植 物 组 织 培 养
实验报告
学院:生命科学技术学院
班级:10生技植物班
学号:XXX
姓名:XXX
植物组织培养实验报告
一、实验目的
1．掌握无菌操作的植物组织培养方法；
2．通过配置MS培养基母液，掌握母液的配置和保存方法；
3．通过诱导豌豆根、茎、叶形成愈伤组织 学习愈伤组织的建立方法；
4．通过诱导豌豆茎、叶形成愈伤组织 学习愈伤组织的建立方法；
5．了解植物细胞通过分裂、增殖、分化、发育, 最终长成完整再生植株的过程, 加深对植物细胞的全能性的理解。
二、实验原理
（一）植物组织培养
植物组织培养是把植物的器官，组织以至单个细胞，应用无菌操作使其在人工条件下，能够继续生长，甚至分化发育成一完整植株的过程。植物的组织在培养条件下，原来已经分化停止生长的细胞，又能重新分裂，形成没有组织结构的细胞团，即愈伤组织。这一过程称为“脱分化作用”，已经“脱分化”的愈伤组织，在一定条件下，又能重新分化形成输导系统以及根和芽等组织和器官，这一过程称“再分化作用”。
（二）植物细胞的全能性
植物细胞的全能性即是每个植物的本细胞或性细胞都具有该植物的全套遗传基因，在一定培养条件下每个细胞都可发育成一个与母体一样的植株。
（三）组织的分化与器官建成
外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成一类分生组织即具有分生能力的小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。有些情况下，外植体不经愈伤组织而直接诱导出芽、根。
（四）培养基的组成
培养基中各成分的比例及浓度与细胞或组织的生长或分化所需要的最佳条件相近，似成功地使用该培养基进行组织培养的主要条件。营养培养基一般由无机营养、碳源和能源、维生素、植物激素（生长调节剂）和包括有机氮、酸和复杂物质的添加剂组成。
三、实验器材
高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养室 镊子、记号笔、橡皮筋、玻璃器皿、三角烧瓶、烧杯、量筒、剪刀、棉塞、绳子、牛皮纸、酒精灯、喷雾器等。
四、实验材料
豌豆种子
五、实验药品
药品 、70% 酒精、 0.1% 升汞、MS培养基、蒸馏水、NaOH、 84消毒液、蔗糖、琼脂等。
六、实验步骤
（一）培养基母液的配制
表1.MS培养基个成分的含量（单位：mg/L）
表2.MS培养基所需母液以及扩大倍数
（注：吸取毫升数为每升培养基所吸取的母液的体积）
表3.配制母液所需的药品及称取量
（注：根据表1与表2计算各物质的称取量）
（1） MS大量元素母液的配制
参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰箱中备用。
（2） MS微量元素母液
参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰箱中备用。
（3） MS有机母液
参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至200ML存放于冰箱中备用。
（4） MS铁盐母液的配制
参考表3称取一定量的下列药品用蒸馏水溶解，定容至500ML存放于冰箱中备用。
（5） MS钙盐母液的配制
参考表3称取11000mg的CaCl2?2H2O用蒸馏水溶解定容至500ML，保存于冰箱备用。
（6） MS镁盐母液的配制
参考表3称取9250mg的MgSO4?7H2O用蒸馏水溶解定容至500ML，保存于冰箱备用。
（7） MS肌醇母液的配制
参考表3称取2000mg的肌醇用蒸馏水溶解定容至200ML，保存于冰箱备用。
（8） MS激素母液的配制
各种生长素和细胞分裂素要单独配制，不能混合在一起，生长素类一般要先用少量95%的酒精或1当量的NaOH溶解，细胞分裂素一般要先用1当量的盐酸溶解，然后再加蒸馏水定容。一般取100mg配成100ml母液。
（二）培养基的配制
以配制1L的MS培养基为例进行如下操作：
（1） 取1L的大烧杯，加入适量的蒸馏水在电磁炉上加热至沸腾；
（2） 分别取（一）中配制的8种母液放入小烧杯中，然后加入，边加边搅拌；
（3） 称取30g蔗糖加入，边加边搅拌；
（4） 称取8g琼脂加入，边加边搅拌，知之琼脂粉溶解；
（5） 定容至1L，加入激素母液，用NaOH调PH6.0左右；
（6） 将培养基分别分装于洗好的三角瓶中，塞上棉塞包上牛皮纸用绳子扎紧；
（7） 放入消毒灭菌锅灭菌，灭菌20分钟左右；
（8） 灭菌后从灭菌锅中取出培养基，平放在实验台上令其冷却凝固。
（三）高压蒸汽灭菌锅的使用方法
具体操作步骤：
（1） 高压锅放水至平把架；
（2） 把包扎好的培养基装入高压锅；
（3） 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀；
（4） 然后接通电源；
（5） 压力计升至0.05MPa时，打开放气阀,排除冷空气(此步很重要)；
（6） 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到0.11MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11MPa时接通电源，不断重复此操作过程，维持20分钟；
（7） 灭菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀(注意要逐渐放气)待高压锅内的空气完全排除后，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出；
（8） 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检查培养基有无微生物污染，可将培养基置于25℃下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4℃低温下保存。
总结：高压灭菌锅的使用方法可归纳为：进水→放进培养基→盖紧锅盖→关上放汽阀→检查安全阀→接上加热源→待压力升至0.05MPa时排锅内冷空气，关上放气阀→0.11MPa(121℃)下灭菌20~25分钟，保持稳定压力→除热源→逐渐打开放气阀→锅内空气排除完后→开放锅盖→稍冷后取出培养基。
（四）、无菌操作技术
1、植物材料表面——消毒剂灭菌
从外界或室内选取的植物材料，都不同程度地带有各种微生物。这些污染源一旦带入培养基，便会造成培养基污染。因此，植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。
2、接种步骤：
第一步：清理材料→→流水冲洗→→加入吐温（或洗衣粉）清洗
→→自来水冲洗；
第二步：对材料的表面浸润灭菌 ： 70%酒精浸10-30秒→→无菌水；
第三步：灭菌剂处理→→ 0.1-1%升汞5-8 min（或其他灭菌剂） ；
第四步：无菌水进行冲洗。
注意事项：
（１）灭菌剂一般要临时配制，现配现用．升汞可以短期储存；
（２）对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗３-４次，升汞一般５-８次，每次不少于３min；
（３）灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底；
（４）灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止；
（５）灭菌液要充分浸没材料。
3、无菌操作可按以下步骤进行：
（1）在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；
（2）在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；
（3）接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；
（4）上工作台后，用酒精棉球搽拭双手，特别是指甲处。然后搽拭工作台面；
（5）先用酒精棉球搽拭接种工具，再将镊子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端处，对培养皿要过火烤干；
（6）接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿镊子、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。（如叶片切成0.5cm2的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含1-2片叶原基）在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染；
（7）接种完毕后要清理干净工作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大强度灭菌一次。
（五）豌豆的萌发与豌豆外植体的接种
1、准备 打开超净工作台，将镊子酒精灯放如超净工作台中，用紫外灯照 20min后关闭紫外灯，同时将豌豆种子用自来水冲20min关闭紫外灯后在台上点燃 2 个酒精灯，用棉球将镊子烧4次，超净作台少2次。将灭菌溶液，无菌水， 豌豆，大烧杯等放入超净工作台。
2、灭菌 在超净工作台上取经浸泡处理的豌豆，先用酒精倒入种子瓶中约2／3消毒一次（1-2s）接着用无菌水冲洗一次。再用84 消毒液摇晃清洗清洗 3 次，每次 5 分钟，清洗完后用无菌水冲洗一次。而后用 0.5%HgCl 泡8min，处理 2 次，每次 5 分钟。后用无菌 水摇晃清洗 4-5次。
3、接种 将所要用的三角瓶用75％的酒精喷湿，接着把手喷湿并把三角瓶带入超净工作台。接着将灭菌处理好的豌豆种子在超净工作台上用镊子靠近酒精灯的外焰放入向下倾斜的锥形瓶杯中，每个瓶内装 4 粒豌豆，接种过程中锥形瓶应一直保持向下倾斜，直到接种完毕盖上棉塞，贴上标签，放入光照培养箱中。一周后挑选长势较好的幼苗用同样的接种方法将外植体接入三角瓶中，贴上标签，放入暗处。（注：接两瓶茎两瓶叶，茎剪成0.5厘米左右的小段，将茎上的叶片剪干净，平铺在培养基上；叶片成0.5*0.5用镊子破碎，平铺在培养基上。）
4、标记 接种完毕后，用棉线绑好用铅笔在牛皮纸标上制作人和日期，放入有光的培养架上。
5、定期观察种子的萌发情况和外植体的分化情况，记录种子的萌发率、污染率以及愈伤组织的诱导率。
种子的萌发率为：83.3% 种子的污染率：0%
外植体的污染率：100% 愈伤组织（茎）的诱导率：100%
愈伤组织（叶）的诱导率：100%
6、定期观察，并纪录实验结果。（实验结果见图1）
注：实验人员进入接种室接种之前，应先接种前一定要用新洁尔灭等消毒水擦拭，70%~75%酒精进行喷洒杀菌降尘，
其次一盏酒精灯也是必不可少的，不管是开母苗之前还是接种过程或是开关子瓶培养基，都应该在酒精灯上操作。
操作过程中所有的动作都应尽量的小幅度，特别是不能横扫所有灭过菌的东西，如：消过毒的镊子、手术刀、培养皿等；接苗是手指不能接触到瓶口，如果镊子不小心碰到瓶口或台面那就不要犹豫，直接换掉；分切的整个过程动作要快，时间越长越容易污染。
图1实验结果
（六）实验结果分析
在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术。植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。植物组织培养不仅仅局限于培养基的培养，还包含有试管苗的移栽技术。
通过组织培养得到的植物体的特点：组织培养得到的植物体的遗传物质与原植物体的遗传物质完全相同，表现出的性状完全一样（排除基因突变等情况）。需要注意的是如果用亲本的花粉进行组织培养，那么得到的植株会是单倍体，单倍体的遗传物质自然也就比用体细胞培养的植株的遗传物质减少一半。植物组织培养的实质是：基因的选择性表达
在后期的愈伤组织的脱分化在生根的过程中应考虑愈伤组织发生不定芽和不定根的能力与哪些因素有关；愈伤组织再生成完整植株有几种方式；怎样尽量避免出现褐变和玻璃化苗；试管苗驯化中应注意调节什么因素；如何估测增殖率；如何安排快速繁殖计划等一系列的问题。
第二篇：植物组织培养综合实验报告模块(20xx年3月)
《植物组织培养大实验》综合报告书写说明
植物组织培养这一个综合性很强的大实验，《植物组织培养大实验》课程实验由7个分实验组成：
实验用具的洗涤和灭菌，
MS培养基母液的配制，
MS培养基的配制和灭菌，
植物外植体消毒和接种，
愈伤组织的诱导（又称原代培养或初代培养），
愈伤组织的继代培养，
愈伤组织的生根培养（植株再生）。
实验报告是对实验观察、比较所得结果的真实记载，是科学的记录。实验报告的形式可以根据实验风容的不同而分文字描述、绘图和列表3种形式。为了减少实验报告写作过程中的重复性和减轻学生完成实验报告的负担，《植物组织培养大实验》课程实验报告由5次综合实验报告组成，即：
1、《植物组织培养大实验》综合报告（一）（必做）：实验用具的洗涤和灭菌、MS培养基母液及MS培养基的配制和灭菌；
2、《植物组织培养大实验》综合报告（二）（必做）：植物外植体消毒和接种；
3、《植物组织培养大实验》综合报告（三）（必做）：愈伤组织的诱导（又称原代培养或初代培养）；
4、《植物组织培养大实验》综合报告（四）（必做）：愈伤组织的继代培养；
5、《植物组织培养大实验》综合报告（五）（选做）：愈伤组织的生根培养（植株再生）。
学生在写《植物组织培养大实验》综合报告时，实验报告中的实验内容、实验目的、实验原理、仪器设备和试剂等4部分可按照教师拟定的《植物组织培养大实验》综合报告（一）至（五）中的内容写。实验方法部分可参照教师编写的实验指导。实验结果与分析是学生对自已实验结果的真实记载和分析，思考题是教师为了让学生加深对植物组织培养的原理与技术的理解和掌握而设计的。因此，综合报告中的实验结果与分析、思考题2部分内容，要求学生必需独立完成。
《植物组织培养大实验》综合报告（一）（必做）
【实验内容】 实验用具的洗涤和灭菌、MS培养基母液及MS培养基的配制和灭菌
【实验目的】
1、掌握植物组织培养中常用实验用具的洗涤、灭菌方法及注意事项；
2、掌握MS培养基母液的配制方法和注意事项；
3、掌握MS培养基的配制、灭菌方法和注意事项。
【实验原理】
对植物外植体进行离体培养时，培养基提供生长所需的营养成分等。培养基的主要成分包括无机营养物、碳源、维生素、植物生长物质和有机附加物等。
配制培养基通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用时按比例稀释。一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机化合物母液、植物生长物质母液。
凡是暴露在(未经处理的)空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体都是有菌的。培养基中含有大量的有机物，特别是含糖量较高，是微生物滋生、繁殖的极好场所。而接种材料需要在无菌得件下培养很长的时间，如果培养基被微生物所污染，便达不到培养的预期结果。
因此，培养基的灭菌，是植物组织培养中十分重要的环节。培养基灭菌的方法有多种，本实验田采用高压蒸气灭菌法（即湿热灭菌法，其原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.10MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
【仪器设备和试剂】
1、仪器设备
高压蒸气灭菌锅，电子天平，冰箱，烧杯（100ml，500ml，1000ml），量筒（50ml，100ml，1000ml），试剂瓶（100ml，500ml，1000ml），三角瓶（50ml，100ml，250ml），培养瓶（100ml，150ml）或培养皿（d90mm，d1 20mm），洗耳球、刻度吸管，pH试纸，漏斗，玻璃棒，记号笔，线绳，牛皮纸或报纸，石棉网。
2．试剂
重铬酸钾(K2Cr2O7)、硫酸(H2SO4)、硝酸钾（KNO3）、硝酸铵（NH4N03）、硫酸镁（MgS04·7H20）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、氯化钠（CaCl2·2H20）、硫酸锰（Mn04·4H20）、硫酸锌（ZnS04·7H20）、硼酸（H3BO3）、碘化钾（KI）、钼酸钠（NaMo04·2H20）、硫酸铜（CuS04·5H2O）、氯化钴（CoCl2·6H20）、乙二胺四乙酸二钠（ Na2-EDTA）、硫酸亚铁（FeS04·7H20）、甘氨酸、盐酸硫胺素（Vit·B1）、盐酸吡哆素（Vit·B6）、肌醇、2,4-D、6-BA、 1 mol／L盐酸、1 mol／L氢氧化钠、蔗糖、琼脂。
【实验方法】
1、简述玻璃器皿的洗涤和灭菌方法；
2、简述MS培养基母液（包括大量元素母液、微量元素母液、铁盐母液、有机化合物母液、植物生长物质母液等5种母液）的配制方法；
3、简述MS培养基配制（按照配制1L培养基的量进行描述）和灭菌方法。
【思考题】
1、什么是植物组织培养概念？
在含有营养物质及植物生长物质的培养液中，培养离体植物组织（器官或细胞）并诱导使其长成完整植株的技术
植物的组织培养是根据植物细胞具有全能性这个理论，近几十年来发展起来的一项无性繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
2、什么是外植体的含义？根据外植体的不同，植物组织培养可以分为几种类型？
外植体 用于离体培养的初始材料称为外植体，如在植物快速繁殖中从母株上切取的、用于消毒培养的茎芽、茎段、叶片或分生组织等。通常外植体的选择与植物组织培养快速繁殖成功与否有着密切联系，在建立植物组织培养快速繁殖体系应首先考虑采用何种外植体来开始培养。决定外植体选择的因素主要是来源、数量、消毒难易程度、以往经验等。在兰花组培中最为常用的外植体是茎尖和种子。
3、植物组织培养有哪些特点？
形态类似，结构相同，功能相同
通过组织培养得到的植物体的特点：组织培养得到的植物体的遗传物质与原植物体的遗传物质完全相同，表现出的性状完全一样（排除基因突变等情况）。需要注意的是如果用亲本的花粉进行组织培养，那么得到的植株会是单倍体，单倍体的遗传物质自然也就比用体细胞培养的植株的遗传物质减少一半。植物组织培养的实质是：基因的选择性表达
4、MS培养基包括哪些成分？各有什么作用？
5、采用高压蒸汽锅高压灭菌时，应注意哪些事项？
(4)注意事项。在灭菌过程中，应注意排净锅内冷空气，锅内冷空气如排放不净，会影响灭菌效果，达不到彻底灭菌的目的。由于高压蒸汽灭菌时，要使用温度高达120℃、两
大气压的过热蒸汽，操作时，必须严格按照操作规程操作，否则容易发生意外事故。
6、简述植物组织培养与农业生产的关系？
7、灭菌和消毒有无差别？为什么？
消毒是指用物理或化学方法消灭某种范围内的有害微生物，保留目的菌。例如，进行食用菌组织分离时，子实体表面必须进行消毒，消灭体表杂菌，以便获得分离物的纯培养。
灭菌是指用物理或化学方法，完全杀死培养基或器物内外的一切微生物，使灭菌对象上的蛋白质完全变性。
灭菌：用理化方法杀死一定物质中的微生物的微生物学基本技术。灭菌的彻底程度受灭菌时间与灭菌剂强度的制约。微生物对灭菌剂的抵抗力取决于原始存在的群体密度、菌种或环境赋予菌种的抵抗力。灭菌是获得纯培养的必要条件，也是食品工业和医药领域中必需的技术。
消毒：（disinfection)是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常用化学的方法来达到消毒的作用。用于消毒的化学药物叫做消毒剂。
《植物组织培养大实验》综合报告（二）（必做）
【实验内容】
植物外植体消毒和接种
【实验目的】
学习和掌握植物外植体表面消毒的常规方法。
【实验原理】
用于进行组织培养的组织、器管和细胞称为外植体。在植物组织培养中，外植体如果是带菌的，在接种前都必须进行表面消毒，这是取得培养成功的最基本的和重要的前提。常用消毒剂对外植体进行消毒。接种是将经严格的表面灭菌处理好的外植体，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。
【实验材料】 水稻成熟胚
【仪器设备和试剂】
1、仪器设备 超净工作台，酒精灯，烧杯，镊子，剪刀，手术刀，无菌吸水纸，一次性手套，标签纸，记号笔等。
2、试剂 MS培养基，0.1％氯化汞，75％乙醇，无菌水。
【实验方法】
1、试述外植体（水稻成熟胚）的消毒方法。
1、试述外植体（水稻成熟胚）的接种方法（包括接种前、接种、接种后等3个操作环节）。
【实验结果与分析】
接种后7天观察污染情况
污染率(％)=(污染的材料数/接种材料总数)×100％
对实验结果进行分析：（1）若无污染，请总结成功的经验；（2）若有污染，请说明导致污染的可能原因。
【思考题】
1、实验人员进入接种室接种之前，应做哪些准备工作？
先接种前一定要用新洁尔灭等消毒水擦拭，70%~75%酒精进行喷洒杀菌降尘， 其次一盏酒精灯也是必不可少的，不管是开母苗之前还是接种过程或是开关子瓶培养基，都应该在酒精灯上操作。 操作过程中所有的动作都应尽量的小幅度，特别是不能横扫所有灭过菌的东西，如：消过毒的镊子、手术刀、培养皿等；接苗是手指不能接触到瓶口，如果镊子不小心碰到瓶口或台面那就不要犹豫，直接换掉；分切的整个过程动作要快，时间越长越容易污染。 每分切完一瓶都要进行台面的清洁及消毒。 以上是我的个人经验，不一定完整，但做到上述，污染率肯定能下降的，希望对你有帮助
2、在接种过程中，通过哪些措施来防止细菌对接种工具、接种材料的污染?
3、外植体用消毒剂消毒后，为什么要用无菌水漂洗？在消毒溶液中加入1~2滴表面活性剂(如吐温)有什么作用?
消毒水都具有很强的烧蚀性，在杀灭细菌的同时，也会作用于正常的细胞组织，影响正常细胞的成长或再生，所以外植体消毒后一般要用无菌水漂洗，以清除残留的具有杀伤力的消毒剂，有的要加表面活性剂，也是这个道理。
。使用消毒剂的原则是既要达到消毒目的，又不能损伤植物组织和细胞，还要符合就地取材的原则。对一些容易污染、较难灭菌的外植体进行表面消毒时，用单一消毒剂不能收到好的效果，所以常选用两种消毒剂交替浸泡法。一般，首先用75％乙醇浸泡外植体数秒钟至30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸钠溶液5～30min，然后用无菌水漂洗3 次后，切割、用于接种。用消毒剂对接种材料进行灭菌处理时，可以在灭菌溶液中加入1～2 滴表面活性剂，如吐温80或吐温20，它们可以湿润外植体整个组织，促进灭菌液充分接触表面组织，达到较好的消毒效果。消毒溶液对外植体消毒是在超净工作台上进行，完成表面消毒的接种材料要尽快放置于培养基中。
《植物组织培养大实验》综合报告（三）（必做）
【实验内容】
愈伤组织的诱导（又称原代培养或初代培养）
【实验目的】
掌握诱导外植体形成愈伤组织的原理和方法。
【实验原理】
已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞，这个过程称为脱分化(dedifferentiation)。来自于植物各种器官的外植体在离体培养条件下，细胞经脱分化等一系列过程，改变了它们原有的特性而转变形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，即愈伤组织(图5-1)。一般情况下，植物各器官和组织均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。
植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。生长素是用于诱导愈伤组织形成的生长物质，常用的种类有2,4-D，IAA和NAA，所需浓度在0.1～10 mg／L范围内；常用的细胞分裂素是激动素、玉米素和6-BA，使用的浓度范围在0.1～10 mg／L。对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。来自于不同植物、同一植物的不同器官或组织，产生的愈伤组织在质地和物理性状方面是有差别的。
【实验材料】
豌豆胚根。
【仪器设备和试剂】
1、仪器设备 各种接种工具，超净工作台。
2、试剂
（1）0.1％氯化汞，75％乙醇，2,4-D mg /ml，NAA mg/ml，无菌水，蔗糖，琼脂；
（2）MS培养基各种母液。
【实验方法】
（1）愈伤组织诱导培养基：MS培养基＋1.0 mg/L 2,4-D＋0.5 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L NAA+15 g/L蔗糖+0.8%琼脂；
（2）愈伤组织诱导培养基的配制和灭菌；
（3）接种用具的灭菌和消毒；
（4）接种（包括接种前、接种、接种后等3个操作环节）。
【实验结果与分析】
外植体培养15 d以后将培养瓶放入超净工作台观察诱导形成的愈伤组织的颜色和质地，计算愈伤组织诱导率：
愈伤组织诱导率(％)＝产生的愈伤组织的材料数/接种材料总数×100%
对实验结果进行分析：（1）若愈伤组织诱导率超过50%，请总结成功的经验；（2）若愈伤组织诱导率低于5%，请总结导致失败的可能原因。
【思考题】
1、植物生长物质对愈伤组织的诱导起何作用？
2、分析影响愈伤组织诱导的主要原因。
《植物组织培养大实验》综合报告（四）（必做）
【实验内容】 愈伤组织的继代培养
【实验目的】 掌握愈伤组织继代培养的原理和方法。
【实验原理】
愈伤组织在培养基上生长一段时间以后，由于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物的积累，必须转移到新鲜培养基上培养，这个过程收继代。将初代培养所得到的愈伤组织切成小块后接种到新鲜培养上培养即可增殖。
【实验材料】
豌豆胚根愈伤组织
【仪器设备和试剂】
1、仪器设备 各种接种工具、超净工作台。
2、试剂
（1）75％乙醇，无菌水，2,4-D mg /ml，NAA mg/ml，甘露醇，蔗糖，琼脂；
（2）MS培养基各种母液。
【实验方法】
（1） 继代培养基：MS培养基（含2,4-D 0.5mg /L+NAA 0.2mg/L+1%甘露醇+3%蔗糖+0.8%琼脂）；
（2）继代培养基的配制和灭菌；
（3）接种用具的灭菌和消毒；
（2）接种（包括接种前、接种、接种后等3个操作环节）。
【实验结果与分析】
1、记录愈伤组织继代的生长状况；
生长状况好的愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构疏松，颜色浅而透明。
2、记录愈伤组织继代的污染情况；
污染率(％)=(污染的材料数/总接种材料数)×100％
3、若愈伤组织生长状况不好，请分析其可能的原因。若有污染请分析导致污染的原因。
【思考题】
1、愈伤组织继代培养与哪些因素有关?
影响甘蔗愈伤组织分化成苗的因素有愈伤组织的质量和大小、培养基、光照等。愈伤组织的大小对分化具有明显的影响，接种时愈伤组织块不宜小于5mm。
2、组织培养中，怎样尽量避免出现褐变和玻璃化苗？
在外植体上形成以后，愈伤组织的继承培养在已充分发育，但没有出现老化现象之前，应及时从外植体上分离下来，转入继代培养基上进行继代培养。分离是必要的措施，继代培养时若连同外植体就会影响愈伤组织的产量和质量，可能是由于残存的外植体在死亡过程中会产生某些有毒物质，愈伤组织会出现老化、粘化及不正常分化等现象。
《植物组织培养大实验》综合报告（五）（选做）
【实验内容】 愈伤组织的生根培养（植株再生）
【实验目的】 掌握愈伤组织生根培养的原理和方法。
【实验原理】
愈伤组织在离体培养过程中，组织和细胞的潜在发育能力可以在某种程度上得到表达，伴随着反复的细胞分裂，又开始新的分化。将脱分化的细胞团或组织经重新分化而产生出新的具有特定结构和功能的组织或器官的一种现象，称为再分化。在一定的培养条件下，愈伤组织通过分化可以形成苗或根的分生组织甚至是胚状体，继发育成完整的小植株。
【实验材料】
豌豆胚根继代培养的愈伤组织
【仪器设备和试剂】
1、仪器设备 各种接种工具、超净工作台。
2、试剂
（1）75％乙醇，无菌水，NAA、6-BA、琼脂、蔗糖等
（2）MS培养基各种母液。
【实验方法】
（1）生根培养基：MS+ 2.5mg/L 6-BA + NAA 1.5mg/L+3%蔗糖+0.8%琼脂；
（2）培养基的配制和灭菌；
（3）接种用具的灭菌和消毒；
（2）接种（包括接种前、接种、接种后等3个操作环节）。
【实验结果与分析】
1、记录愈伤组织培养25d后，发生不定根的情况，计算生根率(％)：
生根率(％)=(生根愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数)×100％
2、记录愈伤组织分化培养基培养15d后新生芽发生和生长的状况，计算分化率。
芽分化率(％)=(生芽愈伤组织块数/接种愈伤组织总块数)×100％
【思考题】
1、愈伤组织发生不定芽和不定根的能力与哪些因素有关?
2、植物生长物质对诱导愈伤组织分化起何作用?
3、愈伤组织再生成完整植株有几种方式？哪一种较好？为什么？
4、为了促使愈伤组织再分化，应怎样调整生长素和细胞分裂素的比例？
5、试管苗驯化中应注意调节什么因素？
6、如何估测增殖率？如何安排快速繁殖计划？