细胞生物学实验手册
第四版前言
这本实验教材是为高等医学院校细胞生物学教学编写的，适用于五年制本科、七年制
临床专业和研究生班。
细胞生物学实验课的教学目的，主要是通过基本技能训练以及观察分析实验结果，使
学生了解并掌握有关的实验技术原理和操作方法，进而培养学生动手实践、观察分析和解
决问题的能力。为达到此目的，实验内容自成体系，着眼于加强学生的基末技能训练，以及
观察分析问题和科学思维能力的培养。大多数实验采用生活细胞材料，由学生自己动手取
材和实验，使学生能对细胞获得生动的认识。选编了一些生物医学常用的细胞生物学基本
实验，如细胞的显微测量、细胞活力测定、细胞计数、细胞组分的分级分离、细胞组分的化
学反应、细胞生理活动、细胞染色体技术、细胞培养、细胞融合、免疫荧光技术、电镜技术
等，为后续的课程及医学研究打下一定基础。
全书内容共23个实验，五年制本科、七年制医学专业和研究生班教学根据具体情况
选择基本实验，由学生自己动手操作，少数应用大型精密仪器的实验进行参观示教，另附
实验报告一册。
本教材由王芸庆主编、谢荣林副主编，参加编写的有陈兴、谢荣林、宁刚、刘冬杰、黄东阳、纪晓辉、时伟红、朱亚勤、黄集前、王明武、毕卫真、张婕、三维琴和王世藩。荆永显、李虹、王序绘制插图，毕卫真负责印刷出版事宜。
教材初稿曾于1989年《全国医学细胞生物学实验课培训班》试用，参加该班的教师提
出许多宝贵的经验及修改意见，谨此致谢。现在第四版在1993年第三版基础上对部分实
验进行了补充和修改，并增加了“酸性磷酸酶的显示”实验。由于经验不足，水平有限，本教材一定还有很多缺点和错误，敬请使用者批评指正。
目 录
前 言
实验室规则……………………………………………………………… (1)
常用实验动物了解和解剖器械的使用………………………………… (2)
细胞生物学实验绘图方法与要求………………………………………（4）
实验 一 动物细胞的基本形态观察和显微测量…………………………………（5）
实验 二 线粒体的活体染色及电镜照片观察……………………………………（8）
实验 三 液泡系的活体染色及电镜照片观察……………………………………（10）
实验 四 细胞中微丝的染色及微丝与细胞形态的实验观察…………………… (11)
实验 五 细胞器的光镜切片和电镜照片观察……………………………………（13）
实验 六 细胞生理活动的观察……………………………………………………（16）
实验 七 细胞组分的化学反应……………………………………………………（20）
实验 八 细胞核与线粒体的分级分离……………………………………………（23）
实验 九 细胞分裂的形态观察……………………………………………………（26）
实验 十 正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备…………………………… (31)
实验十一 细胞融合…………………………………………………………………（36）
实验十二 应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本…………………………（38）
实验十三 培养细胞的形态观察和计数……………………………………………（40）
实验十四 细胞的原代和传代培养…………………………………………………（43）
实验十五 酸性磷酸酶的显示………………………………………………………（46）
实验十六 肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定……………………………………（48）
实验十七 电镜生物标本的制备及镜下观察………………………………………（50）
实验十八 整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备与观察…………（54）
实验十九 免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原………………………………………（56）
实验二十 姊妹染色单体互换标本制备与分析………………………………………（58）
实验二十一 银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察………………………… (60)
实验二十二 染色体扫描电镜标本制备及观察…………………………………………（63）
实验二十三 细胞显微摄影………………………………………………………………（65）
附录一 离心机转数与离心力的换算表…………………………………（67）
附录二 溶液的配制………………………………………………………（68）
主要参考资料………………………………………………………………（77）
实验室规则
一、遵守实验纪律，按时到达实验室，不得迟到或早退。实验中途因故需外出时应向任
课教师请假。
二、进入实验室之前要换好白大衣及拖鞋。
三、保持实验室安静，不许在实验室内大声喧哗及随意走动。
四、必须严肃认真地进行实验。实验期间不得进行任何与实验无关的活动。
五、实验室内各组仪器及器材由各组自已使用，不得互相调换。要爱护仪器、标本和设
备。如遇仪器损坏或不灵，应及时报告任课教师，以便修理或更换，不要自行乱修。
损坏器材或设备者应按有关规定进行赔偿。
六、注意节约实验材料、药品和水、电等。
七、保持实验室内清洁整齐。实验结束后，各组必须认真清理各自的实验台面，将器材
清洗后点清数目，然后摆放整齐。班级值日生负责清扫室内卫生，关好水、电开关
和门、窗等，经教师允许后方可离开实验室。
八、动物尸体、纸片及实验废物应放到指定地点，不得随意乱丢。
九、有不遵守上述要求者，任课老师将终止其实验，并取消其当堂实验成绩。
常用实验动物的了解和解剖器械的使用
一、常用实验动物
常用的实验动物有蟾蜍、小白鼠、大白鼠、豚鼠、猫、兔和狗等。在医学实验中，常常根据不同的实验目的而选用不同的动物进行实验研究。例如，蟾蜍可以用于观察离体心脏搏动情况的实验，小白鼠常用于样本很大的实验(如药物的半数致死量的测定等)，猫常用于测定脑内电位的实验，而狗是局解手术中常用的实验动物。
在我们细胞生物学实验中，除应用培养细胞外，最常用的动物是蟾蜍和小白鼠，下面对其特点及基本处置做一简单的介绍。
蟾蜍
蟾蜍是两栖类动物，由于其取材方便，常用于各种实验。其细胞较哺乳类动物的细胞大得多，因此常用于观察细胞形态的实验。
1．雌雄鉴别
通常雄性蟾蜍较雌性的为小，且在其前肢的l～3趾基部有被称为婚垫的黑疣。
2．捉拿及处死方法：
常用捣髓法处死蟾蜍，即用解剖针捣毁其脑组织和脊髓。具体方法是，左手握住蟾蜍的身体和四肢，使其腹部贴着掌心，食指压住蟾蜍头部前端使其尽量腹屈。在头与躯干之间可触及一凹陷(即枕骨大孔所在处)，右手持解剖针直插入此凹陷约l～2mm，随即将针尖转向头侧插入颅腔捣毁脑组织。然后将解剖针抽回并转向尾侧刺入脊椎管内捣毁其脊髓。如此直至其四肢松软，呼吸消失为止。
小白鼠
小白鼠是哺乳动物，是最为常用的实验动物。
1．捉拿方法：
将小白鼠放在鼠笼盖铁网上，用右手持其尾巴向后拉，小鼠则会尽力向前蹬。用左手的拇指和食指抓住其头顶部皮肤，然后用左手小指与手掌之间夹住其尾巴。
2．处死方法：
处死应以安乐死为原则，即使之无痛苦而迅速死亡。常用的方法有颈椎脱位法，断头法和二氧化碳吸入法等。断头法需用特殊的断头器，二氧化碳吸入法则将小鼠放入盛有二氧化碳的容器内即可。颈椎脱位法的具体方法是：左手拇指和食指按住小白鼠的头部，左手捉住其尾巴迅速向后猛拉，使其颈椎脱位而立即死亡。
3．给药方法：
小自鼠的给药途径有经口给药、腹腔内注射、尾静脉注射、皮下注射、皮内注射和肌肉注射等。我们常用的是腹腔注射。具体方法是：左手捉住小鼠(如前所述)，在其腹正中线稍外侧(避开膀胱和血管)用酒精消毒后，首先将注射针头向头部方向刺入皮下，进针1～2mm后，再以45°角刺穿腹部肌肉而进入腹腔(刺穿腹肌时有一落空感)。针头刺入腹腔后切勿左右摆动，以免损伤肠管或肝脏。注意每次注入的液体量应为0.1～0.2ml／10克体重。
二、常用手术器械及操作方法：
1．解剖针：用于挑、刺等。常用来捣髓处死蟾蜍，持法如执笔法。
2．解剖刀(即外科手术刀)：用于各种皮肤切口和组织切除等。持法有执弓法与执笔法两种。前者用于较大力量切开较长距离的坚韧的组织，如大动物的皮肤切口等；后者则用于小力量的短距离切开，或分离皮肤和肌肉等。
3．大剪刀：用于剪毛、皮肤、皮下组织和肌肉等。持法如图。
4．眼科剪刀：用于剪断神经、血管、筋膜等细软组织。
5．眼科镊子：用于提取神经、血管和筋膜等细软组织。
6．钝头镊子：用于提取脏器、组织等。
7．有钩镊子：用于提取皮肤切口等。
常用手术器械
执手术刀的姿势
执手术剪的姿势
执手术镊的姿势
执手术刀、手术剪、手术镊的姿势
(张之曾编)
细胞生物学实验绘图方法与要求
一、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行描绘，要求真实、准确(注意各部结构的比例关系)。
二、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，不得涂暗影或进行其它美术加工。
三、各部结构名称要在一侧引直线注明。各引线要平行不得交叉。
四、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当并注意纸面的整洁。
实验一 动物细胞的基本形态观察和显微测量
实 验 目 的
制备不同细胞的临时制片，观察、了解细胞的基本形态，学会使用测微尺，通过测量对红细胞的进化进行分析。
实验用品
一、材料和标本 蟾蜍一只，人血液一滴。
二、器材和仪器 配有目镜测微尺的显微镜一台、载片十张、盖片三张、吸水纸、手术器材一套、解剖盘一个、镜台测微尺一个、小平皿一个、牙签。
三、试剂 1％甲苯胺兰、1％甲基兰、Ringer氏液(两栖类用)。
实验内容
一、细胞的基本形态观察
(一)原理
细胞的形态结构与功能相关是很多细胞的共同特点，在分化程度较高的细胞更为明显，这种合理性是生物漫长进化过程所形成的。例如：具有收缩机能的肌细胞伸展为细长形；具有感受刺激和传导冲动机能的神经细胞有长短不一的树枝状突起；游离的血细胞为圆形、椭圆形或圆饼形。
不论细胞的形状如何，细胞的结构一般分为三大部分：细胞膜、细胞质和细胞核。但也有例外。例如：哺乳类红细胞成熟时细胞核消失。
(二)观察方法与结果
1．制备蟾蜍脊髓压片观察脊髓前角运动神经细胞。
取蟾蜍一只，破坏脑和脊髓，在口裂处剪去头部，除去延脑，剪开椎管，可见乳白色脊髓，取下脊髓放在平皿内，用Ringer氏液洗去血液后放在载片上，剪碎。将另一载片压在脊髓碎块上，用力挤压。将上面的载片取下即可得到压片。在压片上滴一滴甲苯胺兰染液，染色10分钟，盖上盖片，吸去多余染液。在显微镜下观察，染色较深的小细胞是神经胶质细胞。染成兰紫色的、大的、有多个突起的细胞是脊髓前角运动神经细胞，胞体呈三角形或星形，中央有一个圆形细胞核，内有一个核仁(参照照片)。
2．蟾蜍骨骼肌细胞的剥离与观察
剪开蟾蜍腿部皮肤，剪下一小块肌肉，放在载片上，用镊子和解剖针剥离肌肉块成为肌束，继续剥离，可得到很细的肌纤维(肌细胞)。尽可能拉直肌纤维。在显微镜下观察，肌细胞为细长形，可见折光不同的横纹，每个肌细胞有多个核，分布于细胞的周边(参照照片)。
3．蟾蜍肝脏压片的制备与观察
剪开蟾蜍腹腔，取一小块(约2～3mm 3)肝放在平皿内，用Ringer氏液洗净，用镊子轻压将肝中的血挤出。然后放在载片上，制片方法同脊髓压片。染色用甲基兰。显微镜下观察可见肝细胞核染成兰色，肝细胞紧密排列，挤成多角形(参照照片)。
4．蟾蜍血涂片的制备与观察
取一滴蟾蜍血液，靠近一端滴在载片上．将另一载片的一端呈45°角紧贴在血滴的前缘，均匀用力向前推，使血液在载片上形成均匀的薄层。(图l一1)。晾干。显微镜观察可见蟾蜍红细胞为椭球形，有核。白细胞数目少，为圆形。
图1—1血涂片的制备
5．人血涂片的制备与观察
取人血一滴，制片方法同上。显微镜观察可见人红细胞为凹圆盘形，无核。自细胞数目少，为圆形。
6．人口腔上皮细胞标本的制备与观察
用牙签刮取口腔上皮细胞均匀地涂在载片上(不可反复涂沫)，滴一滴甲苯胺兰染液，染色5分钟，盖上盖片，吸去多余染液。显微镜下观察可见复盖口腔表面的上皮细胞为扁平椭圆形，中央有椭圆形核，染成兰色。
二、测微尺的使用
(一)原理
测微尺分目镜测微尺和镜台测微尺，两尺配合使用。目镜测微尺是一个放在目镜像平面上的玻璃圆片。圆片中央刻有一条直线，此线被分为若干格，每格代表的长度随不同物镜的放大倍数而异。因此，用前必须测定。镜台测微尺是在一个载片中央封固的尺，长1毫米(1000μm)，被分为100格，每格长度是10微米。
(二)方法
1．将镜台测微尺放在显微镜的载物台上夹好，小心转动目镜测微尺和移动镜台测微尺使两尺平行，记录镜台测微尺若干格所对应的目镜测微尺的格数(图1—2)。
2．按下式求出目镜测微尺每格代表的长度
目镜测微尺每格代表的长度(μm)=
X10
三、测量人口腔上皮细胞
从显微镜载物台上取下镜台测微尺，换上人口腔上皮细胞标本，测量细胞、细胞核的长短径。
作 业
一、分别求出使用低倍镜(10X)，高倍镜(40X)时目镜测微尺每格代表的长度：
低倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= XlO(μm)= μm
高倍镜：目镜测微尺每格代表的长度= XlO(μm)= μm
二、分别绘制所观察的6种细胞并注明基本结构。
三、计算蟾蜍红细胞的核质比例。
计算细胞、细胞核体积的公式：
圆 形 V=4/3πr 3(r为半径)
椭圆形 V=4/3πab2(a、b为长、短半径)
核质比 N／D=Vn／(Vc—Vn)(Vn为核的体积，Vc是细胞质的体积)
实验二 线粒体(Mitochondrion)的
活体染色及电镜照片观察
实 验 目 的
掌握一种活体染色方法,了解光学显微镜和电子显微镜下线粒体基本形态结构。
实验用品
一、材料和标本 兔子一只、线粒体的电镜照片。
二、器材和仪器 显微镜、手术器材一套、解剖盘、小平皿、载片、盖片、吸水纸、10ml注射器、吸管。
三、试剂 l／300詹纳斯绿B染液、Ringer氏液(哺乳类用)。
实 验 内 容
一、兔肝细胞线粒体的活体染色
（一）原理
线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿 B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。
（二）方法
用空气栓塞处死兔子，置于解剖盘内，迅速打开腹腔，取兔肝边缘较薄的肝组织一小块（2～3mm3），放入盛有Ringer氏液的平皿内洗去血液(用镊子轻压)，用吸管吸去Ringer氏液，在平皿内加1／300詹纳斯绿B染液，让组织块上表面露在染液外面，使细胞内线粒体的酶系可进行充分的氧化，这样才有利于保持染料的氧化状态，使线粒体着色。当组织块边缘染成篮色时即可，一般需要染30分钟。
染色后，将组织块移到载片上，用镊子将组织块拉碎，就会有一些细胞或细胞群从组织块脱离。
将稍大的组织块去掉，使游离的细胞或细胞群留在载片上，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余水分。
(三)结果
显微镜观察，肝细胞质中许多线粒体被染成蓝绿色，呈颗粒状。
二、线粒体的光镜切片观察
用詹纳斯绿B染色的兔肝细胞光镜切片，肝细胞中的线粒体呈蓝绿色的颗粒。
三．线粒体的电镜照片观察
不同细胞中线粒体的形态和数目不同。线粒体的外形多样，如圆形、椭圆形、哑铃形和杆状。线粒体的数目与细胞类型和细胞的生理状态有关，线粒体多聚集在细胞生理功能旺盛的区域。
线粒体脊的数目与分布方式是多种多样的。一般与线粒体长轴垂直排列，但也可见到与线粒体长轴平行排列的脊。脊的横切面呈囊状或管状。脊的数量与细胞呼吸机能的强度有很大关系。
这有三张线粒体超薄切片的电镜照片：第一张是小鼠肾小管上皮细胞中线粒体的电镜照片，可见线粒体呈椭圆形和杆状，由双层膜包围，内膜向内突起成平板状脊，脊与线粒体长轴垂直排列，肾小管上皮细胞重吸收作用需要能量，线粒体数目多。第二张是恒河猴脊髓突触内线粒体。可见线粒体体积小、数目多，脊与线粒体呈同心圆排列。第三张是小鼠睾丸间质细胞线粒体，线粒体的脊为分支的管，在照片上呈单层膜泡状。
作 业
绘制光镜下肝细胞活体染色所见的线粒体及电镜下肾小管上皮细胞中线粒体的形态结构。
(时伟红编)
实验三 液泡系(Vacuolar system)的活体染色
及电镜照片观察
实 验 目 的
掌握一种活体染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下液泡系的基本形态结构。
实 验 用 品
一、材料和标本 蟾蜍一只，软骨细胞电镜照片。
二、器材和仪器 光学显微镜一台、手术器材一套、解剖盘一个、载片、盖片、吸水纸。三、试剂 l／3000中性红染液、Ringer氏液(两栖类用)。
实 验 内 容
一、蟾蜍胸骨剑突软骨细胞液泡系活体染色及观察
(一)原理
在动物细胞内，凡是由膜所包围的小泡和液泡除线粒体外都属于液泡系，包括高尔基器、溶酶体、微体、消化泡、自噬小体、残体、胞饮液泡和吞噬泡，都是由一层单位膜包围而成。软骨细胞内含有较多的粗面内质网和发达的高尔基复合体，能合成与分泌软骨粘蛋白及胶原纤维等，因而液泡系发达。
中性红是液泡系特殊的活体染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关。
(二)方法
取一只蟾蜍，破坏脑和脊髓，剪开胸腔，取胸骨剑突软骨最薄部分的一小片，放在载片上，滴两滴1／3000中性红染液，染色8～lO分钟，用吸水纸吸去染液，加一滴Ringer氏液，盖上盖片，吸去多余Ringer氏液。
(三)结果
显微镜下观察，可见软骨细胞为椭圆形，细胞核周围有许多染成玫瑰红色．大小不一的小泡，即软骨细胞液泡系。
二、大白鼠胫骺软骨细胞电镜照片的观察
动物细胞液泡很小，即使是活体染色也只能看出是一个小点，为了进一步看清液泡的结构我们有必要观察软骨细胞的电镜照片。
大白鼠胫骺骨细胞电镜照片，细胞核与核仁很清楚，细胞质中有丰富的粗面内质网，液泡系发达，液泡由单层膜包围，细胞周边有液泡释放。
作 业
绘制光镜下软骨细胞液泡系。
(时伟红编)
实验四 细胞中的微丝染色及微丝
与细胞形态的实验观察
实 验 目 的
掌握微丝的染色方法，了解光学显微镜和电子显微镜下微丝的基本形态结构。
实 验 用 品
一、材料和标本 盖片培养的成纤维细胞三片。
二、器材和仪器 光学显微镜一台、镊子一把、小平皿六个、载片三个、吸水纸、37℃恒温箱。
三、试剂 PBS(pH7.2)、2％Triton X—100液、M—缓冲液、3％戊二醛固定液、0.2％考马斯亮兰染液、100μg／ml的细胞松驰素B、DMEM培养液。
实 验 内 容
一、成纤维细胞微丝的染色及其对细胞松驰素B的反应
(一)原理
微丝普遍存在于多种细胞，对细胞的形状和运动有一定作用。细胞松驰素B可与微丝的亚单位肌动蛋白结合，从而破坏微丝，改变细胞的形状。
（二）细胞松驰素B处理成纤维细胞与染色观察
1．在平皿中有三张成纤维细胞贴壁生长的盖片，在超净工作台内将一张盖片移入另一皿中继续培养，用作对照。
2．在有两片的平皿内加100μg／ml的细胞松弛素B 4滴继续培养半小时。
3. 将用细胞松弛素B处理过的两张盖片取一张做染色处理，另一张用培养液洗五次（在平皿内换五次培养液，每次都要摇动），继续培养、观察。两小时后细胞形状恢复，接近正常。
4．对恢复的盖片与第一张没用药的盖片一同做染色处理。
5．染色处理
①将需染色的盖片放入盛有PBS的平皿内用吸管轻轻吹洗盖片，换液三次，每次3分钟，洗去培养液。
②将盖片移入2％Triton X一100液，置37℃恒温箱内处理20～30分钟，以提取骨架以外的蛋白质，使骨架图像清晰。
③立刻将盖片移入M一缓冲液，换洗三次，每次3分钟。M一缓冲液有稳定细胞骨架的作用。
④将盖片移入3％戊二醛固定15分钟。
⑤将盖片移入0.2％考马斯亮兰染液中，染色15分钟。然后小心地用自来水冲洗，空气干燥。
(三)结果
光镜观察，微丝聚集成的张力纤维束被染成蓝色。在没用药的标本上，成纤维细胞多数有突起，微丝沿突起规则排列；用细胞松驰素B处理的标本，由于微丝被破坏突起缩回，多数细胞形状变圆；用药处理后又洗去药的标本，由于解除了药的作用，肌动蛋白重新聚台形成微丝，细胞形状恢复正常。
二、丽藻细胞内胞质环流及其对细胞松弛素B的反应
(一)原理
丽藻细胞大，整个细胞的中央为大液泡占据。靠近液泡是一层溶胶样流动的内质，在内质与质膜之间，为静止的外质，其中含有叶绿体。内质中含有许多颗粒，可以清楚地看到胞质环流。在丽藻细胞中的微丝与胞质环流有密切关系。成束的微丝出现在外质与内质接口(溶胶和凝胶接口)并交织一起，与环流方向平行。用细胞松弛素B处理后，就可抑制胞质的环流运动。
(二)方法
1．剪下一小块丽藻叶片(1～2cm)，置于载片上，盖上盖片。
2．观察（阳光充足时效果较好）。
3．再取一块丽藻叶片，滴一滴细胞松弛素B，10~15分钟后盖上盖片，观察。
4．洗去药物，再观察。
(三)结果
在丽藻内质中可以看到胞质环流，用细胞松弛素B处理后，胞质环流停止，洗去药物，又出现胞质环流。
三、微丝的电镜照片观察
恒河猴脊髓内神经纤维中微丝电镜照片，可见微丝是实心结构，直径5～8cm，它均匀地分散于细胞基质中，或排列成束和网状。
作 业
绘出三种不同情况下细胞中微丝的分布。
(时伟红编)
实验五 细胞器的光镜切片
和电镜照片观察
实验目的
观察除了实验二～五以外的其它细胞器在光学显微镜和电子显微镜下的基本形态结构。
实验内容
一、三种细胞器的光镜切片
（一）高尔基复合体(Golgi Complex)
用镀银法染色的豚鼠脊神经节光镜切片:神经细胞因合成运输大量的蛋白质而含有发达的内质网和高尔基复合体，在低倍镜下观察，神经节的假单极细胞体被神经束分隔成群。神经细胞的胞体呈圆形或椭圆形。转换高倍镜观察，细胞中央不着色的圆形区为细胞核。在核的周围有黑褐色颗粒状或呈不规则的条索状结构即为高尔基复合体。
图5一l神经节细胞(示高尔基复合体)
(二)尼氏小体(Nissl’s Body)
甲苯胺兰染色的牛脊髓涂片，尼氏小体即光镜下的粗面内质网。在低倍镜卡观察，染成蓝色的大三角形、星形细胞就是脊髓前角神经细胞，染色较深的小细胞为神经胶质细胞。转换高倍镜观察，可见脊髓前角神经细胞的细胞质中许多蓝色颗粒或网状结构即为尼氏小体。
图5—2 脊髓前角神经细胞的尼氏小体
(三)中心体(Centrosome)
铁苏木素染色的马蛔虫子宫切片，在低倍镜下观察可见许多受精卵细胞，细胞的外面有卵壳，细胞与卵壳之间的腔叫卵壳腔。在某些卵细胞内，于核附近有圆形的小粒——中心粒，它与周围致密的细胞质——中心球，组成中心体。转换高倍镜观察，可见中心体的外围还有星状的放射细丝即星体。
染色体中心体
图5—3马蛔虫受精卵细胞、分裂中期(示中心体)
二、六种细胞器的电镜照片
（一）高尔基复合体(Golgi Complex)
人体胃粘膜细胞高尔基复合体电镜照片：细胞质中有散在的高尔基复合体，其结构要由三部分组成：扁平囊、大囊泡和小囊泡，它们共同构成紧密重叠的囊泡结构。扁平囊约3～8层，它们平行排列，略弯曲成弓形。凸出的一侧为形成面，可见许多小囊泡，凹入的一侧为成熟面，可见扁平囊末端呈球形膨大，在分泌细胞中膨大部分不断脱离扁平囊，形成分泌泡。
(二)内质网(Endoplasmic Reticulum)
人胃壁细胞、恒河猴脊髓前角运动神经细胞粗面内质网电镜照片：粗面内质网在分泌蛋白质的细胞中较发达，在细胞核周围可见有较密集的膜层结构即为粗面内质网，它们大都呈片状排列，粗面内质网可与细胞核膜相通连。在粗面内质网的膜外表面附着许多小颗粒，即核糖体。
人胃粘膜盐酸细胞、小鼠睾丸间质细胞滑面内质网电镜照片：盐酸细胞分泌盐酸，细胞中密集的圆泡，无核糖体附着即滑面内质网，参加盐酸的合成。小鼠睾丸间质细胞中含有丰富的分支管状滑面内质网，合成固醇类的雄激素。
(三)中心粒(Centriole)
白血病细胞的中心粒电镜照片：中心粒是相互垂直的两个短筒状小体，从横切面看，每个短简由9组三联体微管组成。
(四)溶酶体(Lysosome)
小鼠肝细胞、人胃癌细胞溶酶体电镜照片：溶酶体为一层单位膜包围的囊状结构。溶酶体呈球形，质地均匀，吞噬性溶酶体依结合物不同而呈不同形态，溶酶体主要含酸性水解酶。
(五)核糖体(Ribosome)
小鼠肾细胞核糖体电镜照片：核糖体是由核糖核酸和蛋白质构成的大小亚基组成的椭圆形颗粒，附着于内质网上的称附着核糖体，此外还有散在于细胞质中的游离核糖体，而多个核糖体由mRNA串连在一起叫多聚核糖体。
(六)细胞核(Cell Nucleus)
豚鼠肝细胞核、人胃癌细胞核电镜照片：可见核膜由双层单位膜构成。内外核膜相距一定的距离结合形成核孔。核膜外层也附着核糖体并与内质网相通。
核中的海绵状球形结构就是核仁，它由纤维和颗粒构成。
在核膜内面和核仁四周，着色较深的为异染色质，其余着色较浅的是常染色质。
三、观察恒河猴脊髓前角运动细胞的电镜照片，总结细胞的超微结构
照片中是一个多角形的脊髓前角运动细胞，细胞表面以非常细的线条与周围分界，就是细胞膜。中央有圆形的细胞核，核膜密布核孔，核膜内侧少量着色深而致密的是异染色质，色浅的是常染色质。核中央海绵状的一团深色结构是核仁。细胞膜与核膜之间为细胞质。其中有许多膜性结构形成扁平囊状或管泡状，密集成排的膜上附有颗粒，这就是粗面内质网。分散于细胞质中内质网间的许多圆形或棒状膜结构是线粒体。在核的四周可见小泡，扁平囊等集合形成的高尔基复合体。在细胞质中还可见一些不规则形的黑色致密结构是脂褐质，细胞质基质中分散存在纤细的微丝和微管是细胞骨架成份。
(时伟红编)
实验六 细胞生理活动的实验观察
实 验 目 的
通过制片与观察加深理解细胞的运动、吞噬等生理活动。
实 验 用 品
一、材料和标本 雄性蟾蜍、小白鼠、l％鸡血悬液、6％淀粉肉汤、草履虫。
二、器材和仪器 光镜、2ml注射器、载玻片、盖玻片、解剖器材、滴管、移液管、试管、玻璃片、黑纸。
三、试剂 0.3％台盼兰、1％刚果红。
实 验 内 容
一、细胞的吞噬活动
(一)原理
白细胞是机体防御系统中能游走的单位。它分为粒细胞系、单核细胞系、淋巴系三类。它们有许多生理功能，如游走性、变形运动、趋化性、吞噬异物等。在白细胞中，以粒细胞、单核细胞的吞噬活动较强，故称此二类细胞为吞噬细胞。单核细胞由血液进入组织后逐渐演变成巨噬细胞。吞噬细胞主要靠吞噬来处理异物。吞噬细胞首先由于趋化作用而向异物游走，然后伸出伪足包围异物，并发生内吞作用形成吞噬泡将异物吞入细胞，继而溶酶体与吞噬泡融合消化异物。
(二)小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬活动的观察
l．实验前二天，每天向小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤O．5～1ml(含O．3％台盼兰，起标记作用)，以刺激腹腔产生较多的巨噬细胞(此步由教师在实验前进行完毕)。
2．实验时，每组取一只经上述处理的小鼠，腹腔注射1％鸡血悬液0．5～1ml，注射后轻揉小鼠腹部以使红细胞悬液分散均匀。
3．1小时后，用颈椎脱位法处死小鼠，迅速剖开小鼠腹壁，向腹腔注入O．5ml～1ml生理盐水，用牙签轻轻搅拌使生理盐水与腹腔液混匀。
4．用注射器抽取腹腔液，滴片，然后盖上盖片。
5．镜检，高倍镜下画图记录所见结果。
二、暗视野观察细胞的纤毛和鞭毛运动
(一)原理
暗视野照明法是一种不使照射被检物体的光线直接进入物镜的照明方法。常常用它来观察没有染色的活体细胞或胶体粒子。利用此照明法，在镜检时不能直接看到通过标本的照明光线，只有被检物体反射或衍射的光线进入物镜可以提高分辨率，在暗视野中可以看到明亮的被检物体的存在和运动，但它们的内部结构却看不清楚。
(二)自制遮光板变普通显微镜为“简单的暗视野显微镜”。
步骤：
1．将显微镜聚光器调到最高位，用低倍镜调焦至清楚。
2．取下目镜，从镜筒中观察并调节光圈的大小，使其与镜筒中所见物镜的视野相等。
3．放一块透明玻璃于载物台透光孔上，用尺子测量光圈孔径。
4．按照图6--1的形状，用黑纸剪成与调节后光圈孔径一样大小的中央遮光板。
5．将中央遮光板放置在显微镜的滤光框上，即可进行标本的暗视野观察。
注：如果使用高倍镜观察标本时，应按高倍镜调焦的视野大小重新制作中央遮光板。
图6—1中央遮光板
a．光圈孔径
b．滤光片直径
(三)观察蟾蜍上颌粘膜上皮细胞的纤毛运动
步骤：
1．用捣毁脑脊髓的方法处死蟾蜍。
2．腹部向上将蟾蜍固定在蜡盘上。
3．沿蟾蜍二侧口角向后剪开约l厘米，将下颌翻转固定在腹部。
4．在上颌中线距喉头1厘米处放置腊屑，观察腊屑向什么方向移动？记录腊屑开始移动到消失的时间(见图6--2蟾蜍口腔内面图)。
5．然后，用眼科剪刀剪取咽头前部的上颌粘膜约2×2cm2小块，用牙签挑取剪下的粘膜，将纵切面贴于载片上。
6．加一滴生理盐水于载玻片标本上，加盖玻片，镜检。
图6—2 蟾蜍口腔内面图
结果：
1．在低倍镜下观察上颌粘膜细胞纤毛运动的现象。
2．换高倍镜仔细观察纤毛有规律的运动。
(四)暗视野观察蟾蜍精子的鞭毛运动
步骤：
l．将前面实验所用蟾蜍沿腹中线开腹，暴露出黄色圆柱状精巢。
2．剪取一侧精巢于盛有自来水的平皿中，用镊子夹住精巢的一端，清洗去血污。
3．移取洗净的精巢于另一干净的平皿上，用眼科剪将精巢充分剪碎后，加入数滴自来水混匀。
4．用吸管吸取平皿内液体，滴一滴于载玻片上，盖上盖玻片，稍待2～3分钟于镜下观察。
结果：
1．在低倍镜下可见到视野中有许多精子：头部呈长锥形，尾为细长的线状结构。
2．置高倍镜下观察：可见有许多靠尾部鞭毛弯曲摆动驱使而运动的精子，测量鞭毛长度。
三、草履虫纤毛运动及食物泡的形成
图6—3 草履虫
草履虫是一种单细胞动物。虫体由一个细胞组成，能执行复杂的生理功能。
其体表，均匀密布纤毛，为运动细胞器。身体的前部有口沟，由前端斜向伸至体中部，口沟的底部为胞口，下部一短管斜向后部而入胞质，称胞咽。纤毛有规律的摆动使食物在胞咽聚结形成食物泡(吞噬泡)，最后脱离胞咽入胞质。食物泡随细胞质由体后端到前端不停环流，并与溶酶体(含酸性水解酶)融合，行使细胞内消化。
根据食物泡中刚果红指示剂的颜色变化(酸性时，为红色；近中性时，为黄色；碱性时，为蓝色)。可以观察到消化过程。
实验步骤：
1．取一滴草履虫培养液于载玻片上，放上几根棉花纤维，以减慢草履虫的运动。加盖玻片，制成临时装片。
2．观察草履虫的运动方式(观察时光线可调暗些)：可见镜下有许多样似倒置鞋底的草履虫，体表纤毛不断摆动，虫体以其中轴左旋前进，若遇阻力则试触后即刻回避而转向。
3．观察草履虫的食物泡的形成：
1)在盖玻片一侧加一滴l％的刚果红指示剂，用吸水纸从另一侧吸引使指示剂进入盖片下方，选一运动较迟缓的草履虫，移入高倍镜观察吞噬活动。
2)几分钟后可见草履虫体内出现许多红色食物泡，随着食物泡不停的在胞质中环流，食物不断消化，泡内酸性减弱或近中性，颜色渐渐呈黄色，食物泡渐小，最后食物泡颜色呈蓝色，不能被消化的残渣，环流到身体后部的胞肛排出，不排出时不易见到胞肛。
作 业
1．画图记录细胞吞噬实验所见结果，小鼠巨噬细胞吞噬实验如何解释细胞内台盼兰的着色？
2．在观察细胞纤毛和鞭毛运动实验中,记录一下腊屑从开始运动到消失的时间。
3．鞭毛和纤毛有何异同？
(朱亚勤编)
实验七 细胞组分的化学反应
实 验 目 的
了解核酸、蛋白质、糖及酶的细胞化学反应原理，掌握Brachet反应及碱性蛋白、酸性蛋白、糖原和过氧化物酶的细胞化学染色方法。
实 验 用 品
一、材料和标本 蟾蜍、小白鼠各一只、肝脏石腊切片、培养的Hela细胞。
二、器材和仪器 光学显微镜、解剖器材、蜡盘、载玻片、吸水纸、染色缸、盖玻片、水浴箱。
三、试剂PBS缓冲液(pH7.2)、甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液、纯丙酮、l/2丙酮+1/2二甲苯、纯二甲苯、70％乙醇、5％三氯醋酸、0.1％碱性固绿、0.1％酸性固绿、0.5％硫酸铜、联苯胺混合液、1％番红、无水乙醇、过碘酸酒精液、Schiff氏酒精液、亚硫酸水、Ehrlieh苏木精、95％乙醇、Carnoy固定液(甲醇：冰醋酸=3:1，体积比)
实 验 内 容
细胞的组织化学方法，是研究细胞成分常用的方法之一。它是利用化学试剂与细胞内的某些物质进行化学反应，从而在细胞局部形成有色沉淀物，再通过显微镜对组织内的生物化学成分进行定性、定位、定量研究。
一、Brachet反应一显示细胞内的DNA和RNA
(一)原理
细胞经甲基绿一呱咯宁混合液处理后，其中的DNA和RNA出现不同的呈色反应，一般认为这是由于带有负电荷的核酸对碱性染料呱咯宁和甲基绿具有亲和力，且这两种染料的作用有选择性，甲基绿染高聚分子的DNA呈蓝绿色，呱咯宁染低聚分子的RNA呈红色。由此对细胞中的DNA和RNA进行定位、定性、和定量分析。
(二)方法
l．接种Hela细胞于盖片上并培养24～48小时，使长成单层。
2．取出盖片，用PBS(pH7.2)轻轻冲洗盖片表面去除残渣。
3．放入Carnoy固定液中固定l小时。
4．浸入甲基绿一呱咯宁醋酸缓冲液中30分钟染色。
5．取出盖片放入蒸馏水中轻轻漂洗2～3次(2～3秒钟左右)，吸去水分。放入纯丙酮中分色2～3秒钟。
6. 放入l／2丙酮+1／2二甲苯中5秒钟。
7．放入纯二甲苯中透明5分钟。
8．滴一滴中性树胶于载玻片上，将盖片标本面朝下封片。
9．镜下观察
（三）结果
细胞质被染成浅红色，细胞核被染成蓝绿色，而其中核仁被染成紫红色（参照照片）。
二、细胞内碱性蛋白和酸性蛋白的显示
（一）原理
由于不同的蛋白质分子所带的碱性和酸性基团的数目不同，在pH值不同的溶液中，蛋白质分子所带的净电荷多少不同。如在生理条件下，整个蛋白质所带负电荷多，则为酸性蛋白质；带正电荷多，则为碱性蛋白质。据此，可将标本经三氯醋酸处理提出核酸后，用不同pH值的固绿染液分别染色，细胞内的酸性蛋白和碱性蛋白质显示出来。
（二）方法
1．以破坏脊髓法处死蟾蜍，将其腹面向上放人蜡盘中，剪开胸腔，打开心包。小心将心脏剪一小口，取心脏血一滴滴在干净载玻片一端，推片，按此法制备二张血涂片，室温晾干。
2. 将涂片作好标记放在70％乙醇中固定5分钟，室温晾干。
3．放入5％三氯醋酸中60℃30分钟，抽提出核酸。
4．清水冲洗多次（3分钟以上），以冲去痕迹的三氯醋酸。
5．滤纸吸干玻片上水分。
6. 一张片放入0.1％碱性固绿(pH8.0～8.5)中染色10～15分钟,另一张片放入0.1％酸性固绿(pH2.0～2.5)染色5～10分钟。
7．清水冲洗，盖上盖片镜检。
（三）结果
经碱性固绿染色片中，胞质、核仁不着色，细胞核大部分被染成绿色，是为碱性蛋白质存在处（参照照片）。经酸性固绿染色片中，因胞质和核仁中有酸性蛋白，被染成绿色。
三、细胞内过氧化物酶的显示
（一）原理
过氧化物酶能把许多胺类氧化为有色化合物，用联苯胺处理标本，细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色的联苯胺蓝，进而变为棕色产物，因而可以根据颜色反应来判定过氧化物酶的有无或多少。
（二）方法
1．取小鼠一只，以颈椎脱位法将其处死，迅速剖开其后肢暴露出股骨，将股骨一端斜向剪断，用PBS缓冲液湿润过的注射器针头吸出骨髓一滴滴到载玻片上。
2．推片，室温晾干。
3．将涂片放入0.5％硫酸铜中浸30秒~1分钟。
4．取出涂片直接放入联苯胺混合液中反应6分钟。
5．清水冲洗，放入1％番红溶液中复染2分钟。
6．清水冲洗，室温晾干。
7．镜检或封片后镜检。
（三）结果
涂片中可见一些细胞中存在着蓝色或棕色颗粒，为过氧化物酶所在位置。
四、过碘酸雪夫反应(PAS)——显示细胞内糖原(参照照片和示教片)
(一)原理
组织、细胞的多糖、粘多糖及粘蛋白等都可用PAS法来显示，其化学基础是利用过碘酸的氧化作用，打开碳链形成醛，生成的醛基与Schiff试剂中的无色品红反应形成紫红色化合物。
(二)方法
l．取l~2mm厚的肝组织块，用Carnoy氏液4℃固定4～6小时。
2．乙醇脱水、二甲苯透明。石蜡包埋，切片。
3．用70％乙醇展片。
4．脱蜡：二甲苯(1)5分钟→二甲苯(2)5分钟→100％乙醇5分钟→含1％火棉胶的乙醇液1分钟→70％乙醇1分钟。
5．直接浸入过碘酸酒精液反应5～15分钟，经70％乙醇洗片刻。
6．浸入Schiff氏酒精液反应15分钟。
7．亚硫酸水洗三次，以洗去多余的非特异性结合的色素，以及扩散的染料。
8．流水冲洗3～5分钟。
9．蒸馏水洗。
10．浸入Ehrlich苏木精复染20~30秒，使细胞核着色。
11．脱水：95％乙醇3分钟二次→100％乙醇3分钟二次→二甲苯透明10分钟二次。
12．加盖片镜检或树胶封固后镜检。
(三)结果
细胞中呈紫红的颗粒即为糖原(参照照片)。
五、苏丹Ⅲ染色——显示细胞内脂肪(示教片)
作 业
1． 用彩色笔绘出Brachet反应及PAS反应的镜下所见。
2．说明着色的碱性蛋白可能是什么物质?
(纪晓辉编)
实验八 细胞核与线粒体的分级分离
实 验 目 的
通过细胞匀浆和离心的方法分级分离细胞的组分，以了解其原理及过程。
实 验 用 品
一、材料和标本 小白鼠、冰块。
二、器材和仪器 玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
三、试剂 0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。
实 验 内 容
一、原理
细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析 分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、细胞核的分离提取
(一)操作步骤
1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
4．将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm，离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用；(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然干燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。
5．用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液悬浮沉淀物，以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，涂片③，自然干燥。
6．将①、②、③涂片用l％甲苯胺兰染色后盖片即可观察。
(二)结果
分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。
三、高速离心分离提取线粒体
(一)操作步骤
1．将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。
2．加入0．25mol／L蔗糖一0．003mol／L氯化钙液lml，用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管中，留取沉淀物，加入0.1ml 0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液混匀成悬液(可用牙签)。
3．取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上(分别标记④、⑤涂片)，各滴一滴0.02％詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。
(二)结果
油镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。
作 业
1．简要说明分级分离细胞的原理及意义。
2．比较一下分离细胞核时涂片①、②、③有什么不同?涂片③在你的实验结果中纯度如何？
2． 描述一下涂片⑤所见结果。
小白鼠
脱颈椎处死，迅速开腹
剪取肝组织
0.9％NaCl洗涤，称1g剪碎加8ml预冷的0．25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液
匀 浆
过滤，滤液移入离心管，滤
液涂片①
离 心
普通离心机2500rpm，15分钟
滴片 滴片
詹纳斯绿B染 詹纳斯绿B染
色④盖片 色⑤盖片
镜检 油镜检
图8—1 细胞核和线粒体分离图解
(朱亚勤编)
实验九 细胞分裂的形态观察
实 验 目 的
通过标本制备和观察了解生物体细胞的无丝分裂、有丝分裂形态特征及生殖细胞的减数分裂过程。
实 验 用 品
一、材料和标本 蛙血涂片、马蛔虫子宫切片和洋葱根尖切片、固定的蝗虫精巢。
二、器材和仪器 显微镜、擦镜纸、解剖针、眼科镊子、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养皿、冰箱。
三、试剂 Carnoy固定液、70％乙醇、醋酸洋红染液、45％醋酸、二甲苯。
实 验 内 容
细胞分裂对生物的个体发育和生存，对种族绵延有着十分重要的意义，高等生物体内细胞的分裂方式有三种：无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。
一、动物细胞无丝分裂的观察一蛙血涂片
(一)原理
无丝分裂不仅是原核生物增殖的方式，而且雷马克(Remak)于1841年最早在鸡胚血细胞中也发现此现象，因为此过程没有出现纺锤丝和染色体的变化，故称无丝分裂(Ami— tosis)。其后无丝分裂又在各种动植物中陆续发现，尤其在分裂旺盛的细胞中更多见，但遗传物质平均分配否?及其分裂的机制尚不十分清楚。
蛙红细胞体积较大、数多，而且有核，是观察无丝分裂的较好材料。
(二)观察与结果
在高倍镜下，可见到处于不同阶段分裂过程中的蛙红细胞，核仁先行分裂，向核的两端移动，细胞核伸长呈杆状；进而，在核的中部从一面或两面向内凹陷，使核成肾形或哑铃形改变；最后，从细胞中部直接收缩成两个相似的子细胞；子细胞较成熟的红细胞小。
二、细胞有丝分裂的观察一马蛔虫子宫切片、洋葱根尖切片
(一)原理
细胞有丝分裂(Mitosis)的现象是分别由弗勒明(Flemming，1882)在动物细胞和施特拉斯布格(Strasburger，1880)在植物细胞中发现。有丝分裂过程包括一系列复杂的核变化，染包体和纺锤体的出现，以及它们平均分配到每个子细胞的过程。
马蛔虫受精卵细胞中只有6条染色体，而洋葱体细胞的染色体为16条，因为它们都具有染色体数目少的特点，所以便于观察和分析。
(二)观察
1．动物细胞有丝分裂的观察——马蛔虫子宫切片
取马蛔虫的子宫切片标本，先在低倍镜下观察，可见马蛔虫子宫腔内有许多椭圆形的受精卵细胞，它们均处在不同的细胞时相。每个卵细胞都包在卵壳之中，卵壳与卵细胞之间的腔，叫卵壳腔。细胞膜的外面或卵壳的内面可见有极体附着。寻找和观察处于分裂间期和有丝分裂不同时期的细胞形态变化，并转换高倍镜仔细观察。
图9—1马蛔虫受精卵的有丝分裂
间期(Interphase)
细胞质内有两个近圆形的细胞核，一为雌原核，另一为雄原核。两个原核形态相似不易分辨，核内染色质分布比较均匀，核膜、核仁清楚，细胞核附近可见中心粒存在。
分裂期(Mitosis)
前期(Prophase)雌、雄原核相互趋近,染色质逐渐浓缩变粗、核仁消失，最后核膜破裂、染色体相互混合，两个中心粒分别向细胞两极移动，纺锤体开始形成。
中期(Metaphase)染色体聚集排列在细胞的中央形成赤道板，由于细胞切面不同，此期有侧面观和极面观的两种不同现象，侧面观染色体排列在细胞中央，两极各有一个中心体，中心体之间的纺锤丝与染色体着丝点相连；极面观由于染色体平排于赤道面上，六条染色体清晰可数，此时的染色体已纵裂为二，但尚未分离。
图9—2 洋葱根尖细胞有丝分裂
后期(Anaphase)纺锤丝变短，纵裂后的染色体被分离为两组，分别移向细胞两极，细胞膜开始凹陷。
末期(Telophase)移向两极的染色体恢复染色质状态，核膜、核仁重新出现，最后细胞膜横缢，两个子细胞形成。
2．植物细胞有丝分裂的观察——洋葱根尖切片
将洋葱根尖切片标本先在低倍镜下观察，寻找生长区，这部分的细胞分裂旺盛，大多处于分裂状态，细胞形状呈方形。换高倍镜仔细观察不同分裂时期的细胞形态特征．与动物细胞有丝分裂特征比较，找出植物细胞有丝分裂的特点和两者的区别。
三、蝗虫精巢减数分裂压片标本的制备与观察
(一)原理
减数分裂(Meiosis)是配子发生过程中的一种特殊有丝分裂，即染色体复制一次，而细胞连续分裂两次，结果使染色体数日减半的过程。减数分裂过程中体现了遗传三定律，所以说减数分裂在稳定种的遗传性状和繁殖中均起着重要作用。
蝗虫精巢取材方便，标本制备方法简单，染色体数日较少，例如，蝗虫初级精母细胞染色体数2n=22+X，经过减数分裂形成四个精细胞，每个精细胞的染色体数为n=ll+X或n=11(注：蝗虫的性别决定与人类不同，雌性有两条X染色体、雄性为XO，即只有一条X染色体，没有Y染色体)，一般多采用它来研究观察减数分裂染色体形态变化。
(二)蝗虫精巢压片标本的制备
l．采集 采集到各期分裂相的标本是实验成功的关键，解决这一关键要把握两点(1)时间：沈阳地区采集，一般在8月15至25日为宜；(2)虫体特征：雄虫翘膀长到刚好盖住腹部一半时，正好是雄虫精子发生的峰季，采集最适。在公园、田埂、河边、路旁的草丛中均可采到。
2．取材 将采到的雄虫，用大头针固定在木板或纸盒上，沿腹部背中线剪开体壁，见消化管背侧的浅黄色结构即是精巢，用镊子分离出来。
3．固定 把取出的精巢立即放入Carnoy固定液中，固定1小时，在期间用大头针小心分离精细管，加速固定，促进脂肪溶解。固定后移入70％乙醇中存放于4℃冰箱备用。
4．染色 取固定好的精细管2～3条，置于干净载玻片中央，用45％醋酸处理5分钟，用吸水纸吸干后，加1～2滴醋酸洋红染色15分钟。
5．压片 在染色材料上盖上盖玻片，再在盖玻片上放一块吸水纸，用大拇指垂直在盖玻片上适力下压(压片时不要滑动盖片)使精细管破裂细胞平展开，吸去溢出的染液，即可观察。
(三)蝗虫精子发生过程减数分裂的镜下观察(参照照片)
蝗虫精巢是由多条圆柱形的精细管组成，每条精细管由于生殖细胞发育阶段的差别可分成若干区，良好压片可见到从游离的顶端起始依次为精原细胞、精母细胞、精细胞及精子等各发育阶段的区域。
1．精原细胞(Spermatogonia) 位于精细管的游离端，胞体较小，由有丝分裂来增殖，其染色体较粗短、染色较浓。
2．减数分裂I(Meiotic division I) 减数分裂l是从初级精母细胞到次级精母细胞的一次分裂。
(1)前期I(Prophase I)在减数分裂中，以前期I最有特征性、核的变化复杂，依染色体变化，又可分为下列各期：
细线期(Leptotene stage)染色体呈细长的丝，称为染色线。弯曲绕成一团，排列无规则，染色线上有大小不一的染色粒，形似念珠，核仁清楚。
偶线期（zygotene stage）同源染色体开始配对，同时出现极化现象，各以一端聚集于细胞核的一侧，另一端则散开，形成花束状。
粗线期（Pachytene stage）每对同源染色体联合完成，缩短成较粗的线状，称为双价染色体，因其由四条染单体组成，又叫四分体。
双线期(Diplotene stage)染色体缩的更短些，同源染色体开始有彼此分开的趋势，但因两者相互绞缠，有多点交叉，所以这时的染色体呈现麻花状。
终变期(Diakinesis) 染色体更为粗短，形成Y、V、O等形状，终变期末核膜、核仁消失。
(2)中期I(Metaphase I)核膜和核仁消失，纺锤体形成，双价染色体排列于赤道面，着丝点与纺锤丝相连。这时的染色体组居细胞中央，侧面观呈板状，极面观呈空心花状。
(3)后期I(Anaphase I)由于纺锤丝的解聚变短，同源的两条染色体彼此分开，分别向两极移动。但每条染色体的着丝粒尚未分裂，故两条姐妹染色单体仍连在一起同去一极。
（4）末期I(Telophase I>移动到两极的染色体，呈聚合状态，并解旋，同时核膜形成，胞质也均分为二，即形成两个次级精母细胞，这时每个新核所含染色体的数目只是原来的一半。到此减数分裂I结束。
3．减数分裂Ⅱ(Meiotic divisison Ⅱ)减数分裂Ⅱ类似一般的有丝分裂，但从细胞形态上看，可见胞体明显变小，染色体数目少。
(1)前期Ⅱ(Prophase Ⅱ)末期I的细胞进入前期Ⅱ状态，每条染色体的两个单体显示分开的趋势，染色体象花瓣状排列，使前期Ⅱ的细胞呈实心花状。
(2)中期Ⅱ(MetaphaseⅡ)纺锤体再次出现，染色体排列于赤道面。
(3)后期Ⅱ(AnaphaseⅡ)着丝粒纵裂，每条染色体的两条单体彼此分离，各成一子染色体，分别移向两极。
(4)末期Ⅱ(TelophaseⅡ)移到两极的染色体分别组成新核，新细胞的核具单倍数(n)的染色体组，胞质再次分裂，这样，通过减数分裂每个初级精母细胞就形成了四个精细胞。
4．精子形成 在两次精母细胞分裂过程中，各种细胞器，如，线粒体、高尔基体等也大致平均地分到四个精细胞中，精细胞经一系列的分化成熟为精子。镜下精子头部呈梭形，由细胞核及顶体共同组成，尾部细长呈线状。
作 业
一、说明动植物细胞有丝分裂的区别。
二、绘制马蛔虫受精卵有丝分裂的各期细胞图像，并注明结构名称?
三、小结有丝分裂与减数分裂过程的异同点。
(谢荣林编)
实验十 正常细胞与肿瘤细胞常规核型的标本制备
实 验 目 的
掌握微量全血培养及正常细胞和肿瘤细胞常规核型的标本制备技术。了解正常及肿瘤细胞核型的一般特征。
实 验 用 品
一、材料和标本 健康人的外周血、培养的HeLa细胞和HL—60细胞。
二、器材和仪器 超净台、煤气灯、乳胶管、火柴、镊子、废液缸、离心机、水浴箱、定时钟、天平、离心管(10m1)、乳头吸管、显微镜、载玻片、平皿等。无菌器材有培养瓶、培养皿、注射器(5ml、lml)、注射针头(7号、 号)、刻度移液管(5ml、2ml、lml)、吸管等。
三、试剂 1640培养液、500单位／ml的肝素溶液、10μg／ml的秋水仙素溶液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液,O．5mg／ml的PHA溶液、0.075mol／L的KCl溶液，甲醇、冰醋酸、Giemsa原液、磷酸缓冲液(pH6.8)、生理盐水等。
实 验 内 容
一、微量全血培养
(一)原理
人体外周血中淋巴细胞是成熟的免疫细胞，正常情况下处于G。期不再增殖。PHA(Phytohemagglutinin，植物血凝素)是人和其它动物淋巴细胞的有丝分裂刺激剂，它能使处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进入细胞周期开始旺盛的有丝分裂。
人体微量全血培养是一种简单的淋巴细胞培养方法。此法采血量少、操作简便，在 PHA作用下进行短期培养即可获丰富的、有丝分裂活跃的淋巴母细胞，适于制备核型标本。各种因素的效应(如病毒、电离辐射、化学药剂等)也可在淋巴细胞的培养条件下进行观察，从而进行多种在体内无法进行的研究。因此它是细胞生物学及其它学科研究中的一种有效的方法。
(二)操作
1．打开超净台紫外灯20～30分钟。洗手、换洁净白大衣后进入操作室。启动超净台，点燃煤气灯。用75％酒精棉球擦洗手、各种试剂瓶及操作台面，然后将培养液及肝素、秋水仙素、PHA等所需溶液移入超净台。
2．在超净台内将每个培养瓶装入5ml培养液及0.2ml PHA溶液，封好备用。
3．用5ml注射器，7号针头，先吸取少许肝素湿润针筒，然后从肘静脉抽血l～2ml。
每个培养瓶接种全血O．2ml左右轻轻摇动使血和培养液混匀。
4．在培养瓶上标记好供血者姓名、性别、采血日期等，放入培养箱中37℃培养。每天轻轻震荡培养瓶二、三次，防止血球沉积并保证血细胞与培养液充分接触，促进细胞生长繁殖。
二、人淋巴细胞染色体标本制备
(一)原理
在淋巴母细胞分裂高峰时加入秋水仙素，破坏细胞纺锤体的形成，使细胞停止在分裂中期。然后收集细胞，低渗处理，使细胞胀大，染色体伸展。接着进行固定并除去中期分裂相中残存的蛋白质，使染色体清晰且分散良好。再结合离心技术去掉红细胞碎片，然后采用空气干燥法制片获得中期染色体标本。
(二)操作
1．微量全血细胞培养至68小时左右，用1ml注射器 号针头向每个5ml培养瓶内加2滴秋水仙素溶液，摇匀后继续培养3小时，此项操作不需要严格无菌。
2．按时终止培养，用吸管温和吹打成细胞悬液后，移至10ml离心管中。用天平平衡后以1000rpm离心8分钟，弃大部上清，剩0.5ml。再吹打成细胞悬液，加入预热37℃的 0.075mol／L的KCL溶液9ml，置37℃水浴中低渗处理30分钟(这期间配制3:1甲醇一冰醋酸固定液)。
3.向离心管中加入1ml固定液预固定。平衡后以1000rpm离心8分钟，同样剩 0.5ml上清。
4．轻轻将细胞吹成悬液，加5~6ml固定液，室温下固定30分钟。然后离心，弃上清，重复固定一次。再离心，留0.1～0.2ml上清，吹打成细胞悬液。
5．吸取1～2滴悬液，在距载片约15cm高度滴于预冷的干净载玻片上，迅速对准细胞吹气促进染色体分散。斜放载玻片，在空气中晾干(此期间配制Giemsa染液，Giemsa原液和磷酸缓冲液1:10)。
6．将标本面朝下放在染色槽中，加入染液染10分钟，自来水冲洗，晾干后观察。
(三)结果
低倍镜下，制片质量较好的标本上可看到有较多的分裂相，染色体之间分散良好，互不重叠。
油镜下观察可见每一条染色体都含有两条染色单体，两条单体由着丝粒相结。分区计数染色体数目并判定性别，或拍照后进行核型分析。
三、肿瘤细胞的染色体标本制备
(一)原理
利用肿瘤细胞无限繁殖的特点，掌握其体外生长动态，取处于对数生长期的细胞便可获得丰富的分裂相。肿瘤细胞染色体异常包括两个方面：
1．结构异常 即在肿瘤细胞常出现的染色体畸变，包括双着丝点染色体、环状染色体、断裂的染色体、染色体裂隙及微小体等。
2．数目异常 由于肿瘤细胞分裂失去应有的调控，可出现亚二倍体、超二倍体和多一
倍体数目异常现象。
肿瘤细胞染色体制备技术在细胞生物学、医学遗传学的基础研究和临床诊断、愈后观察等方面均有广泛用途。
(二)操作
l．以1.6× 105个／ml细胞浓度将FL—60细胞接种于培养瓶内，48小时后以终浓度为0.04μg／ml的秋水仙素处理2.5小时，移入10ml离心管。其余步骤与淋巴细胞染色体制备相同。
2.将长成单层的HeLa细胞按1:2传代进行培养，36小时后用终浓度为0.04μg／ml的秋水仙素处理3小时。按时终止培养，用0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液处理单层细胞，待细胞收缩变圆时，弃去消化液。加入少许低渗液将细胞从瓶壁洗脱，移入10ml离心管，加入预热37℃的低渗液至5 ~ 6ml，在37℃处理25分钟。以下步骤同淋巴细胞染色体核型制备。
(三)结果
计数HeLa细胞和HL—60细胞的染色体数并寻找是否有畸变的染色体。
附：人体染色体常规核型的分析
一、人体染色体的观察
取制备较好的染色体玻片标本，先在低倍镜下观察。在标本中选择一个染色体之间分散较好，互不重叠的中期分裂相，置于视野中央，然后换油镜仔细观察。每个染色体都含有两条染色单体，两单体连接处为着丝粒。计数时要把分散的染色体划分为几个区域以免计数重复或遗漏，然后计数并判定性别。
二、核型分析的方法
人体染色体常规核型的分析，在今天的染色体研究水平上作为染色体结构异常的疾病诊断已经失去意义，但对染色体数目异常仍具有诊断上的价值，尤其是起着分析其它几种显带核型的桥梁作用。通过常规核型的分析必须掌握三点：(一)会分组、(二)了解各组染色体的基本形态特征、(三)会计数数目和鉴定性别。
人体染色体的常规核型即按照Denver会议(1960年)提出的染色体命名和分类标准，将人类体细胞的46条染色体按大小、着丝点的位置分成七组(A、B、C、D、E、F、G、)23对的排列。
七组染色体的基本形态特征及分析顺序是：
A组是七组染色体中最大的一组，首先找出它。A组包括三对，即第1~3号6条染色体，第1号为最大、是中央着丝点，长臂近侧有次缢痕；第2号第二大、着丝点略偏离中央；第3号为三大，是中央着丝点。
接着确定B组：B组二对即第4～5号4条染色体，较大，均为亚中着丝点，两者不易区分开。
第三确定D组和G组：D组三对即第13～15号6条染色体，中等大小均为近端着丝点，短臂末端有随体。G组二对即第21～22号4条染色体，是最小的一组，均为近端着丝点，短臂末端有随体，长臂常呈分叉状，21号稍小于22号。Y染色体被隶属于该组，短臂无随体，一般较2l、22号大点。
第四确定F组：F组二对即第19～20号4条染色体，染色体比G组稍大、均为中央着丝点。
染色体分组形态特征表
第五确定E组：E组三对即第16～18号6条染色体，较小，第16号是中央着丝点，17、18号是亚中着丝点。
余者为C组：C组七对即第6～12号14条染色体，按大小顺序依次排列，均是亚中着丝点；X染色体被隶属该组，大小居6～7号之间，是亚中着丝点。
上述人的常规核型中，1～22号为常染色体，男女共有，另一对为性染色体，决定性别，男性为XY，女性为XX，人的正常核型写法：男46，XY；女46，XX。
图15—1 各组染色体基本形态特征的模式图
作 业
一、计数HeLa和HL一60细胞的染色体数，它们各属哪种数目异常?
二、分析制备好的正常人外周血淋巴细胞染色体，判断其性别。
三、要想制备出好的染色体标本应该注意哪些环节?谈谈自己实验成功或失败的体会。
(王明武编)
实验十一 细 胞 融 合
实 验 目 的
掌握细胞融合原理、应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。
实 验 用 品
一、材料 鸡红细胞
二、器材和仪器：显微镜、离心机、水浴箱、刻度离心管、试管、载玻璃片、盖玻片
三、试剂 50％PEG(MW4,000)、Hanks液(pH7.4)
实 验 内 容
一、原理
细胞融合(Cell fusion)，即在自然条件下或用人工方法(生物的、物理的、化学的)使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。
细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有灭活的仙台病毒(Sendai virus)，聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)和电脉冲。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。
二、方法
(1)取新鲜鸡血以0.85％生理盐水制成10％的悬液。
(2)称取0.5克PEG(MW=4,000)放入试管内，在酒精灯上融化之，迅速加入0.5ml预热的Hanks液混匀制成50％的PEG溶液。放入37℃水浴中待用。
(3)取上述10％的鸡红细胞悬液1ml放入离心管中，再加入5ml Hanks液混匀，然后以1,000rpm离心5分钟，小心弃去上清，用指弹法将细胞团块弹散。
(4)取上述50％PEG溶液0.5ml，在1分钟内滴加到鸡红细胞悬液，边加边轻轻摇动混匀。待PEG全部加入后静置1分钟左右。此全部过程都要求在37℃水浴内进行。
(5)缓慢滴加9ml Hanks液以终止PEG的作用，在37℃水浴内静置5分钟。
(6)离心弃上清后，取一滴融合后的细胞悬液滴片，加盖片镜检。
三、结果观察
在高倍镜下可以看到有两个或两个以上的鸡红细胞膜融合在一起，形成一个异核体细胞。要注意辨别融合细胞与重叠的鸡红细胞。
四、融合率的计算
在高倍镜下随机计数200个细胞(包括融合的与未融合的细胞)，以融合细胞(含两个或两个以上的细胞核的细胞)的细胞核数除以总细胞核数(包括融合与未融合的细胞核)即得出融合率。公式如下：
作 业
l．在显微镜下按顺序绘制所观察到的细胞融合各阶段，并注明主要特点。
2．你测定的细胞融合率为多少?
(张之曾编)
实验十二 应用细胞融合技术制备染色体提前凝集标本
实 验 目 的
通过细胞融合技术，初步了解染色体提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞三种时相的提前凝集染色体特点。
实 验 用 品
一、材料 人宫颈癌上皮细胞(HeLa细胞)
二、器材和仪器 显微镜、离心机、水浴箱、热吹风机、10ml刻度离心管、5 针头注射器、试管架、染色槽、废液缸、吸水纸、擦镜纸、冰冻载玻片、香柏油瓶、记号笔、酒精灯。
三、试剂 50％PEG、Hanks液(pH7.4)、RPMI一1640培养基(含10％灭活小牛血清，pH7.4)10μg／ml秋水仙素，0.075mol／L KCl低渗液、2％柠檬酸钠溶液、0.2％次甲基兰染液、1／15mol／L PBS、Carnoy固定液、Giemsa染液。
实 验 内 容
一、原理
如实验十一所述，两个或两个以上的同种或不同种细胞可以在诱导物的作用下融合成一个细胞。
七十年代初，由于发现M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染色体称提前凝集的染色体(Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。这项技术已应用于细胞周期分析、正常细胞和肿瘤细胞染色体的微细结构的研究、多种因素作用细胞使染色体损伤及修复效应的研究，预测某种血液病的病程、愈后及复发的临床实践等方面。
二、方法
1．收集培养的M期HeLa细胞 取一瓶处于对数生长期的HeLa细胞，向培养基中加入10μg／ml的秋水仙素使终浓度为0.04μg／ml，在37℃二氧化碳培养箱内继续培养12小时，使大量生长的细胞被阻断于M期。每组取一瓶经上述处理的细胞，以平行于细胞生长面方向反复振摇，使培养液不断冲涮细胞层(或用吸管吹打)，M期细胞因变成球形容易脱离瓶壁而悬浮。将含有M期细胞的培养基移入离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清加人5ml Hanks液，用吸管吹打成细胞悬液。
2．收集培养的HeLa细胞 取一瓶生长良好的HeLa细胞，弃去培养基。加入少量0.25％的胰蛋白酶消化2～3分钟，弃去胰酶消化液。然后加入5ml Hanks液。用吸管吹打成单个悬浮细胞备用。
3．50％PEG的制备
称取0.5g PEG(MW4,000)，倒入离心管中，在酒精灯上加热使之融化(约为0.5ml)，再加入预热的Hanks液0.5ml混匀，放在37℃水浴中待用。
4.细胞融合
(1)将上述l、2两管细胞倒入一个离心管中充分混匀。1000rpm离心5分钟，去掉上清，再小心地吸尽残液。
(2)用指弹法弹散细胞，在37℃水浴条件下吸取0.5ml 50％PEG，逐滴加入离心管内，并不断地轻轻摇动，整个过程约90秒钟。然后迅速加入5ml Hanks液以终止PEG的作用。在37℃水浴甲静置5分钟。
(3)1000rpm离心5分钟。弃去上清，加入2ml有血清的RPMI一1640培养基，同时用针头的注射器垂直加入10μg／ml的秋水仙素1滴，轻轻吹打成悬液，37℃水浴中温育
30~60分钟。
5．制备PCC标本
细胞温育后，1000rpm离心5分钟弃去上清，加入10ml 0.075mol／L KCl低渗液轻轻制成悬液。在37℃处理25分钟左右；终止时加入lml Carnoy固定液进行固定，1000rpm离心8分钟，去掉上清，指弹离心管底部使细胞分散，加入10ml Carnoy固定液固定30分钟，1000rpm离心5分钟，弃去上清留0.2ml，用吸管轻轻吹打成悬液，取预冷的载玻片滴一张片，烤干后，Giemsa染色15分钟左右，水冲洗，干燥后镜检。
三、结果观察
在低倍镜下，可以容易地找到M期与I期细胞融合而诱导产生的PCC图像，由于处于I期不同时相的细胞均能与M期细胞融合而被诱导产生PCC，因此有三种不同形态特点的提前凝集染色体：G1期PCC、S期PCC和G2期PCC。其形态特点分别是：
G1期PCC为单线染色体，细长，着色浅呈蓬松的线团状；S期PCC由于染色体解旋， DNA以多点进行复制，复制后的部分着色较深，以双线染色体片段形式存在，故呈粉碎颖粒状结构；G2期PCC因DNA复制完毕，所以可见凝集的双线染色体，但较M期染色体细长。
根据上述I期各时期PCC特点。在自己制备的标本中观察并分析各期PCC的图像。
作 业
根据PCC图像的观察，试说明对于理解细胞周期和DNA复制有什么启示?
(张之曾 谢荣林编)
实验十三 培养细胞的形态观察和计数
实 验 目 的
了解培养中的动物细胞的一般形态和生长状态；掌握细胞计数的基本方法。
实 验 用 品
一、材料和标本 培养中的HeLa细胞(人子宫颈癌上皮细胞)、NIH3T3(小鼠成纤维细胞)、HL一60细胞(人白血病细胞)
二、器材和仪器 倒置显微镜、细胞计数板、普通光学显微镜、乳头吸管
三、试剂 0.3％台盼兰染液、0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液
实 验 内 容
一、培养细胞的形态观察
(一)原理
体外培养的细胞主要有两种状态。一种是能贴附在培养支持物上的细胞，如HeLa细胞、NH3T3等，叫贴壁型细胞，体外培养的细胞绝大多数都属于这种细胞。另一种细胞并不贴附在容器的壁上，而是悬浮在培养液中生长，如HL—60，叫做悬浮型细胞，这类细胞主要是血液原性或癌原性的细胞。
(二)操作
l．将细胞培养瓶从37℃二氧化碳培养箱(或温箱)中取出，注意观察细胞培养液的颜色和清澈度。然后，将细胞培养瓶平稳地放在倒置显微镜载物台上，此时应注意不要将瓶翻转，也不要让瓶内的液体接触瓶塞或流出瓶口。
2．打开倒置镜光源，通过双筒目镜将视野调到合适的亮度。
3．调节载物台的高度进行对焦，在看到细胞层之后，再用细调节器将物像调清楚，注意观察细胞的轮廓、形状和内部结构。在观察时，最经常使用的是10X物镜。
(三)结果
贴壁细胞一般有两种形状，即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形，圆形核位于中央，生长时常彼此紧密连接成单层细胞片，如HeLa细胞。成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起，细胞群常借原生质突连接成网，如 NIH3T3(参照照片)。
贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡，细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之，则较差或已死亡。由于培养基内有pH指示剂的存在，因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞生长状态不好，或已死亡。实际上，一种细胞在培养中的形态并不是永恒不变的，它随营养、pH、生长周期而改变，但在比较稳定的条件下形态基本是一致的。在贴壁细胞培养中，镜下折光率高，圆而发亮的一般被认为是分裂期细胞。肿瘤细胞有重叠生长的特征。
二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定
(一)在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是进行实验必不可少的一种基本技能。
图13—1 细胞计数板顶面观和侧面观的图示
图13—2 放大的计数室
(二)操作
1．将培养瓶中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶中加入0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液lml,静置3～5分钟，待见到细胞变圆，彼此不连接为止。
2．将试管中的培养液倒回培养瓶中，并轻轻进行吹打，制成细胞悬液。
3．取细胞悬液0.5ml，加入0.3％台盼兰染液0.5ml，混合后染色3～5分钟。
4．滴加少许已染色的细胞悬液于放有盖片的细胞计数板的斜面上，使液体自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。
5．在普通光镜10X物镜下计数四个大格内(如图13—1，13—2示)的细胞数，压线者数上不数下，数左不效右。
(三)结果
按下式进行细胞浓度的计数：
注① 4大格中的每一大格体积为0.1mm3。1ml=l，0000大格，因此，1大格细胞数×104=细胞数／ml。
注② 染色标本在15分钟内检查计数，因为台盼兰染液可以迅速地使死细胞染上蓝色，延长时间活细胞也将着色，用此方法来分辨死活细胞。
进行细胞计数时应力求准确，因此，在科学研究中，往往将计数板的两侧都滴加上细胞悬液，并同时滴加几块计数板(或反复滴加一块计数板几次)，最后取结果的平均值。
作 业
一、问题
下面是某些贴壁细胞培养数天后观察计数的结果：
1．根据上表分析各瓶细胞的生长情况是：
A 细胞生长状态良好；
B 培养时间太短；
C 细胞污染可能性大；
D 细胞与环境生长不适；
E 细胞营养不足。
甲( ) 乙( ) 丙( ) 丁( )
2．根据你的判断应采取的措施是：
A 将细胞弃去；
B 立即换新鲜培养液；
C 立即传代；
D 放置继续观察；
E 换到新的培养瓶中。
甲( ) 乙( ) 丙( ) 丁( )
二、作图
将你观察到的培养细胞作一草图。
三、计算
将你计数的每毫升细胞悬液中的细胞总数，死、活细胞的百分比例计算出来。
(宁刚、毕卫真编)
实验十四 细胞的原代和传代培养
实 验 目 的
初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。
实 验 用 品
一、材料和标本 乳兔、HeLa细胞(人宫颈癌细胞)
二、器材和仪器 手术器械、平皿、培养瓶、吸管、离心管(灭菌后备用)、酒精灯、烧杯、超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜。
三、试剂 含有5％小牛血清的MEM培养液、0.01mol／L PBS，0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液、75％乙醇。
实 验 内 容
一、原代细胞培养
(一)原理
细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作
1．取材
用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀剪开用碘酒和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。置于无菌平皿中。
2．切割
用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化、接种培养
吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
(三)结果
细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
二、传代细胞培养
(一)原理
体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。在一代中，细胞培增3～6次。细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
(二)操作
1．将长成单层的原代培养细胞或HeLa细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内的培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞为宜)，静置5～10分钟。
2.在倒置镜下观察被消化的细胞，如果细胞变园，相互之间不再连接成片，这时应立即
在超净台中将消化液倒掉，加入3～5ml新鲜培养液，吹打，制成细胞悬液。
3．将细胞悬液吸出2ml左右，加到另一个培养瓶中并向每个瓶中分别加3ml左右培养液，盖好瓶塞，送回二氧化碳培养箱中，继续进行培养。
(三)结果
一般情况，传代后的细胞在2小时左右就能附着在培养瓶壁上，2～4天就可在瓶内形成单层，需要再次进行传代。
三、器材及液体的准备和无菌操作的注意事项
(一)器材和液体的准备
细胞培养用的玻璃器材，如：培养瓶、吸管等在清洗干净以后，装在铝盒和铁筒中，120℃，2小时干烤灭菌后备用；手术器材、瓶塞、配制好的PBS液用灭菌锅15磅，20分钟蒸气灭菌；MEM培养液、小牛血清、消化液用G6滤器负压抽滤后备用。
(二)无菌操作中的注意事项
在无菌操作中，一定要保持工作区的无菌清洁。为此，在操作前要认真地洗手并用75％乙醇消毒。操作前20～30分钟起动超净台吹风。操作时，严禁说话，严禁用手直接拿无菌的物品，如瓶塞等，而要用器械，如止血钳、镊子等去拿。培养瓶要在超净台内才能打开瓶塞，打开之前用乙醇将瓶口消毒，打开后和加塞前瓶口都要在酒精灯上烧一下，打开瓶口后的操作全部都要在超净台内完成。操作完毕后，加上瓶塞，才能拿到超净台外。使用的吸管在从消毒的铁筒中取出后要手拿末端，将尖端在火上烧一下，戴上胶皮乳头，然后再去吸取液体。总之，在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯的周围进行。
作 业
一、原代细胞和传代细胞培养有哪些区别?
二、总结一下你自己的经验，怎样才能既迅速，又保证无菌操作。
(宁刚 王维琴编)
实验十五 酸性磷酸酶的显示
实 验 目 的
了解Gomori硝酸铅改良法显示细胞内酸性磷酸酶的方法和原理
实 验 用 品
一、材料 427细胞
二、器材 温箱、冰箱、显微镜、乳头吸管
三、试剂 冷丙酮或95％乙醇，Gomori硝酸铅作用液，2％甲基绿、1％硫化铵
实 验 内 容
一、原理
酸性磷酸酶广泛存在于各种动物组织细胞，以前列腺、肝及脾含量最丰富。酸性磷酸酶在组织的退变过程中活性增强。在大部分组织中，它主要存在于溶酶体内，在溶酶体膜稳定完整时底物不易渗入溶酶体中，溶酶体内的酸性磷酸酶活力微弱或无活性。细胞经固定后，在合适的pH条件下，膜变得不稳定而改变其透性，底物渗透入溶酶体中，酶显现活力。故在研究溶酶体异常时有意义。
Gomori硝酸铅改良法是根据：以磷酸酯为底物，其被磷酸酶水解后释放出磷酸基，在 pH5左右和铅盐结合成磷酸铅盐，但磷酸铅无色，须经硫化铵作用使其变成棕黄色至棕黑色的硫化铅沉淀。
二、方法
1．将培养的427细胞在冷丙酮或95％乙醇中固定15～30分钟。
2．待片干燥。
3．移入已预热(37℃)的作用液中孵育2小时。
4．蒸馏水洗。
5．移入2％醋酸酸化1分钟，蒸馏水快速漂洗。
6．移入l％硫化铵1分钟，自来水漂洗数次。
7．必要时用甲基绿复染。
三、结果观察
酸性磷酸酶活性结构呈棕黄色至棕黑色。
对照：在处理过程中，在作用液中不加入甘油磷酸钠而加入蒸馏水，则呈阴性。
作 业
1． 绘出酸性磷酸酶显示镜下所见。
2．试说明酸性磷酸酶活性结构为何种细胞器?
讨 论 题
1．溶酶体分为几类?各有何特点?
2． 溶酶体是如何形成的?其标志酶是什么?如何在显微镜下显示?
3．溶酶体具有哪些功能?
(张 婕 王维琴编)
实验十六 肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定
实 验 目 的
初步掌握肿瘤细胞的软琼脂集落培养和测定方法，并了解药物对肿瘤细胞的诱导分化作用。
实 验 用 品
一、材料和标本 HL—60细胞(人急性早幼粒细胞白血病细胞)。
二、器计和仪器 超净工作台、二氧化碳培养箱、显微镜、培养瓶、吸管、酒精灯、血细胞计数板、16mm的塑料多孔培养板(或35mm培养皿)。
三、试剂 含有15％～20％小牛血清的RPMIl640培养液、0.3％台盼兰、3％琼脂、二甲基亚砜(DMSO)。
实 验 内 容
一、原理
在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团，称之为集落。肿瘤细胞能无限繁殖，所以具有这种能力，而成熟分化的细胞则不能形成集落。HL一60细胞是一种急性早幼粒细胞白血病细胞，在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落。二甲基亚砜是一种细胞分化诱导剂，经二甲基亚砜处理后的HL一60细胞按粒系途径定向成熟分化，同时细胞的增殖力降低，几乎全部细胞丧失了软琼脂中形成集落的能力。因此，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗的疗效检验等方面。
二、操作
1．收集对数生长期的HL一60细胞，先按实验十三测定细胞活力，然后调整细胞浓度，制成300～1000活细胞／ml的细胞悬液。
2．取二个培养瓶每个瓶中加9ml调整好浓度的细胞悬液，然后各加入1ml3％琼脂(已融化，在65℃水浴中放置)，迅速加入，混匀。
3．用微量加样器吸140μl二甲基亚砜(MDSO)，加到一个瓶中，充分混匀，为实验组，另一瓶不加DMSO，为空白对照组。
4．取一个16mm多孔培养板，每孔加1ml(35mm培养皿需加2ml)细胞琼脂悬液，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。
5．在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。
以上各步骤均在无菌条件下进行。
6．然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。
7．培养7～lO天，肉眼观察并计数细胞集落。
三、结果
以肉眼可见的细胞团(含500个以上细胞)作为计数集落的标准。对照组HL一60细胞在含0.3％的软琼脂培养基中生长良好,每个孔中可见有多个集落形成，而实验组HL一60细胞因经二甲基亚砜诱导分化，细胞在软琼脂中的集落形成明显减少。
四、集落的计数和计算
集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔
集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100％
作 业
1．分别计数实验组与对照组细胞集落数并算出它们的集落形成率。
2．上述的结果说明了什么问题?
(毕卫真编)
实验十七 电子显微镜生物标本的制备及观察
实 验 目 的
了解电子显微镜的基本原理及电镜生物标本的制备方法和观察。
实 验 用 品
一、材料和标本 家兔一只。
二、器材和仪器 H—600透射电子显微镜、S—450扫描电子显微镜、超薄切片机(AO型)、解剖镜、震荡器、恒温箱、临界点干燥器、JB一3型离子镀膜机、单面刀片、铜网、解剖器材。
三、试剂 乙醚、2.5％戊二醛(0.1mol／L(pH7.4)二甲砷酸钠缓冲液配制)、1％锇酸、30％、50％、70％乙醇溶液、80％、90％、95％、100％丙酮溶液、环氧树脂(Epon812)包埋剂、醋酸铀染液、柠檬酸铅染液、双蒸水、2％单宁酸、乙酸异戊脂、液态CO2。
实 验 内 容
一、透射电子显微镜的标本制备及观察
(一)原理 电子显微镜是细胞生物学研究的重要工具，它以电子束为照明源，利用电子流具有波动的性质，在电磁场的作用下，电子改变前进轨迹，产生偏转、聚焦，因而电子束透过标本后在电磁透镜的作用下可放大成像。高速运动的电子流其波长远比光波波长短，所以电镜分辨率远比光镜高，可达0.14nm，放大倍率可达80万倍。由热阴极发射的电子在20～100千伏加速龟压作用下，经聚光镜聚焦成束，投射到很薄的标本上，并与标本中各种原子的核外电子发生碰撞，造成电子散射，在细胞质量和密度较大的部位，电子散射度强，成像较暗。在质量、密度较小处电子散射弱，成像较亮，结果在荧光屏上形成与细胞结构相应的黑白图像。
(二)主要结构 电子显微镜由电子光学系统、真空系统和供电系统三大部分组成(图17一l，图17—2)。
1．电子光学系统是电镜的主体，对成像和像的质量起着决定性作用。它是由电子枪、聚光镜、样品室、物镜、中间镜、投影镜、观察室和照像室等部分构成。
2．真空系统主要是使镜筒内保持高度真空，一般要求达到10-4托（1托=lmmHg），是通过机械泵和油扩散泵接力排气及真空垫圈的密封作用来实现的。真空度可由真空表指示。由于电镜利用高速电子束为照明源，裁要求在电子束的通道上不能有游离气体存在，以免与气体分子碰撞引起电离、放电、电子散射、灯丝氧化、样品被污染等而影响观察效果或发生故障。
3．供电系统主要是提供稳定的电源，包括高压系统电源、各透镜的电源及真空泵的电源等。
(三)透射电镜生物标本超薄切片的制备(以家兔肝脏为例)。
1．取材 取活兔用乙醚麻醉，迅速打开腹腔，暴露肝脏，用锋利的刀片切取lmm3肝组织，立即投入固定液中。取材要求迅速，通常将动物麻醉取材。如动物处死后取材，要在几分钟内完成。取材最好在低温条件下进行(0～4℃)，以防止动物死后细胞缺氧发生超微结构变化。
图17—1 透射电镜结构
2．固定 把肝组织立即投入到0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液配制的2.5％戊二醛中，4℃固定二小时(也可用0.1mol／L(pH7.4)的磷酸缓冲液配制的2.5％戊二醛)。然后用0.1mol／L(pH7.4)的二甲砷酸钠缓冲液洗三次，再放入用相同缓冲液配制的1％锇酸中固定2小时(4℃)。固定的作用是用化学试剂使细胞的微细结构如同生前状态精确地保存下来。固定剂应能迅速进入细胞，稳定细胞结构，使其不变形，在脱水过程中不丢失细胞成分。
3．脱水 用双蒸水清洗固定好的肝脏标本，按顺序投入到30％、50％、70％的乙醇中，在4℃条件下各lO分钟．然后再投入到80％、90％、95％的丙酮中各10分钟，100％的丙酮中两次，每次10分钟，一般可在室温下进行(如实验需中途停顿可把标本放在70％乙醇中过夜)。脱水的目的是用脱水剂，把组织细胞内的游离水去除干净，使包埋剂能够均匀地渗入细胞内。
4．浸透 把标本由100％丙酮中移入装有混匀包埋剂的小瓶中，在30℃下震荡4小时(可用红外线灯加温促进浸透)使包埋剂置换出标本中的丙酮。电镜生物标本常用环氧树脂作包埋剂，聚合后可切成超薄切片，并耐电子束轰击。
5．包埋 把标本放入胶囊底部，将混匀的包埋剂分装入胶囊中，加好标签，勿使倾倒保持直立。
6．聚合 把装有标本和包埋剂的胶囊置35℃、45℃、60℃温箱中各24小时，使包埋剂聚合，硬化，由流体变为均匀的固体。这样在切片时，包埋在其内的肝组织才能保持结构不变。
7．超薄切片 一般透射电镜的切片厚度不能超过100nm，厚于100nm的切片电子束不能穿透或影响观察效果。通常超薄切片厚度为50～70nm。在切片前，要对标本包埋块顶端修成近45℃角的四边锥体，使要进行切片的标本露出外表面，呈长宽约为0.4×0.6mm的长方形或梯形切面。然后再把标本块夹在标本夹中，并把它固定在切片机臂的远端。切片刀是用玻璃制成(也可用钻石刀)，甩胶布围成水槽，装满水，切下的切片漂在水面，用铜网收集。切片的厚度可以从切片与水面反射光所产生的干涉色来判断。
目前公认的树脂包埋切片厚度与干涉色关系如下：
8．超薄切片机的操作(示教)
9．染色 在平皿中放一腊纸片，滴一滴醋酸铀染液于腊纸上，用弯头小镊子夹住铜网边缘，把贴有切片的一面朝下，轻轻插入染液中，盖上平皿盖，室温下染色10～20分钟。水洗后同上法再置入柠檬酸铅染液中染色15分钟，1％NaOH溶液洗一次，水洗二次，干燥后观察。染色的原理是利用重金属(如铅、铀等)与组织中某些成分结合，可提高这些组分对电子的散射能力，增进超薄切片中不同组织成分对电子散射的差异，使细胞的超微结构得到充分表现，形成与细胞结构相应的图像，并提高图像反差，也称电子染色。
(四)观察家兔肝细胞的超微结构
1．电镜操作(示范)
2．肝细胞的结构 肝细胞为多角形，一侧靠近血窦。核圆形1～2个，位于细胞中央，核仁1～2个。细胞质中有各种细胞器，粗面内质网的膜平行排列，聚集在一起。滑面内质网为分支弯曲的囊管组成，互相吻合成网，排列密集。高尔基复合体排列在核的周围。还可见到溶酶体、过氧化物体、糖原、脂滴、分泌颗粒等。
二、扫描电子显微镜的标本制备和观察
(一)原理 电子枪发射出的热电子，在加速电压作用下，形成高速电子流，经聚光镜和物镜的作用形成一极细的电子束，扫描于标本表面。入射电子与标本中的原子相互作用产生二次电子，二次电子的数量和每个电子的能量随标本表面形状及元素成分的不同而变化。二次电子被接收并经过放大，即可在荧光屏上显现出被放大的标本表面图像。
(二)扫描电镜的构成(图17—2)
(三)扫描电镜标本制备(以家兔支气管为例)
1．取材 麻醉家兔，解剖暴露支气管，用刃器切取小段支气管，剖开，再切取2×5mm大小的一块管壁，保护要观察的内表面(即粘膜面)，并用缓冲液或生理盐水清洗二次。如粘膜表面有较多粘液时，可用胰酶溶液消化，再清洗。
2．固定 把标本迅速投入固定液中，其固定程序与透射电镜标本同。
3．导电处理 把经锇酸固定的标本清洗后放入2％单宁酸中处理10分钟，再用双蒸水清洗3次，然后放入l％锇酸中处理30分钟。
4．脱水 把用双蒸水洗过的标本依次放入30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％乙醇中脱水各lO分钟，然后将标本移入乙酸异戊酯中，置换出乙醇。
5．临界点干燥 将标本置入临界点千燥器的密闭标本室中，打开进气阀门，充入液
图17—2 扫描电子显微镜构造原理及主要部件
体CO2，其量不少于标本室容积的2／3。关闭开关，并升温使达到临界状态(31.4℃,72.8大气压)，此时液态与气态界面消失。加温过程中温度可达40℃，标本室内压力可达80～120大气压，然后缓慢放气，放气时间不应少于2小时。
临界点干燥是扫描电镜标本制备的一种重要干燥方法，它能消除表面张力，使标本在干燥过程中不损伤、不变形。
6．镀膜 把干燥的标本用导电胶固定在标本台上(注意观察面向上)，把标本台放在离子镀膜机阳极载台上，在低真空下(0.1Torr)加高电压(1000～1200伏)使阴极(金靶)与阳极间形成电场，把残存的气体分子电离，阳离子打向金靶，金原子溅射出来落在标本表面，形成一层金膜。这不仅保存了组织表面形态，而且电子束射到标本上容易激发二次电子，并有良好的导电性能，可产生质量好的图像。
(四)观察支气管纤毛上皮的表面立体超微结构
1．扫描电镜操作(示范)
2．支气管纤毛上皮表面结构 支气管粘膜表面有许多纤毛，纤毛排列密集，是由纤毛细胞顶端发出的，在纤毛间可见有杯状细胞，在杯状细胞的表面有长短不一的微绒毛。
(陈兴 编)
实验十八 整装培养细胞生物膜系统的光镜和透射电镜标本制备及观察
实 验 目 的
在相差显微镜和透射电子显微镜下，观察整装培养细胞中生物膜系统的结均和分布。
实 验 用 品
一、材料和标本 非洲绿猴肾上皮细胞（CV-1）。
二、器材和仪器 普通显微镜、相差显微镜、透射电子显微镜、镍网、载玻片、盖玻片、直径5cm培养皿、CO2培养箱。
三、试剂 高锰酸钾固定液、10μg/ml秋水仙素、PBS(Ph7.4)、0.5％Formvar液。
实 验 内 容
一、原理
本室宋今丹教授于1984年研制出一种新的高锰酸钾固定液，用以固定整装培养细胞。该固定液能除掉细胞内的蛋白质成份，而保留膜的脂类成分，其结果，细胞骨架和细胞内可溶性蛋白质等被去除，增加了标本的透明度，同时内质网、线粒体、高尔基体、溶酶体等生物膜系统被完整地保存下来。高锰酸钾固定剂在固定标本的过程中，能形成二氧化锰，可在细胞的各种膜结构的脂类亲水端形成微细的沉淀，结果标本不需染色，即能在相差显微镜和透射电镜下清晰地显示细胞生物膜系统全貌。
二、方法
（一）高锰酸钾固定法显示用药(秋水仙素处理)前后CV一1细胞生物膜系统光镜标本的制备及观察。
1．取无菌盖玻片，分别放入二个直径5cm的培养皿中，接种CV一1细胞，加3ml培养基。加盖做好标记，移入CO2培养箱培养24小时。其中一个培养皿在终止培养前4小时，加入10μg／ml秋水仙素0.3ml。在倒置显微镜下观察选定长有铺展良好细胞的盖玻片，终止培养，倒掉培养液。
2．PBS液冲洗盖玻片二次，清除细胞表面的培养基和杂质。
3．取出盖玻片，将长有铺展良好细胞的盖玻片，细胞面朝上放在载片上。
4．滴新配制的高锰酸钾固定剂于盖玻片上，固定10分钟。
5．蒸馏水轻轻地冲洗标本的细胞面5次，去除残留固定液。
6．取下盖玻片，用滤纸吸干多余水份，滴1滴PBS液于载玻片上，将盖玻片附有细胞面朝下，装片。
(二)高锰酸钾固定液显示用药(秋水仙素处理)前后CV—l细胞生物膜系统电镜标本的制备及观察。
1．用0.5％Formvar液制做支持膜。将覆有Formvar膜的镍网经紫外线灯灭菌后，放入直径5cm的无菌培养皿中。加培养基3m1。
2．接种CV一1细胞于铺有支持膜的镍网上，一组是不经药物处理的作为对照组，另一组是经lOμg／ml秋水仙素处理的作为实验组。实验组的培养细胞在终止培养前4小时加入10μg／m|秋水仙素0.3ml，放入CO2培养箱中进行细胞培养。
3．待细胞铺展开后，取出镍网，用乳头吸管滴1滴高锰酸钾固定液于镍网上，固定细胞10分钟。
4．经上升梯度乙醇系列脱水：30％→50％→70％→85％→90％→95％→100％，每次脱水3分钟。
5．待镍网晾干后，在透射电子显微镜下(75KV电压)进行观察。
三、结果
在光镜下和透射电子显微镜下，内质网呈网状铺展于整个细胞质内。细胞核周围的内质网形成较稠密三维结构，远离细胞核周围的内质网则呈松散的网状伸展至细胞边缘。在电镜下可见内质网由细管和扁囊构成。除内质网外，还可看到粗大的呈条索状的线粒体，也可观察到高尔基器和溶酶体等膜性结构。
CV一1细胞经秋水仙素处理后，其内质网向细胞核周围聚集，细胞边缘区域不再观察到内质网。秋水仙素破坏微管结构，因此，内质网的分布可能与微管的存在有密切关系。
作 业
l．为什么经高锰酸钾固定液固定的整装培养细胞可以观察生物膜系统?
2．为什么高锰酸钾固定液固定细胞后，细胞不经染色便可在电镜下进行观察?
3．CV一1细胞在秋水仙素处理后其生物膜系统的分布有何变化?请谈谈你的看法。
附：镍网Formvar(聚乙烯醇缩甲醛)膜制备
1．将载玻片插入0.5％Formvar的氯仿溶液中，抽出。待干燥后．用刀片在玻片的四周切割Formvar膜。
2．将玻片插入水中，使膜在水面上浮起。
3．将载网安放在支持膜上，用盖玻片贴附捞取之。
4．将带有支持膜的载网置于培养皿内干燥。
（黄集前编）
实验十九者 免疫荧光抗体法检查细胞表面抗原
实 验 目 的
了解特异性免疫荧光抗体反应的一般过程及其在细胞学研究中的应用。
实 验 用 品
一、材料和标本 人体结肠癌培养细胞、HeLa细胞、小鼠抗人结肠癌细胞抗体(第一抗体)、荧光标记羊抗鼠抗体（第二抗体）。
二、器材和仪器 盖片、载片、培养瓶、培养皿、滤纸、镊子、吸管、普通倒置显微镜，荧光显微镜、微量加样器。
三、试剂 1640培养液(加lO％小牛血清)、甲醛固定液、0.01mol/L PBS(Ph7.2)、液体石蜡。
实 验 内 容
一、原理和意义
用人结肠癌细胞为免疫原，免疫小鼠，制得鼠抗人结肠癌细胞表面抗原(Ag)的单克隆抗体 IgG(第一抗体)，二者可以发生特异性的抗原抗体反应，形成抗原抗体复合物，再加入市售(也可自制)的荧光标记的羊抗鼠IgG抗体(第二抗体)，可以与复合物进一步发生抗原抗体反应(二次抗体反应)，这样就可以在荧光显微镜下观察到这种抗原在结肠癌细胞表面的存在(图19—1)。
图19一l 特异性一次、二次抗原抗体反应过程
二、方法
1．将培养瓶中的结肠癌细胞接种到装有盖片的培养皿中，培养2～3天。
2．在倒置镜下观察到盖片上的细胞生长状态良好后，在盖片左上角用玻璃笔做一下标记，以免在以后的操作中正反面颠倒。
3．将盖片放在甲醛固定液中，4℃固定5~10分钟。
4．用PBS洗三次，注意不要将PBS液直接倒在盖片的细胞面，以免引起细胞大量丢失。用滤纸片将盖片上的PBS轻轻吸干，不要损伤细胞层。
5．将已稀释好的小鼠抗体滴在盖片上．每个盖片50μl，37℃温育30分钟。
6．用PBS洗三次，滤纸吸干。
7．将已稀释好的荧光标记羊抗鼠二次抗体5μl滴加在盖片上，37℃温育30分钟。
8．用PBS洗三次，滤纸吸干。
9．将载片上滴一滴液体石蜡。然后将盖片细胞面朝下放到载玻片上，在荧光显微镜下观察。
三、结果
细胞多成团块状存在，细胞膜表面显示黄绿色荧光，细胞内及背景均不发光。每组应设立一个阴性对照组，以培养的HeLa细胞为抗原，操作步骤相同。
作 业
1．三次用PBS清洗的目的各是什么？
2．为排除荧光标记的羊抗鼠抗体直接与人结肠癌细胞表面某种抗原发生反应的可能性，你认为还应设立什么样的对照组?
(黄东阳编)
实验二十 姊妹染色单体互换(SCE)标本制备与分析
实 验 目 的
掌握人外周血淋巴细胞姊妹染色单体互换标本的制备及交换频率的计算
实 验 用 品
一、材料和标本 人外周血
二、器材和仪器 30W紫外灯、恒温水浴箱、培养皿、擦镜纸、其它同人体外周血培养。
三、试剂 200μg／mlBrdU溶液、2×SSC溶液、Giemsa染液、pH6.8PBS
实 验 内 容
一、原理
5一溴脱氧尿嘧啶核苷(5一Bromodeoxyuridinc简称BrdU)是胸腺嘧啶核苷的类似物。人体淋巴细胞在含有BrdU的培养液中进行DNA复制时，BrdU可专一替代胸腺嘧啶核苷，而掺入到新复制的DNA核苷酸链中。因此只要通过两个复制周期，就可使姊妹染色单体中一条单体的DNA链中，有一股链是掺入BrdU的，而另一条单体的DNA双链，两股链全掺入BrdU。由于双股都含有BrdU的DNA分子构形有变化，使这条染色单体对某些染色剂的亲合力降低，用Giemsa染液染色时就可清楚看到双股都含BrdU的DNA链所组成的单体着色浅，而另一条单体着色深。这样就可利用这一技术检查同一染色体的两条姊妹染色单体互换(SCE)的情况。现已证明，许多致突变剂和致癌物质可诱发姊妹染色单体互换和诱发染色体断裂、重排。对这些因素SCE要比染色体畸变敏感的多。因而检测姊妹染色单体交换频率是检查致癌和致突变剂的细胞生物学效应的一种新方法，它具有灵敏、准确、简便快速的优点。
二、方法
1．培养液的制备、采血、培养等操作同常规染色体的制备。(见常规染色体标本制备方法)
2．在外周血培养24小时加入BrdU溶液0.2毫升，使终浓度为每毫升培养液含8微克。加入BrdU后，用黑纸包褒培养瓶，置37℃温箱中继续培养48小时。
3．秋水仙素处理方法同前(见染色体标本的制备)。
4．按常规方法收集细胞、固定、低渗、制片，并将标本片置37℃温箱中烘片24小时。
5．将标本面朝上平放于染色槽中，然后加入2×SSC溶液，以溶液不超过标本表面为度。然后在标本上复盖一张比标本稍大的擦镜纸，使纸边垂到2XSSC溶液中，用以保持标本湿润。
6．将染色槽置55℃恒温水浴箱中温育，上用30W紫外灯垂直照标本30分钟，灯距标本距离约为lOcm。照射后轻轻取掉擦镜纸，立即用蒸馏水冲洗标本。(水温为40℃左右)。
7．用Giemsa染液(原液用pH6.8磷酸缓冲液l: 10配制)，染色5～10分钟左右，用自来水冲洗，空气干燥后镜检。
三、姊妹染色单体互换的镜检分析及频率计算
在正常或异常情况下，姊妹染色单体互换的频率不同。根据上述标本染色单体的明显色差不同，通过计数可较准确检测姊妹染色单体之间的互换频率。
选取染色体分散良好，两条姊妹染色单体染成一深一浅的中期相，凡发生有姊妹染色单体互换的染色体，可见在深染的染色单体上出现浅染的片段。对在染色体端部出现的互换计为一次(一个SCE)；对在染色单体中间出现的互换计为两次(2个SCE)；对在着丝粒部位的，经判明不是两条染色单体发生扭转者，计为一次(1个SCE)。
计数30个中期分裂相的SCE后，计算SCE的频率。
SCE频率=n个中期相SCE之和/n个细胞
中国人正常SCE频率为5.7±0.4
(陈兴 编)
实验二十一 银染核仁形成区的光镜和电镜标本制备及观察
实 验 目 的
通过银染核仁形成区标本制备和观察，了解细胞在不同时相中银染核仁形成区的显微和亚显微的形态特征。
实 验 用 品
一、材料和标本 人外周血淋巴细胞核型标本、HL一60细胞、HeLa细胞。
二、器材和仪器 显微镜、电子显微镜、超薄切片机、水浴箱、离心机、天平、染色缸、平皿、乳头吸管、离心管、擦镜纸。
三、试剂 Carnoy固定液(用时现配)、5N HCl、0.1％甲酸、l％甲酸、50％AgNO3(用时现配)、2％蛋白胶、5％硫代硫酸钠、2.5％戊二醛、30％～100％梯度乙醇和丙酮、Epon一812包埋剂、醋酸铀和柠檬酸铅染液、蒸馏水。
实 验 内 容
一、原理和意义
在细胞分裂中期核型中，人的端着丝粒染色体短臂区和在间期细胞核的核仁中有与银离子特异亲合物质，通过银染可以显示它们的致量，因此一直被人们所关注。近年来发现，虽然人的端着丝粒染色体短臂是28S、18S、和5.8S rRNA基因存在部位，称核仁形成区(Nucleolar organizer region，NOR)，但银染的物质不是rDNA和rRNA，而是与活性的rDNA转录有关的一类酸性蛋白质，容易将Ag＋还原为Ag的颗粒，从而在核仁形成区镀上银、呈棕黑色，称为银染核仁形成区(Silver—Staining nucleolar organizer region，Ag—NOR)。生化和免疫化学研究证明银染蛋白是RNA聚合酶I，其功能是催化rDNA转录rRNA形成核仁，因此通过这种反应能够特异显示rRNA转录的活性。
由于银染核仁形成区方法简便、特异性强，目前在遗传、肿瘤、药物毒理及预防医学等细胞生物学研究中，均有广泛应用。特别是电镜银染活性核仁形成区技术，可以在同一个细胞中显示银染蛋白、活性rDNA和rRNA三者间关系，并在亚细胞水平进行分析。
二、方法
(一)中期染色体核仁形成区的银染和观察
1．取制备好的正常或肿瘤细胞染色体标本，直接放入装有5N HCl溶液中，常温处理5分钟。
2．用自来水反复冲洗几次，甩干，标本面朝上平放在平皿中。
3．将0.1％甲酸临用前配制的50％AgNO，溶液约0.5ml,用吸管滴在标本上，再盖上二片擦镜纸。
4．放置平皿于56℃水浴中处理3～5分钟，待擦镜纸呈棕色后，取出标本用水冲洗、气干。
5．镜检
镜下所见标本背景浅黄色，核型深染，端着丝粒染色体的银染蛋白存在的部位呈棕黑色颗粒，选择染色体分散良好，银染颗粒清楚的分裂相，进行计数单侧或双侧有银染颗粒的染色体数。
人体细胞银染颗粒有遗传稳定性，一般正常值为4～8个／核型。
计算方法
NOR 均值=N个核型中含NOR染色体数的和/N个核型
(二)间期细胞核活性核仁形成区的银染与观察
1．收集培养的HL—60细胞和用PHA转化的人正常外周血淋巴细胞分别于离心管中，用1000rpm离心5分钟后弃上清。
2．用吸管吸打或用指弹法使细胞悬浮，然后用Carnoy固定液固定30分钟。
3．以1000rpm离心5分钟，弃上清剩约0.5～0.1ml液体，使细胞悬浮后滴片。
4．37℃干燥24小时
5．银染(程序同前)
6．镜检
镜下所见，细胞核着色而细胞质不着色，核中活性核仁形成区银染颗粒呈棕黑色，成簇聚集，清晰可分。肿瘤细胞中与正常细胞中的银染颗粒数量、可见有明显差异。
(三)间期细胞核银染活性核仁形成区电镜标本制备与观察
1．收集培养的HL--60细胞或HeLa细胞于离心管中，随后加入2.5％戊二醛1ml预固定10分钟。
2．以1000rpm离心10分钟，弃上清后加入Carnoy固定液固定5分钟。
3．接着以2500rpm离心lO分钟，弃净上清并用吸水纸吸干残余液体，用耳勺取出细胞团块放于小平皿中。
4．100％乙醇→双蒸水梯度复水，每步5分钟。
5．然后将细胞团切成约1mm3大小的块。
6．将50％AgN03(用蒸馏水配制)—2％蛋白胶(用1％甲酸配制)2:1混合液2～3ml，加入有细胞团块的小平皿中。
7．移置平皿于56℃水浴中处理20分钟。
8．彻底水洗3次，每次2～3分钟。
9．水洗后5％硫代硫酸钠室温处理lO分钟。
10．再水洗3次，转入乙醇一丙酮梯度脱水，每步5分钟。
11．Epon812包埋。
12．超簿切片直接地或再经醋酸铀和柠檬酸铅复染后，在电镜下观察。
（11、12步骤具体操作见实验七有关部分）
镜下所见，经铀、铅复染的标本，细胞核中电子密度大的是核仁纤维中心(Fibrillar Centre,FC)和致密纤维成分(Dense fibrillar component，DFC)它们是银染蛋白和正在转录的rRNA基因存在的部位；周围电子密度均匀，着色浅的为rRNA前体和核糖体大、小亚单位存在的颗粒成分(Granular component，GC)。
超薄切片不经铀、铅复染，直接在透射电镜下观察，显示银染蛋白颗粒只存在于FC和DFC中，在周围GC中很少存在。
作 业
1．计数30个核型，求出该种细胞银染NOR颗粒数均值。
2．间期的肿瘤细胞和正常细胞的核仁中，银染颗粒数量有无差异?说明什么？
3．银染NOR的超薄切片直接电镜下观察，显示银染蛋白颗粒特异的存在于FC和 DFC中，在周围GC中很少存在说明什么?
（谢荣林 编）
实验二十二 染色体扫描电镜标本制备及观察
实 验 目 的
了解扫描电镜观察染色体的方法及标本制备过程。
实 验 用 品
一、材料和标本 光镜观察过的染色体标本片。
二、器材和仪器 S一450扫描电镜、IB一3离子镀膜机。
三、试剂 2.5％戊二醛、0.1mol／L(pH7.4)PBS、l％锇酸、2％单宁酸、30％、50％、70％、80％、90％、100％乙醇溶液。
实 验 内 容
一、原理
扫描电镜用于观察标本的表面形态。用戊二醛和锇酸处理的染色体标本，经单宁酸(或硫卡巴肼)还原可获得较好的导电染色效果。在扫描电镜下可观察到染色体的三维结构，也可用于常规染色体核型、G带染色体核型、高分辨染色体核型的分析及染色体结构异常识别，以弥补光镜的许多不足。在扫描电镜下还可清楚地观察到肿瘤细胞癌基因扩增结构—双微体。因而此方法广泛用于细胞生物学和遗传学的许多研究。
二、染色体标本制备的方法
1．常规染色体标本制备，同实验十。
2．取一张在光镜下观察过的染色体标本片选择分散良好的分裂相，并在背面做出标记以便电镜观察时易于寻找。
3．3:1甲醇一冰乙酸脱色，用磷酸缓冲液洗。
4．2.5％戊二醛固定30分钟。
5．0.1mol／L(pH7.4)PBS漂洗3次。
6．1％锇酸固定5分钟。
7．蒸馏水洗3次。
8．2％单宁酸处理5分钟。
9．蒸馏水洗3次。
10．1％锇酸处理lO分钟。
11．水洗3次。
12．30％→100％乙醇逐级脱水，每级5分钟。
13．临界点干燥(也可用空气干燥)。
14．把标本片标记的核型所在处用玻璃切下约5×5mm2，用导电胶固定在标本台上。
15．离子镀膜(也可不镀膜直接观察)。
16．扫描电镜观察、照相。
三、染色体形态观察
低倍观察可见染色体的不同分裂相，在分散较好的分裂相中，染色体呈三维立体形态。
高倍观察染色体呈长短不等的园柱状，两条单体由着丝粒相连，其表面凹凸不平，沿纵轴有许多环形沟把染色体分成许多节段。可见染色体表面由许多细纤维构成。
(陈兴 编)
实验二十三 细胞显微摄影
实 验 目 的
了解生物显微摄影的基本原理和装置，以及照相暗室工作的基本过程。
实 验 用 品
一、材料和标本 人类染色体标本，其它染色的生物标本片。
二、器材和仪器 显微镜、35毫米照像机、显微照明装置、自动曝光控制器、ASAl00黑白135胶卷、洗印和放大等成套的暗室设备。
三、试剂 D一72式普通显影液、SB-1式停影剂、F一5酸性定影液
实 验 内 容
一、原理
生物显微摄影(Microphotography)是利用摄影装置来拍摄显微镜视野中所观察到的物像。在生物医学方面，主要用于对正常细胞或病变细胞的显微形态学研究记录。
二、操作步骤
(一)拍摄前准备
1．光路合轴 使光轴与光束处于同一轴线上。
2．柯勒氏照明 使观察的视野获碍均匀而又充分的照明；防止杂散光对照相系统产生影响；使被摄物体不受热，影象清晰。
3．物镜与目镜合理组合 依标本的不同和显微摄影要求，物镜与目镜的组合有一定规范，如：拍摄人类染色体影像，采用高分辨率的100倍油镜，配合10倍目镜，可获得良好分辨的理想放大影像。
4．调整视场光阑和孔径光阑 使两者与所用物镜的数值孔径(N．A．镜口率)相等，所得的分辨力最高；视场光阑一旦调好，不要再动，而孔径光阑可随物镜数值孔径的更换，做相应的调整。一般来说，把孔径光阑的大小调成等于相应该物镜孔径像的2／3为宜，尽管丧失了少许的分辨力，却能提高影像的反差、焦点深度和清晰度。
总之，上述作法是调整显微镜至最佳状态。
(二)拍摄程序
拍摄是显微摄影系列操作中的关键环节，在镜检观察中，发现需要摄下的影像应即时拍照。
1．开启相机后盖，安装胶卷于照相机内。
2．打开显微镜照明装置的电源开关，将亮度调至适当。
3．依个人的视力，调整摄影目镜调焦环至“井”字线清晰。
4．放一片需要拍摄的标本载玻片于载物台上。在低倍镜下选好要拍摄的核型或细胞结构，再转换到油镜下，聚焦标本细节，准备拍照。
5．按下曝光按钮，曝光按钮亮表示曝光开始进行，熄灭表示曝光完毕。
6．按下列项目进行拍摄记录：
编号_______________单 位_______________
课题_______________负责人_______________
倍数_______________条 件_______________
日期_______________显微镜型号_______________
(三)黑白胶片的冲印
感光胶片在拍摄完毕后，需尽快在暗室中冲洗和晒印，其方法和普通照像相似。其基本原理是显影液使胶片已感光的银盐潜影还原为可见的金属银影像；停影液使显影液失去显影能力，防止显影过度与斑痕出现；定影液把未被还原的卤化银溶去，晾干是便于胶片和相纸保存。
1．冲印的操作步骤
(1)把胶片装入显影罐中(切勿粘在一起)先用清水冲洗，排除气泡．然后再把水倒掉，这有利于显影液的快速均一作用。
(2)从顶部罐口注入预先配好的约250ml D-72式显影液。20℃显影4～12分钟。
(3)显影中轻轻摇影罐，使胶片表面充分受显影液作用，显影完毕，迅速倒出显影液。
(4)立即注入250ml预先配好的SB—I式停影液，停显时间为10秒，倒出停影液，随之加入250ml的F一5式酸性坚膜定影液，20℃定影15分钟。取出胶片流水冲洗30分钟以上。
(5)将胶片挂起，用脱脂棉轻轻吸掉胶片表面过多的积水，晾干。
(6)晾干后用放大机的胶片夹子夹住胶片，药膜面朝下，聚焦取景，然后在红灯条件下，用压纸板压住所需号放大像纸，药膜面向上．进行曝光(适当的曝光时间要经试验后决定)。
(7)曝光后的像纸，浸入D-72显影液中，然后用竹镊子不时地夹住像纸翻动，直到显影适度为止。
(8)显影合适后立即移到SB-I式停影液中，漂洗10～20秒，再浸入定影液中处理15分钟，取出在流水中冲洗60分钟左右。
(9)水洗后，放在电热上光机上烘干；裁边，装入有说明的纸袋内保存。
三、结果
照片上可见染色体或细胞内结构细节清晰，反差适中。
作 用
在细胞显微摄影中，欲拍出标本结构细节清晰，层次分明，反差适中的照片，应注意哪些因素?
(刘冬杰 编)
附一 离心机转数与离心力的换算表
r为离心机转轴中心与离心套管底部内壁的距离；rpm(revolution per minute)为离心机每分钟的转数；RCF(relative eentrifugal force)为相对离心力，以地心引力，即重力加速度的倍数来表示，一般用g表示。
利用下表，已知离心机r和g就可求出rpm；反之，r和rpm已知，也可求出g。例如，在r标尺上取已知的r半径值和在g标尺上取已知相对离心力值，这两点间线的沿长线在rpm标尺的交叉点即为rpm。
注意，若已知的g值处于g标尺的右边，则应读取rpm标尺的右边数值，否则反之。g和rpm也可通过下边公式来换算：
RCF=1.119×105×rx(rpm)2
附二 溶液的配制
一、常规溶液
(一)1/15mol/L PBS(磷酸缓冲液Phosphate Buffer Solution，PBS)
甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液
Na2HPO4 9.465g
蒸馏水 加至1000ml
乙液：l/15mol/L KH2PO4溶液
KH2P04 9.07g
蒸馏水 加至1000m1
分装在棕色瓶内，于4℃冰箱中保存，用时甲、乙两液各按不同比例混合，即可得所需pH的缓冲液,见下表:
(二)0.3％台盼兰染液
称取台盼兰(Trypan blue)粉0.3克，溶于100ml生理盐水中，加热使之完全溶解，用滤纸过滤除渣，装入瓶内室温保存。
(三)0.5％酚红指示剂
酚红 0.5g
0.1N(0.4％)NaOH 15ml
双蒸水 85ml
将0.5克酚红置研钵中，缓漫滴加0.1NNaOH溶液边加边磨，并不断吸出已溶解的酚红液，直至全部溶解，然后加入85ml双蒸水，颜色为深红，经粗滤纸过滤后使用，室温保存。
(四)5.6％NaHCO3溶液
称NaHCO35.6克，溶于100ml蒸馏水中，室温保存即可(如需要也可10磅15分钟高压灭菌，4℃冰箱保存)
(五)10μg／ml秋水仙素
秋水仙素 lOmg
生理盐水 100ml
装入茶色瓶中，为贮备液，4℃冰箱中保存。甩时取贮备液1ml加生理盐水9ml即可。
(六)0.4％KCl-0.4％柠檬酸钠低渗液
将0.4％KCl和0.4％柠檬酸钠两液等量混合即可，室温保存。
(七)2％柠檬酸钠
称取柠檬酸钠2克，加100ml双蒸水即可，室温保存。
（八）0.2％次甲基兰染液
称次甲基兰(Methylene blue)0.2克，加蒸馏水100ml，室温保存。
(九)0.5％醋酸洋红(Aceio Carmine)染液
洋红 lg
醋酸 90ml
蒸馏水 110ml
将90ml醋酸加入110ml蒸馏水煮沸，然后将火焰移去，立即加入1克洋红，使之迅速冷却过滤，加饱和氢氧化铁(媒染剂)水溶液数滴，直到呈葡萄酒色。室温保存。加铁使洋红沉淀于组织而着色。此染液室温存放时间越长效果越好，室温保存。
(十)1％甲苯胺兰(Toluidine blue)
称取甲苯胺兰1克，加蒸馏水lOOml。
(十一)1/3000中性红染液
取中性红(Neutral red)0.1克，加蒸馏水300ml。室温保存。
(十二)Giemsa染液
1．贮备液
Giemsa粉 1g
纯甘油 66ml
甲醇 66ml
先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油，充分研磨，呈无颗粒的糊状。再将全部甘油加入，放入56℃温箱中2小时，然后加入甲醇，保存于茶色瓶中。一般两周后使用为好。
2．工作液
临用时将贮备液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合。
(十三)埃利希(Ehrlich)苏木精染液
苏木精 1.0g
乙醇 50ml
醋酸 5ml
甘油 50ml
硫酸铝钾 5g
蒸馏水 50ml
将苏木精溶于少量的乙醇中，再加醋酸并搅拌，以加速其溶解。当苏木精溶解后将甘油加入并摇动容器，同时加入其余的乙醇；硫酸铝钾需研磨并加热，然后溶解于蒸馏水中，将其一滴滴地加入上边的溶液，并不断摇动，此液配好后，将瓶口用纱布盖好，置通风处，经常摇动以加速其成熟，成熟约需4周左右，成熟的染液为深红色。
二、细胞化学和细胞组分分离溶液
(一)M一缓冲液
眯唑(Imidazole) 3.404g
KCI 3.7g
MgCl2·6H2O 101.65mg
ECTA 380.35mg
EDTA 29.224mg
巯基乙醇 0.07ml
甘油 297ml
蒸馏水 加至1000ml
用lNHCl调pH至7.2室温保存。
(二)2％Triton X一100溶液
量取2mlTriton X一100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
（三）0.2％考马斯亮兰R-250染液
甲醇 46.5ml
醋酸 7.0ml
考马斯亮兰 0.2g
蒸馏水 加至100ml
(四)A．0.1％碱性固绿染液(pH8.0～8.5)
1．0.1％固绿水溶液
固绿(Fast green) 0.1g
蒸馏水 100ml
2．0.05％Na2C03溶液
Na2C03 50mg
蒸馏水 100ml
用时按1:1体积混合即可。
B．0.1％酸性固绿染液(pH2.2)
1．0.1％固绿水溶液。
2．mol／L×75盐酸液
盐酸(比重1.19)0.109ml加蒸馏水至100ml
用时按l:1混合。
(五)甲基绿一哌咯宁染液
1.1mol／L醋酸缓冲液(pH4.8)：
(1)醋酸 17ml
蒸馏水 加至200ml
(2)醋酸水 13.5g
蒸馏水 加至lOOml
用时分别取两液40ml、60ml混匀即可。
2．甲基绿一哌咯宁(methyl green—Pyrcnln)
5％哌咯宁水溶液 6ml
2％甲基绿水溶液 6ml
蒸馏水 16ml
lmol/L醋酸缓冲液 16ml
lmol/L醋酸缓冲液临用时才可加入染液中。
(六)Schiff试剂
将碱性品红0.5克加入lOOml沸水，持续煮沸5分钟，并随时搅拌，待冷却到50℃时过滤到棕色瓶中，加1N HC11O毫升，冷却至25℃时加入1克NaHSO3，此时需很好的振荡，避光过夜。次日取出(呈淡黄色)加0.25克活性炭剧烈振荡1分钟。过滤后即得Schiff试剂。避光低温保存。
(七)联苯胺混合液
联苯胺(4.4 Diamino benzidine) 0.2g
95％乙醇 lOOml
3％过氧化氢 2滴
此液临用时配制。
(八)l％番红水溶液
番红(Safranin) 1.0g
蒸馏水 100ml
(九)1％SDS(十二烷基硫酸钠Sodium dodecyl sulfate,SDS)
SDS 10g
45％乙醇 100ml
(十)1mol／LTris(三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液Trihydroxy methylaminomethane Tris/HCL)pH7.8
Tris 12.114g
蒸馏水 lOOml
先将Tris溶于少量蒸馏水，用HCI调pH至7.8，然后加水至100ml
(十一)Ringer Solution
氯化钠(冷血动物用0．65克) 0.9克
氯化钾 0.042克
氯化钙 0.025克
蒸馏水 100ml
(十二)淀粉肉汤培养基
蛋白 2g
淀粉 6g
牛肉汤 100ml
用10％NaHCO3调pH至7.0～7.2
(十三)0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液
蔗糖 85.5g
氯化钙 0.33g
蒸馏水 1000ml
(十四)1％詹纳斯绿B染液
取詹纳斯绿(Janus green B)1.0g Ringer氏液100ml
(十五)1％刚果红染液
刚果红 1g
蒸馏水 100ml
(十六)Gomori硝酸铅作用液
0.05mol／L醋酸缓冲液(pH5) lOOml
0.6醋酸加蒸馏水200ml、取其 42ml
醋酸钠1.36g加蒸馏水200ml，取其158ml共200ml
B-甘油磷酸钠 2g
醋酸铅 2g
5％氯化镁 5ml
以上作用液在临用时配制，最终在pH5～5.2，过滤使用。
(王世藩 汇编)
三、细胞培养和细胞融合溶液
(一)0.01mol／LPBS(磷酸盐缓冲液Phosphate Buffer Saline，PBS)pH7.2。
0.2mol／L磷酸氢二钠液(甲液)：
NaH2PO4·12H2O 35.814g
双蒸水 加至500ml
0.2mol／L磷酸二氢钠液(乙液):
NaH2PO4·12H2O 15.601g
双蒸水 加至500ml
取甲液36ml，乙液14ml和NaCl8.2克，加双蒸水至1000ml。混匀待完全溶解分装，经高压灭菌后保存于4℃冰箱备用。
(二)50％PEG(聚乙二醇Polyethyleneglycol mwl500)
称取0.5克PEG，用前放入试管中在酒精灯火焰上熔化，加入等量37℃予热的MEM培养液，混匀，保温在37℃水浴中待用。
(三)MEM培养液(含10％小牛血清)
MEM培养液(日本制药株式会社) 9.4g
双蒸水 1000ml
NaHCO3 1.5g
谷氨酰胺(L-glutamin) 0.292g
56℃灭活30分钟的小牛血清110ml
MEM粉末加水溶解后，用NaHCO3调pH到7.1(因在抽滤过程中pH升高0.2～0.3)，然后加灭活的小牛血清和谷氨酰胺，待完全溶解后，立即用G6抽滤除菌，分装，置4℃冰箱保存备用。
(四)0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA混合消化液
胰蛋白酶(Trypsin)粉 0.25g
EDTA粉 20.0mg
0.01mol／L PBS 100ml
先用少量PBS溶解胰蛋白酶，然后将EDTA粉末和剩下的液体加入混合，置37℃水浴中1小时左右(待彻底溶解，液体呈透明为止)，用G5抽滤，分装置4℃冰箱中保存。
(五)Hanks液
1．原液甲
NaCl 160g
KCl 8g
MgSO4·7H2O 2g
MgCI2·6H2O 2g
溶于800ml馏水中。
CaCl2(无水) 2.8g
溶于100ml蒸馏水中。
将两种液体混合后，加水至1000ml用滤纸滤过，再加2ml氯仿防腐，置4℃冰箱备用。
原液乙
Na2HPO4·12H2O 3.04g
KH2PO4 1.2g
葡萄糖 20.0g
溶于800ml蒸馏水中，用滤纸过滤，然后加0.5％酚红80ml，再加水至1000ml，最后加入2ml氯仿防腐，置4℃冰箱备用。
2．使用液
甲乙两液各1份，双蒸水18份，混匀分装包扎好瓶口，经10磅15分钟高压灭菌后置4℃冰箱中保存。使用时用5.6％NaHCO3调pH值到所需要求。
(六)1640培养液(含lO％小牛血清)
RPMI-1640粉 10.39g
双蒸水 加至1000ml
通入适量的C02气体，边通入CO2边慢慢搅拌，使其(呈透明)完全溶解。用NaHCO31.5克调pH值到7.2。
双抗1万u/ml 10ml
灭活小牛血清 110ml
混匀上述液体，立即用G6抽滤除菌分装，置4℃冰箱备用。
(七)青、链霉素溶液
青霉素钠盐(40万u／瓶) 5瓶
链霉素(100万u／瓶) 2瓶
将两者溶于200ml0.9％的无菌生理盐水，分装小瓶，-30℃保存。双抗在培养基中的终浓度为各lOOu为宜。
(八)二甲基亚砜诱导HL-60细胞分化使用的终浓度为1。4％。
(九)BrdU溶液(200ug/m1)
用无菌青霉素瓶，在室温下称取1.0mg，在无菌条件下加入灭菌生理盐水9.0ml，溶解，混匀，用黑纸包严，避光置冰箱冰格中保存。最好用时现配。
(十)2×SSC溶液
用分析天平称取氯化钠17.53克，柠檬酸钠8.82克溶于蒸馏水中，加蒸馏水至1000毫升。
（十一）3％琼脂：
取琼脂粉3克，加入双蒸水到100毫升，搅匀，高压消毒后(15磅20分钟)，冷藏备用，使用前重新加热煮沸(贮存时间不宜过长)。
四、制备电镜标本的溶液
(一)2.5％戊二醛溶液
25％戊二醛 lOml
0.1mol／L二甲砷酸钠缓冲液
装入茶色瓶中，保存于4℃冰箱备用。
(二)0.1mol／L二甲砷酸钠缓冲液
二甲砷酸钠 10.70g
蒸馏水 500ml
将二甲砷酸钠置于500ml容量瓶中，先加水约400ml，震荡使其溶解，用HCl调pH到7.4，加入剩余蒸馏水，4℃冰箱保存。
(三)包埋剂
环氧树脂Epon812 56.30g
DDSA(十二烷基琥珀酸酐Dodecenyl succinic
anhydride，DDSA) 14.60g
MNA(甲基内次甲基邻苯二甲酸酐Methyl Nadic)
anhydride，MNA 29.00g
混合上述三种包埋剂成分，搅拌30分钟使其充分混匀。再加加速剂2,4,6一三(二甲氨基甲基)苯酚(2，4，6-tridimethyl aminomethylphenol，DMP-30)1.5ml，继续搅拌30分钟，置于干燥罐中(室温)备用。
(四)2％单宁酸
单宁酸 2g
双蒸水 100ml
溶解后过滤装茶色瓶中，4℃冰箱保存。
(五)高锰酸钾固定剂
柠檬酸三钠 60mmol/L
氯化钾 25mmol/L
氯化镁 35mmol/L
高锰酸钾 125mmol/L
pH为7.4-7.8，装茶色瓶中，4℃冰箱中保存，有效期2个月左右。
(六)1％OsO4溶液
OsO4 0.5g
0.1mol/L二甲砷酸钠缓冲液。 50ml
OsO4一般为0.5或1克安瓶中封闭包装，配制时剥去商标，用自来水洗净，放洗涤液中泡4～12小时后用水冲洗，在安瓶上划痕，用蒸馏水洗净，投入茶色瓶中，加缓冲液，用玻璃棒在瓶中捣碎，轻轻摇动放冰箱中，48小时后完全溶解。此药蒸气对人眼、角膜、鼻腔和口腔粘膜有固定作用，用时特别小心，在通风橱内操作。
五、显影、定影溶液
(一)D-72显影液
温水(52℃) 750ml
米吐尔 3g
无水亚硫酸钠 45g
对苯二酚 12g
无水碳酸钠 67.5g
溴化钾 19g
水 加至1000ml
D-72显影液为通用显影液，既能显影胶片又能用于相纸显影。
使用原液，20℃显影时间1～2分钟可得高反差。
加水1:2稀释后使用可得较低反差。1:1稀释使用。20℃时显影时间3～4分钟可得正常反差。
(二)SB-1停显液配方
水 1000ml
28％醋酸 48ml
停显时间lO秒左右。
(三)F-5酸性坚膜定影液
水 750ml
硫代硫酸钠 240g
无水亚硫酸钠 15g
28％醋酸 48ml
硼酸 7.5g
钾矾 15g
水 1000ml
定影时，药液温度应保持在18~20℃定影时间10~15分钟。
配药原则
配制时先取容量3/4的清水，水温50℃左右，按配方的顺序，把称好的药逐一加入，只有前一药品溶解后，方可放入第二种药品，并继续溶解下去，最后将清水加至全量。
配完后要经12小时，待各种药品充分作用后才能使用。
上述各种溶液配制好后，匀应贴瓶签，注明名称，浓度及配制日期，并按规定方法保存，用前检查有无变质或污染现象后，方可使用。
(王维琴 汇编)
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