死方法。
7．实验报告要求：
实验报告应包含如下内容：
原理、仪器和试剂、步骤 ,各种采血和处死方法的适用范围。
实验四 皮肤刺激实验
1．实验目的要求
本试验的目的是：学习皮肤染毒技术，了解受试物对皮肤是否有刺激或腐蚀作用。
2．实验原理：
有些化学毒物与皮肤接触后可经皮肤吸收引起机体中毒，或引起皮肤、粘膜局部损伤。因此，经皮肤接触毒性试验在卫生毒理学中占有重要位置。
3．实验仪器设备：
实验动物：成年、健康的小鼠。皮肤刺激试验需动物3只。
器 材：解剖剪刀，细玻璃棒，棉球、医用纱布、塑料薄膜、无刺激性胶布。 试 剂：辣椒油；脱毛剂：取3份硫化钠,1份洗衣粉和7份淀粉，使用前临时用温水调成糊状。
4．实验内容步骤：
1．小鼠脱毛技术。
方法有三种：剪毛、拔毛和脱毛。
剪毛 固定动物后，用粗剪刀剪去所需部位的被毛。应注意几点：把剪刀贴紧皮肤剪，不可用受提起被毛，以免剪破皮肤；依次剪毛，不要乱剪；剪下来的被毛集中在一个容器内，勿遗留在手术野和操作台周围。
拔毛 小鼠作尾静脉注射时，需用拇指、食指将局部被毛拔去，以利操作。 脱毛 脱毛系指用化学药品脱去动物的被毛，适用于无菌手术野的准备以及观察动物局部皮肤血液循环和病理变化。常用硫酸钡或脱毛剂配方配制脱毛剂。
2．小鼠染毒操作。
浸尾法：染毒前先将小鼠放入特制地固定盒内，并使其尾巴通过固定盒底部地软木塞的圆孔露出管外。继之将尾巴通过小试管软木塞小孔，插入装有受试物液体的试管内，浸泡2～6小时，观察中毒症状。
涂布法: 用棉签将受试物液体均匀涂布于脱毛的皮肤上，在其上覆盖纱布，并用胶布固定。于染毒后30min,60min,2h,4h分别观察染毒部位的皮肤，有无红斑和水肿，有无水泡，糜烂 渗出等症状。记录症状并判断待测物对皮肤的刺激性。
3．皮肤局部刺激作用的观察方法和评价。
4．实验操作要点
脱毛操作过程中，注意不要伤到小鼠皮肤；小鼠在染毒过程中，注意其随时间的变化。
5．注意事项：
在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失；实验使用的有毒化学药品妥善处理；要遵守实验操作规程。
6．实验结果：
观察辣椒油对小鼠皮肤的刺激作用，并做出皮肤刺激性分级的判断。
7．实验报告要求：
实验报告应包含如下内容：
原理、仪器和试剂、步骤、结果。
实验五 经口急性毒性试验
1．实验目的要求
了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死量。
2．实验原理：
化学物经口染毒的方法是毒理学中重要的基本技术之一，经口急性毒性试验是研究化学物毒性效应的基本试验。通过该实验学习化学物毒性试验的实验设计原则和掌握经口灌胃技术。
3．实验仪器设备：
实验动物：成年、健康的雌、雄小鼠若干。
器 材：器材：注射器(0.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，10ml)、容量瓶(10，25，50ml)、烧杯(10，25，50ml)、滴管、灌胃针、电子天平、动物体重秤、解剖剪刀、镊子。
试 剂：受试化合物（氯化钡溶液，20mg/mL）。
4．实验内容步骤：
1．健康动物的选择和性别鉴定。
2．实验动物称重、编号和随机分组。
3．受试化学物溶液的配制。
4．小鼠灌胃操作技术。
取9只小鼠，称重并随机分成三组，对三组动物分别用灌胃法给以0.2mg/g, 0.1mg/g, 0.05mg/g的氯化钡溶液。
小鼠灌胃法 将钝头的16号注射针(适用于小鼠)(注意事先可用焊锡在针尖周围焊一圆头，使其不易损伤动物的消化道)安装在适当容积的注射器上，吸取所需的受试物溶液，左手抓住动物双耳后至背部的皮肤(小鼠仅抓住耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧)，将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者。注意使动物的上消化道固定成一直线。右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免操作穿破食管，甚至误人气管，导致动物立即死亡。
进针深度一般是小鼠2.5～4cm。为了验明是否已正确地地插入胃部，可轻轻
回抽注射器，如无气泡抽出，表明已插入胃中；如有大量气泡，则提示误插气管，应抽出重插。随后将受试物溶液注入。灌胃容量小鼠通常为0.2—lml。
5．毒性症状的观察。
染毒后注意观察中毒的发生、发展过程的规律以及中毒特点和毒作用的靶器官，观察要点见表1，做好实验记录。急性毒性试验可不做病理组织学检查，但对死亡动物应做大体病理学观察，存活动物实验结束时可做大体解剖学观察，肉眼观察到病变时应取材做病理组织学检查，以便为下阶段毒性试验剂量选择提供参考依据。
表1 急性毒性试验原始记录
受试物名称：
动物种属品系：
实验记录者： 记录日期： 年 月 日
5．注意事项：
在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失；实验使用的有毒化学药品妥善处理；要遵守实验操作规程。
为了使受试物能完全吸收，灌胃染毒时要求动物保持空腹状态，这是因为化学毒物进入胃内易与食糜作用而降低毒性，而且胃内容物也不利于受试物溶液的灌人，因此染毒前应禁食6～10小时，但要注意时间不能过长。否则 动物长时间饥饿会影响肝脏，影响实验结果。灌胃后至少2～3小时后才能喂食，油剂比水溶液要求限制喂食的时间更长些。
相同剂量的受试物，若以不同浓度给药，死亡情况会有所不同。体积太小、太浓可能发生局部刺激或其他损伤；体积太大可能会引起胃部机械性损伤，影响正常生理功能。常用的方法是将受试物体积固定，根据实验设计的剂量将受试物配制成不同浓度的溶液进行灌胃。通常灌胃体积以体重的1％～2％计算，最多不超过3％，即每100g体重灌胃1～2ml，最多不超过3ml。根据实际经验得出的各种实验动物灌胃量的极限是：小鼠0.5～1ml，大鼠4～5ml。 提供单位： 动物来源： 染毒剂量： 合格证号： Mg/kg 染毒途径： 室温： 相对湿度：
6．实验结果：
实验结果按照表1的内容进行填写。
7．实验报告要求：
实验报告应包含如下内容：
原理、仪器和试剂、步骤、原始数据、计算结果。
实验六 经呼吸道急性毒性试验
1．实验目的要求
经呼吸道急性毒性试验是研究气态、蒸气态、气溶胶、烟尘、粉尘状的外源性化合物在吸入过程中对呼吸道有无损伤，能否经呼吸道吸收以及吸收后对机体有无损害。经呼吸道急性毒性试验是卫生毒理学的重要基本实验技术之一。
本实验的目的是学习静式呼吸道染毒技术。
2．实验原理：
外源性化合物经呼吸道吸入是工业毒理学和环境毒理学中最常见的基础途径之一，在卫生毒理学研究中具有重要意义。
3．实验仪器设备：
实验动物：成年、健康的雌、雄小鼠若干。
器 材：静式吸入染毒柜（干燥器改装）吸管（0.2、0.5、1.0、5.0ml）、0.1g一下的天平。
试 剂：受试化合物（乙醚）。
4．实验内容步骤：
1．复习实验动物选择、性别鉴定、称重、编号和随机分组。
2．小鼠静式呼吸道吸入染毒操作。
向干燥器的陶瓷底板下分别放入沾有3mL，1.5mL,0.5mL乙醚的脱脂棉，将1只小鼠置于干燥器中，加盖密封，每二十分钟可开小缝通气一次。持续观察4h，观察小鼠活动状态，表现症状，如有死亡，则记录死亡时间。在观察结束后计算LD50。
吸入接触可分为两种方式，一是动式吸入，一是静式吸入。其类型又可分为两种，一是将实验动物整体置于染毒柜中；一是只将实验动物的口鼻部位与染毒柜中含受试化合物的空气接触，身体其它部位置于染毒柜外，一般成为面罩吸入染毒，可以避免化合物经皮交叉吸收。
静式吸入：系将实验动物置于一个一定体积的密闭容器内，加入定量的易挥发液态受试化合物或一定体积的气态受试化合物，在容器内形成所需的受试化合物浓度的空气环境。接触一定时间（一般为2h或4h）后，观察动物的中毒反应，并根据动物的死亡情况和相应的受试无浓度，求出LC50。这种接触方式，实验动物在整个接触期间得不到氧气得补充。随着接触时间延长，染毒柜内氧分压下降，二氧化碳分压上升，湿度、温度也会上升。为此，染毒柜的体积与所放置的动物数量应相应，否则会出现缺氧与二氧化碳潴留现象。要求在接触期内染毒柜的氧分压不能低于19%二氧化碳分压不能超过1.7%。染毒柜体积、放置动物种类和数量及放置时间相互关系见表1。
表1 实验动物最低需气量及不同体积染毒柜应放置动物数关系
呼吸通气量最低需气量 不同容积染毒柜放置动物数（只）
（L/h） （L/h） 25L 50L 100L 300L
小鼠 1.45 4.35 3～5 6～10 12～15 36~40 大鼠 10.18 30.5 1 1～2 5~6 豚鼠 10.18 30.5 1 1～2 5~6 猫 19.3 57.9 3~4 家兔 42.25 126.8 1
注：按接触2小时计算
（引自：湖南医学院卫生学教研组.卫生毒理学实验方法.北京：人民卫生出版社.1971,46）
3．小鼠静式呼吸道吸入染毒观察，观察见表2。 动物种属 表2 急性毒性试验原始记录
受试物名称：
动物种属品系：
实验记录者： 记录日期： 年 月 日
3．实验操作要点
（1）选择健康实验动物，称重、编号，随机分组。
（2）剂量分组 设3个出现毒性效应直至死亡的剂量组。
（3）呼吸道吸入染毒
取小鼠，放入静式染毒柜内，加盖。依设计剂量浓度及各染毒柜体积，计算需要加入的受试化合物的量。计时。记录染毒柜内的温度。观察、记录中毒症状。
5．注意事项：
注意染毒柜密闭，防止污染周围环境；在染毒结束时，应在通风柜内或通分处开启染毒柜，迅速小心取出动物，分笼饲养，继续观察；在教师指导下按规定方法销毁剩余受试化合物；在实验操作过程中，注意安全，以免被小鼠咬伤，防止小鼠丢失；实验使用的有毒化学药品妥善处理；要遵守实验操作规程。
6．实验结果：
观察小鼠染毒后的情况，做好记录。 提供单位： 动物来源： 染毒剂量： 合格证号： Mg/kg 染毒途径： 室温： 相对湿度：
7．实验报告要求：
实验报告应包含如下内容：
原理、仪器和试剂、步骤、原始数据、计算结果。