一名毕业学子眼中的生物科学系

时间:2023.11.18

一名毕业学子眼中的生物科学系

简单介绍一下自己 蚌埠医学院生物科学系06级学生 20xx年毕业 现在浙江大学医学院读研。可能论坛里的一些“老人家”都熟悉我的ID,五年来基本没用过马甲。^_^

这几天因为叔叔的孩子被母校临床录取,关注了论坛里很多高招的帖子,也有被生物科学系录取的同学问过这个专业到底如何,对于论坛里一些人之于生物系的看法,实在是忍不住想多说几句。

蚌医的生物科学系于20xx年开始招生,授理学学士,到现在已经走过了8个年头。从一开始只招三四十人到06年以及之后的90人,跟一系二系等千人大系相比,的确是“很小很小”的招生规模。但是,一个刚刚起步不到十年的系部,已经做得很好了。

首先,对于大部分学生和家长而言,衡量某个专业好坏的重要标准是就业率和就业前景。我其实不清楚生物科学系每年的就业率具体是多少多少,但是我知道我们06级,连那位腿脚不方便不能到处投简历找工作的同学都在老师和同学的介绍下在北京某个不错的生物公司找到了一份工作,其他人的工作如何也无可赘言。 至于就业前景,由于生物公司以及具有研发能力的医院集中在大中城市,我们系实习点也主要集中在北京、上海、南京、广州和深圳,学生因而受益,我同学大部分就业于北上南广的医院或者生物公司。工资待遇且不论多少,一个月起薪两三千吧,但是能在一线城市便意味着更多的机遇和 更残酷的竞争。之前在某贴中听说03级一个学长年薪已几十万(估计是从技术研发转行做了销售),05级一学长已经在深圳儿童医院转正,有一些人可能已经转行从生物研发去做销售,去经商,还有一些人包括我自己在科研的道路上继续前行??不管选择是什么,是母校和系部为学生搭建了这样一个优质的平台,我们也许永远不能成为主刀的大夫和开方处药的医师,但是我们的未来却没有因此而失却半点色彩。

其次,说一说生物科学系的本科生教育。这不可否认,生物科学系是一个新的专业,教师配备和硬件水平的确还有很多需要完善的空间,比如一些生物类专业课开设的不全,比如一些医学类的课程也教授得有些囫囵吞枣,比如学生暑期实验室的实习和训练还相当缺乏,比如对学生科研思维的training还很不足。但是,老师们真的在很用心,认真选择适用的教材,编写实验教程,我研究生阶段做的一些生化实验都多少参考着本科时的实验报告,前几日跟今年考上我导师的07级(比我晚一年进蚌医)的师妹交流,惊喜发现她们现在本科的实验竟然做过细胞的原代培养和冻存复苏。同时07、08级也开始开展了一些创新型的课外实验等等,以及在省外大中城市医院、科研院所以及生物公司建立优质的实习点----生物系虽小,但是配备绝对不赖。

第三,关于考研。 对于生物科学这样一个21世纪被称作最promising和advancing的学科,蚌埠医学院设置这个专业是很创新的。前不久跟一位叔叔聊天,他是蚌医82届的老校友,从US回国探亲,听到蚌医新设的生物科学专业,很吃惊也有些惊喜。(安医据说也设置过生命科学专业,但是据说不幸夭折了。)生物专业的本科生找工作,无外乎两种选择--纯技术操作和转行医药销售,前者稳定但是发展潜力很小,后者很累很苦虽然收入可能会不错。在这么一个本科生泛滥的时代,尤其是生命科学/生物科学这样的实验科学、探索性很强的学科,想在本专业内有所发展和作为,读研可以说是不二的选择。

生物科学系建系以来,有07、08、09、10、11届五届毕业生,08届最好的考上中国协和医科大学的成都血液所,09届有调剂到苏大和北京科技大学,10届也就是我们这一级RP大爆发考得非常好,10届共77人,14个考上研究生(今年还有一个同学考上了同济),包括浙江大学医学院、上海交通大学医学院、武汉大学生科院、四川大学生科院、第二军医大学长征医院、南京医科大学和南京师范大学、浙江理工各一位,中山大学医学院、中国药科大学、

东南大学各两位(详见/z40409-1-1.html);11届也考得非常好,我所知道的有浙大(成为了我的师妹)、上交、中山医、中国药科(我同学的师弟)、南京师大各一位以及复旦两位,安医大五位。

大部分学校都是国内顶尖的高校,甚至是师从院士级的导师(我们10届有三个同学的导师是院士)。在这样的top university里面,对于立志科研的人,能受到最好的scientific training(科研训练)是最关键的;对于只把读研作为获得一张硕士文凭的人来说,读研的经历不仅对于个人人生观和价值观的形成是非常重要的,读研时期结识的朋友人脉对于以后的发展也很有益处,当然这一纸文凭也的确是一个很好的敲门砖。

一个系部的成长和积淀离不开一届届学生的传承,生物科学系正在茁壮成长,作为一名毕业的学子,也很开心看到母校和生物科学系越来越好。我还能记得大一刚进学校的时候,一个同学自嘲”来到蚌医非我所想,来到生物系非我所愿“。的确,也许现在的种种都并非最理想的选择,我最初的梦想也是能成为悬壶济世的医生,接过前辈的衣钵;现实如此骨感,何不积极面对?

生物科学系学制四年,前三年在学校学习理论课程,最后一年在学校安排的实习点实习。 (以下所介绍的均是我们06级的课程安排,每学期系部对于课程都会有一些调整,仅供学弟学妹参考)

一年级,主要的课程大致有系统解剖学,无机化学,有机化学,生理学,组织胚胎学,还有大学英语1和2。

系统解剖学:是整个医学的基础,非常关键,也非常复杂。我们系对系解的要求不高,掌握基本知识和概念即可。

英语:第一学期英语考试成绩可能会直接关系到能否大一下学期参加四级考试。所以,不管你的英语基础如何,大学的时候一定不能懈怠英语的学习。首先是单词的积累,其次是注意培养自己的语感---个人认为,语感比做题背单词更重要。我大一下学期考四级,只粗略过了一遍四级单词,做了十套真题,其他大部分时间都在看新概念英语以及ChinaDaily等一些英语报纸,最后考出来591。长江后浪推前浪,07级还有学妹考到了600+,生物系有很多英语优秀的学长学姐,谨以共勉。英语学习是一项长期的工程,有一份好的四六级成绩单在手或者说大好很坚持的语言基础,日后找工作或者考研都大有益处。

有机化学&无机化学:也是两门基础课,是高中化学更深层次的扩展,理科生学起来问题不大。

医学生理学&组培学:医学基础课,非常重要。医学生理是西综考研要求科目之一。

二三年级,开设专业课。重头戏是生物化学(王镜岩编写,上下两本,厚得能砸死人),遗传学(我们的教材是高教出版社经典版两本小书),分子生物学(我们用的是南开大学版,大部分生物考研要求的是朱玉贤版),细胞生物学(翟中和版)。以及病理学,药理学,免疫学,神经生物学,发育学,医学微生物学,医学统计学,基因工程学原理,生态学,酶工程,医学遗传学和临床医学科研导论等。可能会有疏漏,想起来再补充。

生物化学:生物科学类专业课,王镜岩编写,第三版分上下两册。与其说是教材,不如说是非常好的参考书。老师在课堂上教授的内容很有限,课下自己细细品味书中文字,会有黄金屋颜如玉的哦~~(生物类考研必考科目)

遗传学和分子生物学:十分重要。自DNA双螺旋结构破解之后,分子生物学迅猛发展,生物科学领域无处不见分子遗传学的身影,DNA蕴含着大量人类起源的奥秘,也是诱人非常。(生物类考研常考科目)

细胞生物学:从DNA到蛋白质,从分子到细胞,细胞生物学是一门发展很成熟的学科,翟中和第三版细胞生物学也是国内的经典教材,值得好好研读。(生物类考研常考科目)

病理学&药理学&医学遗传学&医学免疫学&医学微生物学:都是医学基础课,跟生物科学密切相关。老师配备很是精良。

神经生物学:听说07级的没开?我读研的专业就是神经生物学。这是一门新兴的学科,上至脑的高级功能--认知、记忆下到glia在细胞分子水平上的功能,十分有趣十分神秘。非专业课,与生理学、分子遗传、细胞生物学、药理学、免疫学、发育学均有交叉,很promising的学科。

发育学:教材很厚的一本书,我自己是全部睡过去的,没学到东西,遗憾了,呵呵呵。 生态学:很有趣,对植物生物学很感兴趣的同学注意了。

酶工程&基因工程学原理:应该可以说是生物技术类的课程。这几天重新翻了翻基因工程学原理,受益匪浅。本科时候学习,大量的理论知识一时难以消化,现在跟实验结合起来,很多困惑迎刃而解。基因和分子本来就是很抽象难以理解的东西,学习有困难的时候多跟老师讨论。教授这两门课的老师都是很好的。

医学统计学:预防系的老师讲授,不厚的一本书,但是很有用。主要讲授一些基本的数据统计方法和原理。

临床医学科研导论:我不得不说,是很水的课。

另外,系里可能还要开设生物信息学课程。这个对于以后的科研和工作是非常有用的。主要涉及文献查询,Pubmed上protein/nucleotide/gene/Mesh等一些常用数据可的使用,以及oligo,primer等一些重要软件的使用。实在不懂的,做好笔记,以后肯定用的上。

至于各种考试,自然是要努力争取高分----名利双收的事情,何乐而不为。待到找工作和考研时,能拿得出手的也就是那么几张成绩单获奖证书。

父母含辛茹苦供你读书,不好好学对得起党对得起政府对得起国家么? 计算机考试嘛,铁了心考研的同学可以直接忽略了,一点用没用,报名费死贵,浪费钱。但计算机还是要懂一些的。

一些校外的英语考试,比如上海中高级口译啊,人事部翻译证书等等,感兴趣的可以去了解一下,含金量还是很高的,尤其是人事部翻译证书。

有些学校社团比如英语爱好者协会,探索者协会,记者团等等还是不错的,认真参与其中,杜绝打酱油,对于个人的历练是很有好处的。

四年级,远赴校外实习点实习(也有几个留校的名额)。这是非常重要的实践经历,实习和考研在上面有说到。不赘言了。


第二篇:生物科学系


生物科学系

学号: XXXXXXXXX

泰山医学院毕业设计(论文)

题目:SSR分子标记在核桃遗传分析中的应用

院(部)系 所 学 专 业 年级、班级 完成人姓名 生物科学系 生物技术 20XX级本科X班 XXXXXX

XXXXXX 副教授

指导教师姓名 专业技术职称

20xx年 6 月 15 日

泰山医学院本科毕业论文 XXXXX

论文原创性保证书

我保证所提交的论文都是自己独立完成,如有抄袭、剽窃、雷同等现象,愿承担相应后果,接受学校的处理。

专业: 生物技术

班级: 2005级本科二班

签名:

20xx年 6 月 15 日

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泰山医学院本科毕业论文 XXXXX

SSR分子标记在核桃遗传分析中的应用

摘 要

目的 利用SSR技术对黑核桃、元丰实生核桃、云新核桃、泰山野核桃和陕西实生核桃进行种质资源的遗传分析。

方法 改良的CTAB法提取基因组DNA,在建立了良好的PCR反应体系基础上,利用筛选出来的8对引物对30份材料进行PCR扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚类分析。

结果 在相似系数0.682时,可将供试的30份材料分为4个类群(SSR groups,简称Sg)SgⅠ类包括12份材料,占供试材料的40.00%。SgⅡ、Ⅲ、Ⅳ类各包括核桃材料的6份,分别占20.00%。SgⅠ类先和SgⅡ类群聚到一起,再和其他三类聚到一起。当相似系数为0.793-0.863之间时,又可将SgⅠ类群分为2个亚群,SgⅠ-1和SgⅠ-2,SgⅠ-1中包括所有的元丰核桃实生后代;SgⅠ-2中包括所有的陕西核桃品种。SgⅡ包括所有的云新核桃品种,由于采集的样本来源较近,所有的材料可能是同一种品种。SgⅢ、Ⅳ分别包括所有的泰山野核桃和黑核桃,而且遗传复杂性高。

结论 元丰实生后代、陕西核桃与云新核桃遗传关系最近。云新核桃遗传相似系数为1,可能取材来自同一种样本。泰山野核桃和以上三者有较大的差别,遗传关系较远。黑核桃是遗传特性差别更大,最后才相聚。

关键词: SSR ( Simple Sequence Repeat);核桃;遗传分析

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泰山医学院本科毕业论文 XXXXX

SSR molecular markers in walnut genetic analysis

Abstract

Purpose: This Experiment use of this technology on the black walnut, seedling Yuanfeng, Yunxin, Taishan wild walnut and Shanxi walnut in Genetic analysis of germplasm resources.

Methods:Extracting genomic DNA by Modified CTAB method , In the establishment of a sound base on PCR reaction system. Using of screening out of eight pairs of primers in 30 materials amplified PCR and acrylamide gel electrophoresis,then Cluster Analysis.

Results : 30 materials fall into 4 Groups(SSR-PCR, Sg).SgⅠconsists of 12 materials which account for 40.00%.Every species of SgⅡ,Ⅲ,Ⅳ consists of 6 materials that account for 20.00%. SgⅠand SgⅡget together first ,then get together with the rest species. SgⅠfalls into 2 subgroups, that is SgⅠ-1 and SgⅠ-2. SgⅠ-1 consist of all descendants of Yuanfeng walnut. SgⅠ-2 consist of all species of Shanxi walnut. SgⅡconsist of all species of Yunxin walnut. Because of the source of the collection of swatch is close. Maybe all the materials of Yunxin walnut are the same variety. SgⅢ consist of all theTanshan wild walnut and SgⅣ consist of all the black walnut. The two species of all the materials’complexity are high in heredity.

Conclusions:The genetic relationships among Yuanfeng Seedling generations ,Shanxi walnut and Yunxin walnut. Genetic similarity coefficient of Yunxin walnut is 1,the drawn maybe from the same sample.That are differences between Taishan wild walnut and Yuanfeng Seedling generations ,Shanxi walnut and Yunxin walnut.Its Genetic relationship is far. Genetic characteristics of black walnut are more different and get together last.

Keywords:SSR (Simple Sequence Repeat); Walnut ; genetic analysis

4

泰山医学院本科毕业论文 XXXXX

目录

SSR分子标记在核桃遗传分析中的应用 ...................................................... 3

引言 ............................................................................................................................................ 6

1 材料和方法 .............................................................................................................................. 6

1.1 实验材料 ....................................................................................................................... 6

1.2 植物基因组DNA提取...................................................................................................10

1.3 SSR-PCR扩增 ............................................................................................................12

2 结果与分析 ...........................................................................................................................14

2.1 高质量核桃基因组DNA的提取 ......................................................................................14

2.2 SSR-PCR最佳反应体系和条件 .....................................................................................15

2.3 SSR-PCR扩增及电泳 .....................................................................................................15

2.4 30份材料的聚类分析 ................................................................................................17

3 讨论......................................................................................................................................18

3.1 DNA模板质量对SSR-PCR反应的影响.............................................................................18

3.2 PCR反应体系对SSR-PCR反应影响 ................................................................................18

3.3 银染 .............................................................................................................................19

3.4 遗传多样性分析 ...........................................................................................................19

3.5 现状与展望 ..................................................................................................................19

参考文献 ............................................................................... 21

文献综述 ............................................................................... 22

SSR分子标记的发现、原理、特点及应用 ................................................... 22

1 SSR分子标记的发现 ............................................................................................................23

2 SSR分子标记技术的原理和特点...........................................................................................23

2.1 SSR分子标记技术的原理 ..............................................................................................23

2.2 SSR分子标记技术的特点 ..............................................................................................23

3 SSR技术试验流程 ...................................................................................................................23

3.1 DNA提取.......................................................................................................................24

3.2引物设计.......................................................................................................................24

3.3 PCR扩增反应................................................................................................................24

3.4电泳及染色 ...................................................................................................................24

4 SSR在植物育种方面的应用 .....................................................................................................25

4.1遗传作图.......................................................................................................................25

4.2遗传标记.......................................................................................................................25

4.3建立DNA指纹,鉴定品种 ................................................................................................25

4.4进化和遗传多样性研究..................................................................................................26

参考文献 ............................................................................... 27

致 谢 ................................................................................. 29

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泰山医学院本科毕业论文 XXXXX

SSR分子标记在核桃遗传分析中的应用

引言

我国是核桃属(Juglans)植物的起源和分布中心之一。核桃属有20多个种,分4个组, 即核桃组( Sect. Juglans) 、核桃楸组( Sect. Cardiocaryon) 、黑核桃组( Sect. Rhysocayon) 和灰核桃组(Sect.Trachycaryon),其中核桃组包括核桃(J.regia)和铁核桃(J.sigillata) 2个种。我国核桃和铁核桃的种质资源非常丰富,为核桃的遗传改良和新品种培育提供了丰富的材料。以往对核桃种质资源的研究多依靠形态学[1]、细胞学[2]、酶学[1, 3]等手段。近年来,DNA分子标记由于具有多态性高、不受组织类别、发育时期和环境条件影响,越来越多地应用于核桃种质资源研究。吴燕民等[4- 5]用RAPD对核桃属种间亲缘关系及核桃种内不同地理生态型进行了研究,结果与经典分类学的结果基本一致。Fjellstrom等[6]用RFLPs标记分析了48份核桃品种的遗传关系,聚类分析表明,加州的核桃品种与法国和伊朗的品种的遗传关系较近,而与中国、日本的品种遗传关系较远。Nicese等[7]用RAPD标记分析了19个核桃品种的亲缘关系,表明RAPD标记能将准确反映彼此的系谱关系。Potter等[8]用ISSR标记分析了48个核桃品种的遗传关系后指出,由于ISSR呈显性遗传,在分析品种间的遗传关系上可能SSR标记更有优势。Woeste等[9]通过构建微卫星文库,从黑核桃中开发出30对SSR引物。Dang 等[10]应用SSR标记对主要来自欧美的48份资源进行了遗传多样性分析。目前,有关我国核桃组种质资源的分子标记研究报道很少。本实验采用8对SSR引物对我国部分核桃组种质资源进行分析,以探讨我国部分栽培核桃的遗传多样性,在此基础上可进一步进行分子系统分类的初步研究,为SSR标记进一步用于核桃的遗传演化、品种鉴定及分子标记辅助育种提供参考。 [1]

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1植物材料

本试验在山东省果树研究所进行。所提供的实验的核桃材料由山东省果树研究所提供,均取自国家果树种质泰安核桃板栗圃。取嫁接的核桃树的幼叶(大小约0.5cm?),放入1.5mL离心管中,-20°下在冰箱种保存备用,共计30份材料进行分析(表1.1)。

1.1.2所用试剂及药品的配置

6

泰山医学院本科毕业论文 XXXX

表1.1 试验中所用核桃材料编号及名称

编号 名称 编号 名称

1

2

3

4

5

6

7

8

9 元丰实生6号 16 泰山野核桃10号 元丰实生27号 17 泰山野核桃11号 元丰实生45号 18 泰山野核桃20号 元丰实生79号 19 (黑核桃)麦克 元丰实生90号 20 (黑核桃)迈尔斯 元丰实生93号 21 (黑核桃)帕米尔20 陕西核桃1号 22 (黑核桃)桑巴1号 陕西核桃2号 23 (黑核桃)桑巴一号S-1 陕西核桃10号 24 (黑核桃)海兰

10 陕西核桃14号 25 云新2号

11 陕西核桃64号 26 云新4号

12 陕西核桃85号 27 云新6号

13 泰山野核桃4号 28 云新8号

14 泰山野核桃5号 29 云新9号

15 泰山野核桃7号 30 云新10号

1.1.2.1 试剂

DNA提取所用试剂:

β-巯基乙醇,1.5×CTAB,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),无水乙醇,70%乙醇,氯仿:异戊醇(24:1),3M NaAc,EB,去离子水,RNase,1×TAE(10mL 50×TAE加水定容至500mL),50×TAE储存液,琼脂糖。

PCR扩增所用试剂:

PCR Buffer(10×),MgCl2(2.5mM),dNTP mixture(2.5mM),TaqE 2.5U/?L和5.0 U/?L(宝生物工程有限公司),灭菌无离子水,50-100ng模版DNA,引物(5pm/?L)SSR引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成,其序列由山东省果树研究所提供,其序列如表1.2: PCR产物的分离所用试剂:

硝酸银,无水碳酸钠,37%甲醛,冰醋酸,亲和硅烷,剥离硅烷,TEMED,75%乙醇,10%过硫酸铵,6%Acryglamide胶储存液,1×TBE,10mg/mL硫代硫酸钠。

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泰山医学院本科毕业论文 XXXX

表1.2 实验中所用到的SSR引物

Order Number Name Sequence(5?-3?) Tm GC% 0226-379 WGA001-F ATT GGA AGG GAA GGG AAA TG 55.3℃ 45.00% 0226-380 WGA001-R CGC GCA CAT ACG TAA ATC AC 57.3℃ 50.00% 0226-381 WGA009-F CAT CAA AGC AAG CAA TGG G 56.0℃ 47.40% 0226-382 WGA009-R CCA TTG CTC TGT GAT TGG G 58.0℃ 52.60% 0226-383 WGA069-F TTA GTT AGC AAA CCC ACC CG 57.3℃ 50.00% 0226-384 WGA069-R AGA TGC ACA GAC CAA CCC TC 59.4℃ 55.00% 0226-385 WGA089-F ACC CAT CTT TCA CGT GTG TG 57.3℃ 50.00% 0226-386 WGA089-R TGC CTA ATT AGC AAT TTC CA 51.2℃ 35.00% 0226-387 WGA118-F TGT GCT CTG ATC TGC CTC C 60.0℃ 57.90% 0226-388 WGA118-R GGG TGG GTG AAA AGT AGC AA 57.3℃ 50.00% 0226-389 WGA202-F CCC ATC TAC GGT TGC ACT TT 57.3℃ 50.00% 0226-390 WGA202-R GTC GGT GGT TCT ATC ATG GG 59.4℃ 55.00% 0226-391 WGA276-F CTC ACT TTC TCG GCT CTT CC 59.4℃ 55.00% 0226-392 WGA276-R GGT CCT ATG TGG GCA GTC GT 59.4℃ 55.00% 0226-393 WGA321-F TCC AAT CGA AAC TCC AAA GG 55.3℃ 45.00% 0226-394 WGA321-R TGT CCA AAG ACG ATG ATG GA 55.3℃ 45.00%

1.1.2.2 相关药品的配置

(1)SDS提取缓冲液

500 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris.Cl PH8.0,50 mmol/L EDTA PH8.0,2%PVP 20ml;4gSDS。

(2)1.5×CTAB提取缓冲液

1.5mol/L NaCl,100mmol/L Tris.Cl PH8.0,50mmol/L EDTA PH8.0,0.5%(v/v) ?-Mercaptoethanol,1.5%CTAB。

(3)甲酰胺上样缓冲液

98%甲酰胺,0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯睛,10mmol/L EDTA

(4)乙酸钠(3 mol/L .PH 5.2)

用800mL水溶解264g无水乙酸钠,用冰乙酸调节PH值至5.2,加水定容至1000mL,高压灭菌。

(5)EDTA(0.5 mol/L PH 8.0)

8

泰山医学院本科毕业论文 XXXX 将186.1g二水乙二胺二钠(EDTA-Na?2H2O)加入800ml水中,在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节溶液的PH值至8.0时,才会溶解。

(6)NaOH(10mol/L)

将400gNaOH颗粒慢慢加到800ml水中,边加边连续搅拌,由于10mol/L NaOH的配置涉及高度放热反应,有可能引起玻璃容器的破裂,作为一种预防措施,将烧杯至于冰上。当颗粒完全溶解后,用水定容至1L。在塑料容器中室温保存。无需灭菌。

(7)NaCl(5mol/L )

在800ml水中溶解292gNaCl,定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。室温保存。

(8)Tris-Cl(0.5mol/L)

称取60.4g Tris,溶于800ml水中,用稀盐酸准确调PH值至所需值,加水定容至总体积为1L,高压灭菌(Tris溶液的PH值随温度变化而变化,温度每升高1℃,PH值大约降低0.03单位,配置及使用时需注意)。

(9)10×TE储存液的配制

在800ml水中加入121.1gTris碱,37.2g乙二胺四乙酸二钠,用稀盐酸调PH至8.0,加水定容至总体积为1L,高压灭菌。

(10)50×TAE储存液的配制

? Tris碱 242g

? 0.5mol/L EDTA (PH 8.0) 100ml

? 冰乙酸 57.1ml

在500ml水中加入242gTris碱,溶解后加100ml 0.5mol/L EDTA (PH 8.0)和57.1ml冰乙酸,加水定容至总体积为1L。

(11)10×TBE储存液的配制

? Tris碱 108g

? 硼酸(BA) 55g

? 0.5mol/L EDTA(PH 8.0) 37.3 ml

加水定容至总体积为1L,用0.22?m滤膜过滤。

(12)40%Acrylamide胶储存液的制备

?

?

? Acrylamide 380g Bis-Acrylamide 20g ddH2O

在800mL水中加入380g聚丙烯酰胺(Acrylamide),溶解后加入20g甲叉—丙烯酰胺

9

泰山医学院本科毕业论文 XXXX (Bis-Acrylamide),加水定容至总体积为1L,4℃保存。

(13) 6%Acrylamide胶储存液的制备

? 尿素 420.4g

? 40% Acrylamide 150 mL

? 10×TBE 50mL

在300ml水中加入420.4g尿素,溶解后加入150mL 40% Acrylamide胶储存液,50mL10×TBE,加水定容至总体积为1L,4℃保存。用0.22?m滤膜过滤,4℃保存。

(14) 5%Acrylamide胶储存液的制备

? 尿素 420.4g

? 40% Acrylamide 125 mL

? 10×TBE 100 mL

在300ml水中加入420.4g尿素,溶解后加入125mL 40% Acrylamide胶储存液,100mL 10×TBE,加水定容至总体积为1L,用0.22?m滤膜过滤,4℃保存。

(15) 10%(m/L)的过硫酸铵(Ammonium Persulphata)

在10ml水中溶解1g过硫酸铵,贮存于4℃时,过硫酸铵在溶液中会慢慢衰老,故贮存液只能存放2-3周,常放在-20℃保存。

(16) RNase制备

每管装有25mgRNase粉末,稍以8000rpm离心10s,之后加入1mL双蒸水溶解,然后在沸水浴中煮15min,冷却直室温分管。

以上药品PH的调制在PH仪(PHS-3C型酸度计 上海伟业仪器厂)上进行。

1.2 植物基因组DNA提取

1.2.1核桃基因组DNA的提取与纯化

在提取过程中用到的吸头、研钵、提取缓冲液等先高压灭菌20 min,取出后待用,按照下述步骤提取基因组DNA。

(1)在65°C水浴锅(YLE-1000)中水浴中预热CTAB提取液。

(2)在液氮中研磨2~3 g新鲜或-20°C冷冻的样品材料。注意,要研成很细的粉末,动作要快。

(3)迅速加入20?L ?-巯基乙醇,再加如600?L CTAB提取液,混匀,放入65°C恒温水浴中,水浴30-60 min。其间每10min混匀一次。

(4)加入5mol/L的乙酸钾充分混匀,在冰浴中放置30 min中,4°C 12000rpm离心5min,吸上清。离心在离心机(Eppendorf 5410D)上进行。

10

泰山医学院本科毕业论文 XXXX 注意,对于幼嫩叶片此步可以省略。对成熟的老叶片需采用。

(5)加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),混匀,放置10 min,8000rpm常温离心5min。

(6)吸上清到新离心管中,再用氯仿/异戊醇抽提一次,8000rpm常温离心5min。

(7)吸上清到新离心管中,加入1/10倍体积的NaAc和2-2.5倍体积的无水乙醇,混匀;-20°C放置10~30 min沉淀DNA。

(8)10000rpm常温离心10min。

(9)倒掉乙醇,用1mL70%乙醇洗沉淀,10000rpm常温离心10min;然后再重复一次,倒掉乙醇,晾干或吹干DNA。

(10)在已经干燥的沉淀物中加入500?L双蒸水溶解DNA,再加10?L RNase,37°C水浴30min。再用等体积的氯仿/异戊醇抽提一遍.

(11)吸上清到新离心管中,加入1/10倍体积的NaAc和2-2.5倍体积的无水乙醇,混匀;-20°C放置10~30 min,沉淀DNA。

(12)10000rpm离心5min,弃上清,70%乙醇洗沉淀两次,晾干或吹干后,加入20?L双蒸水溶解DNA,-20°C冰箱保存备用。

1.2.2 DNA纯度与浓度的检测

0.8%琼脂糖凝胶的制备:

(1)称取0.4g左右的琼脂糖粉,将其置于三角烧瓶中。

(2)量取50mL 1×TAE,倒入烧瓶中。

(3)将烧瓶置于微波炉(Galanz wp800TL23-K3)中高火加热至沸腾,再转低火加热30s。

(4)将琼脂糖胶倒入EB瓶中,加入1-2?L EB。

(5)密封胶板放在水平台上并检漏,插上梳子。

(5)冷至50-60°C时灌胶。

(6)待胶完全凝固成固态,撕下胶带,将胶放入电泳槽中,使其完全浸没于缓冲液中,然后慢慢拔出梳子。

0.8%琼脂糖凝胶的电泳:

在一次性手套上点上7?L水,再加上1?L甲酰胺上样缓冲液和1?LDNA样品用枪头混匀,点样。以恒压U=100v在水平电泳仪(DYY-6C型 北京六一仪器厂)上电泳30min;利用凝胶自动成像系统(型号:AlphaImager(IS-2000) 美国)观察所DNA的纯度与浓度,并将DNA的量稀释成上PCR的量:50-100ng。

11

泰山医学院本科毕业论文 XXXX

1.3 SSR-PCR扩增

SSR-PCR的最优反应体系见核桃SSR反应体系的优化[11],本实验中只对Mg2+浓度和退火温度进行了梯度优化。Mg2+浓度梯度为1.5?L、2.0?L、2.5?L、3.0?L、3.5?L 。退火温度从低于Tm值5°C开始,每隔2°C设一个梯度。

PCR体系的配制在冰上进行;以上PCR反应在基因扩增仪(Eppendorf Mastercycler ep Gradient 德国和PTC100 美国 MJ Research公司)上进行。

1.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测

对优化反应体系后SSR-PCR扩增的产物进行1.5﹪琼脂糖凝胶电泳检测,看其是否有扩增产物,可否进行SSR分析。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

1.3.2.1 聚丙烯酰胺凝胶板的制备

玻璃板的清洗:

(1)用1M NaOH 溶液浸泡玻璃板2-3h,再用海绵蘸洗涤剂将玻璃板洗净;

(2)用自来水冲洗掉所有的洗涤剂,晾干。

梳子,夹条的清洗:

梳子夹条的清洗同玻璃板的清洗方法一样。

灌胶:

(1)放置两板于塑料平板上,工作面朝上;

(2)用约1.5mL 70%的酒精擦洗玻璃板,去除有机杂质。注意擦洗两板时用不同的手套,无毛餐巾纸防交叉污染;

(3)加750?L 70%的酒精于无毛餐巾纸上,再加16?L剥离硅烷于其上,迅速均匀涂抹在凹口板上;

(4)分别吸取10?L冰醋酸和10?L亲和硅烷,1.5mL70%的酒精于2mL离心管中混匀,加在平板上均匀涂抹;

(5)待两板充分干燥后,把两根0.3毫米厚的夹条放在平板的两侧;然后,把凹口板放在夹条上面,工作面朝下,注意不要让两板的工作面相互接触,在板中间对称加上4个夹子;

(6)用量筒量取50mL6%的PAGE,再加入160?L AP(过硫酸铵),把量筒内的液体倒入灌胶瓶中,慢倒防止产生气泡,再向灌胶瓶中加入50?L TEMED(NNN?N?-四甲基乙二烷),迅速拧紧瓶嘴,轻轻混匀,沿玻璃板点样端小心快速灌胶,出现波浪状时轻拍玻璃板防止出现气泡。待胶灌满以后,迅速反向插梳子,梳子露出0.1-0.5cm,在两耳朵中间夹两个夹子;

(7)静置1-1.5h,让胶充分聚合,(若让胶过夜,在胶的两口铺上湿滤纸,保鲜膜以防胶干)。

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泰山医学院本科毕业论文 XXXX 垂直电泳:

(1) 在电泳槽的正极槽中加入1×TBE缓冲液至槽的一半到三分之二之间;

(2) 胶聚合好之后,去掉板前面的夹子,小心拔出梳子。再对称的去掉两侧的夹子,然后,

将玻璃板移至垂直电泳装置;固定住,对称固定并夹紧;

(3) 轻轻加入1×TBE电泳缓冲液到上﹑下电泳槽中,同时检查缓冲液是否泄露;

(4) 预电泳:U=2500V,I=80mA,P=50W,稳功率预电泳30min。在预电泳前中后各吹气泡一

次。30min后在点样处插入梳子,梳子齿向下;

(5) 样品变性:25?LPCR扩增产物中加入5?L甲酰胺上样缓冲液,95℃变性8 min,然后立

即放入冰水混合物中,再转入-20℃冰箱中保存备用;

(6) 点样:用移液枪吸取5?L已变性的混合液缓慢注入点样孔中;

电泳:以U=2200V,I=50mA,P=30W,在垂直电泳仪:(DYY-10C型 北京六一仪器厂)上恒功率电泳2.5-3h。

1.3.2.2 银染

采用快速银染法染色,具体操作如下:

(1) 固定30分钟,电泳结束后,取下胶板,将平板与凹口板分开,将平板快速放入装有刚

配制的固定液(150mL 10%冰醋酸+1350mL双蒸水)的染色盒中。在摇床(TZ-03型)上慢速摇动30分钟。

(2) 洗涤:将平板快速移到装有1500mL 的水盒中以慢速摇动7分钟,水洗两次。

(3) 银染:将平板快速放入装有刚配制的银染液(1.2g硝酸银+1.5mL 37%甲醛+双蒸水

定容至1500mL)的染色盒中;以慢速摇动30分钟。

(4) 漂洗:将平板迅速拿出放入第二次水洗液中漂洗一下,时间小于5秒。

(5) 显影:将平板快速放入装有预冷的显影液(42g无水碳酸钠+1.5mL37%HCHO+200?L

10mg/mL硫代硫酸钠+1500mLddH2O)的染色盒中。以慢速摇动直到带出现为止。

(6) 再固定:将平板快速放入冰醋酸溶液中,再固定3分钟。

(7) 再洗涤:将平板快速放入水洗液中再洗涤2分钟。晾干,在观片灯(GDP型 北京京东医疗仪器有限公司)上照相。

1.3.2.3 数据统计和分析

有条带的记为1,没有条带的记为0,用相关软件分析。

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泰山医学院本科毕业论文 XXXX 2 结果与分析

2.1 高质量核桃基因组DNA的提取

提取的DNA的质量由它的长度和纯度决定。轻轻操作DNA溶液和快速冷冻植物组织对减轻机械剪切力和核酸酶切割非常重要,不能振荡,不能使用太细口的吸头,也不能吸得太快。多糖、蛋白质及木本植物中的酚类物质是植物DNA抽提中的主要污染物,会影响SSR-PCR的结果,提取材料要尽量使用幼嫩叶片。如果试验材料较老,多糖、蛋白含量就会高,在提取缓冲液中应提高?-巯基乙醇的用量,且在用氯仿/异戊醇抽提之前先用酚: 氯仿:异戊醇抽提一遍,这样去除蛋白较为彻底。所得DNA应为无色或灰白色,若呈褐色则有多酚类物质污染;对多糖含量高的材料,提取液中CTAB的浓度可增至3%或更高,也可用40%的乙醇洗涤。最后用70%的乙醇洗掉抽提中所用的有机溶剂。所提取的核桃DNA(图2.1),经RNase消化过并用无菌去离子水稀释后的DNA(图2.2)。

图2.1 核桃基因组DNA

1-泰山野核桃10号,2-麦克,3-泰山野核桃11号,4-迈尔斯,5-元丰实生27号,6-帕米尔20,7-云新2号,8-桑巴1号,9-陕西1号,10-云新4号,11-元丰实生79号,12-陕西14号

从图中可见:DNA条带清晰,拖尾现象很轻,所以用改良的CTAB法提取的核桃基因组DNA质量很高,可以用于后续的研究。

图2.2 稀释后的基因组DNA

1-名特,2-米斯,3-布特,4-麦克,5-艾玛,6-迈尔斯,7-橄榄球,8-福森,9-莎切尔,10-帕米尔20,

11-桑巴1号,12-桑巴1号(S-1),13-海兰,14-哈尔

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泰山医学院本科毕业论文 XXXX

从图2-2可知:经过RNase的消化作用,把所提取的核桃基因组DNA中的RNA完全消化,再用灭菌无离子水稀释,稀释后的核桃基因组DNA的浓度在50-100ng之间,可作为SSR-PCR扩增的模板。

2.2 SSR-PCR最佳反应体系和条件

优化的SSR反应体系(25?L):

灭菌无离子水 15.3?L

PCR Buffer(10×) 2.5?L

MgCl2(2.5mM) 2.0?L

dNTP(2.5mM) 2.0?L

上游引物(5pmol/?L) 1.0?L

下游引物(5pmol/?L) 1.0?L

模版DNA(100ng/?L) 1.0?L

Taq酶(5U/?L) 0.2?L

总体积 25.0?L

优化的SSR-PCR反应条件:

94°C 5min

94°47-62°C 1min 72°C 2min

72°C 10min

4°C 保存

通过对Mg2+浓度的优化,得到在25?L PCR反应体系中加入Mg2+(2.5mM)的最佳量为2.0?L;通过对退火温度的优化可知道各对引物的最佳退火温度为见表2.1

表2.1 试验所用8对SSR引物的最佳退火温度

引物名称 退火温度 引物名称 退火温度

379-380 54°C 387-388 62°C

381-382 47°C 389-390 57°C

383-384 56°C 391-392 56°C

385-386 56°C 393-394 49°C

2.3 SSR-PCR扩增及电泳

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泰山医学院本科毕业论文 XXXX

将PCR产物先跑1.5%的琼脂糖凝胶看跑的条带质量如何(图2.3),从图中看出产物质量较高的可以跑垂直电泳(图2.4)。从两幅图对比可见聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶的分辨率高,琼脂糖凝胶只能分辨一个范围值,而聚丙酰胺凝胶可以分开相差几个bp甚至一个bp的核酸。

图2.3 引物385-386 SSR-PCR的扩增产物

1-6元丰实生6号、27号、45号、79号、90号、93号,7-12陕西核桃1号、2号、10号、14号、

64号、85号,13-麦克,14-迈尔斯,15-帕米尔20

从图2-3可见引物386-386 SSR-PCR扩增产物的1.5%琼脂糖凝胶电泳只出来一条带,大小在100bp-250bp之间,并不能检测测出不同品种的遗传特异性。

图2.4 引物381-382 SSR-PCR扩增产物电泳图

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泰山医学院本科毕业论文 XXXX 1-6元丰实生6、27、45、79、90、93号,7-12陕西核桃1、2、10、14、64、85号,13-14泰山野核桃4、5号,M-Marker,15-18泰山野核桃7、10、11、20号,19-麦克,20-迈尔斯,21-帕米尔20,22-桑

巴1号,23-桑巴1号(S-1),24-海兰,25-30云新2、4、6、8、9、10号

从图2-4可知:引物381-382的扩增条带在100-300bp之间,不同材料有不同的扩增条带,说明不同材料其特异性扩增位点不同,表现为不同材料的遗传差异。

2.4 30份材料的聚类分析

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图2.5 30份材料的聚类分析图

L-元丰核桃后代6、27、45、79、90、93号;S-陕西核桃1、2、10、14、64、85号;Y-云新核桃2、4、6、8、9、10号;T-泰山野核桃4、5、7、10、11、20号;黑核桃:麦克、海兰、帕米尔20、迈尔斯、

桑巴1号、桑巴1号(S-1)

用8对SSR引物对30个材料检测出55个等位基因,在条带统计中把有条带的记为1,没有条带的记为0,用相应的软件计算样品间的遗传相似系数,依据遗传相似系数(Dice),用UPGMA法进行聚类分析,获得聚类图2.5。

聚类结果表明,在相似系数0.682时,可将供试的30份材料分为4个类群(SSR groups,简称Sg)SgⅠ类包括12个品种,占供试材料的40.00%.SgⅡ、Ⅲ、Ⅳ类各包括核桃材料的6个品种分别占20.00%。SgⅠ类先和SgⅡ类群聚到一起,有和其他三类聚到一起。

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泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX

当相似系数为0.793-0.863之间时,又可将SgⅠ类群分为2个亚群,SgⅠ-1和SgⅠ-2,

SgⅠ-1中包括所有的元丰核桃;SgⅠ-2中包括所有的陕西核桃品种。SgⅡ包括所有的云新

核桃品种,由于采集的样本来源较近,所以所有的材料是同一种类。SgⅢ、Ⅳ分别包括所有

的泰山野核桃和黑核桃,而且同组间的遗传复杂性高。由于黑核桃是从美国引进来的,所以

遗传相似性的聚类图表明其最后与中国的核桃品种聚合。从图的整体来看:不同品种的地域

差异性和人工选择的作用。

3 讨论

本实验中除了高质量的DNA模板外,PCR体系是影响本实验结果的重要因素,银染的条

件也至关重要。

3.1 DNA模板质量对SSR-PCR反应的影响

SSR-PCR反应必须以DNA为模板进行扩增,模板DNA可以是单链分子,也可以是双链分

子。就模板DNA而言,影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。

3.2 PCR反应体系对SSR-PCR反应影响

PCR体系的配制在冰上进行结果特异性会更强。

PCR的缓冲液是一个重要的影响因素。10×缓冲液中用的Tris ·HCL使Taq DNA 聚合

酶的作用环境维持偏碱性。其中KCL有利于引物的退火,溶液中的明胶是保护酶不变性失

活。

Mg2+非常重要,dNTP的磷酸基团以及引物、模板中带来的EDTA等螯合剂都要结合Mg2+。

Mg2+太少,降低了酶活性所需要的游离Mg2+;Mg2+浓度太高,非特异性产物太多。这是因为Mg2+

是Tap DNA聚合酶的激活剂,其浓度不仅影响酶的活性和合成的可靠性,而且还影响引物与

模板的结合效率和产物的特异性。

dNTP常用的浓度为20-200?mol/L,而且4种dNTP的浓度相等,以减少合成中由于某种

dNTP的不足出现错误掺入;dNTP浓度过高虽然可加快反应速度,但会增加碱基的错误参入

率。

使用Taq酶的量可根据DNA、引物及其他因素的变化进行适当的增减,酶量过多会使产

物非特异性增加,过少会使产量降低。

设计和选择高效而特异性的引物是PCR成败的关键。引物设计遵循的原则:(1)引物

长度长度为15-30bp。(2)G+C含量:G+C含量一般为40%-60%。(3)碱基的随即分配两个

引物间不应有互补序列。(4)引物的端部:引物的3?端决定引物的特异性,引物5?端决定

PCR产物的长度,引物的浓度一般为0.1-0.5?mol/L,引物浓度太高会引起错配和非特异性

产物扩增。

18

泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX

PCR扩增是由变性、退火和延伸3个步骤反复循环实现的。变性:变性是高温短时,一般为94°C 30s-1min,过高的温度和过长的时间会降低Tap E的活性。退火:退火的温度取决于引物的长度、碱基的组成和浓度。两引物的Tm有差别时,则根据Tm低的一方设定温度,退火时间为30s-2min。如果退火温度过低使引物与模板错配率升高;相反,若退火温度太高使两者配对困难,扩增的量就会减少。延伸:其温度取决于DNA聚合酶的最适温度,一般用常用72°C(70°C -75°C)。循环次数:一般为30个周期。如果循环次数过多(超过40个以上)会增加非特异性产物的量及其复杂度。

3.3 银染

配制溶液时所用到的双蒸水,在加入药品的时候要保持其恒温,不要过快的改变其温度,否则会影响药品的效果。硝酸银溶液现用现配,配制硝酸银溶液时要充分搅拌是硝酸银完全溶解,否则会出出现染色不均。银染整个过程中保持10°C所得到的结果是最理想的,一般情况下,可以将用到的双蒸水在冰箱中预冷。

3.4 遗传多样性分析

从图2-5可分析得到:从形态学上和坚果特征上来说元丰实生后代、陕西核桃与云新核桃是很相似的,元丰实生后代是新疆核桃的后代,可以推测陕西核桃有可能也是新疆核桃的后代。云新核桃是新疆核桃与云南本地的铁核桃杂交的后代,所以云新核桃有其亲本的遗传性状,在元丰实生后代与陕西核桃先交之后又与云新核桃相聚。云新核桃材料的采集来自不同的嫁接树木,有可能接穗来自同一种样本,所以它们的遗传相似系数为1。泰山野核桃无论从形态学上还是坚果特征上以及出仁率上都和以上三者有较大的差别,所以它和前三者相比遗传关系较远。而黑核桃是美国的一个品种,从形态学上和坚果特征上和前四类有了更大的区别,出仁率更低,它主要用来提供木材,所以它的遗传特性差别更大,最后才和中国的核桃相聚。

3.5 现状与展望

分子标记的问世和发展为定向地对动植物进行遗传操作和改良提供了可能,成为分子生物学和动植物遗传学研究中的有力手段。由于SSR 分子标记具有其自身的优势如多态性较高、等位基因数目多、呈共显性遗传,操作过程中PCR 技术的方便性使其表现出更大的优势,实验进程快速高效,结果稳定可靠,可提供的多态性信息量较高。因此,被广泛应用于多方面的研究。SSR 分子标记除了应用在动植物辅助遗传育种方面外,还在基因定位、克隆、 人类疾病诊断及预测、亲权分析、进化研究等领域均有重要的应用价值。但是,SSR 分子标记在应用方面,如果要克隆足够数量的SSR ,并对其进行测序和设计引物,没有足够的投资、人力和时间,是不可能实现的。因此,该技术的进一步应用受到了一定的限制。但是,在自然

19

泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX 界的进化过程中,各物种的基因组间仍存在相当大的相似性,完全可以利用这一特点,开发出可以在近缘种或不同科的物种间共用的SSR 引物,这对SSR 标记的发展应用将是一个新的突破,将会使SSR 分子标记应用范围更广、更简便。

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泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX 参考文献

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21

泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX 文献综述

SSR分子标记的发现、原理、特点及应用

摘要:本文主要对 SSR的发现、 原理、 特点以及在作物遗传育种中的应用作简要概述。 关键词:SSR;作物遗传育种;应用

核桃(Juylans regia L.)是世界主要的木本油料和著名的四大坚果(核桃﹑扁桃﹑板栗﹑腰果)树种之一,是我国重要的出口农产品,在国际市场上占有重要地位。我国是核桃的原产地之一,已有2000多年的栽培历史,核桃在我国分布广泛,全国25个省(区)都有栽培和分布,其面积和产量均居世界首位[1]。我国核桃栽培主要是普通桃核和铁核桃,铁核桃又称漾濞核桃﹑泡核桃,主要分布在云南﹑贵州全境和四川﹑湖南﹑广西的西部及西藏南部而其他地区栽培的都是普通核桃。核桃栽培历史悠久,在长期的进化与栽培过程中表现出特有的优良性状,如早实特性和孤雌生殖特性,蕴藏着许多非常宝贵的控制优良性状的基因资源。由于核桃寿命长且主要采用嫁接繁殖,不同地域间经常交换品种,导致同名异物和同物异名现象严重,研究快速有效的品种身份鉴定,保证品种真实性 、一致性,对于栽培植物品种的知识产权保护,确保品种在生产上的大力推广具有重要意义。采用分子标记技术是鉴定核桃品种和研究其亲缘关系的重要手段,利用分子标记技术进行核桃种品种及种属鉴别和多样性分析已有报道,但采用SSR标记鉴定核桃品种的研究较少[2-6]。广义的分子标

(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式)。狭义的分子标记概念只是指DNA标记,而这个界定现在被广泛采纳。本文中也将分子标记概念限定在DNA标记范畴。

分子标记能在DNA水平上反映植物遗传基础的差异,是植物遗传育种领域内的一项新兴技术[7]。SSR(Simple Sequence Repeat,简单重复序列)就是当今四大分子标记技术之一。19xx年,3个独立的研究小组几乎同时建立了这一技术,并且证实它作为位点特异遗传标记具有巨大潜力。SSR技术的特点是:呈共显性遗传;在数量方面没有生物学上的限制;其标记带型简单,记录的条带一致、客观、明确;采用PCR技术进行检测只需少量DNA样品,且质量要求不高,即使是部分降解的样品也可进行分析;每个位点均有许多等位形式;另外,它还具有多态性高、实验程序简单等优点。当今世界上四大标记系统的综合效用大小比较关系为:AFLP>SSR>RAPD>RFLP[8]。

SSRS简单序列重复,亦称微卫星DNA (microsatellite DNA)是建立在PCR基础上的第二代分子标记,它是一类短的串连重复序列(1-6个核苷酸),均匀地分布在整个真核生物

22

泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX 基因组中,侧面有保守的DNA序列[9]。SSR为共显性标记,兼具RFLP和RAPD的优点,克服了它们的不足,多态性比RFLP丰富,而且简便快速稳定性好,其重复性和可信度比RAPD高,适合植物品种鉴定[10-11]。本研究采用技术用筛选出的8对多态性引物应用到多个核桃品种,并在此基础上进行了遗传多样性分析,以期建立一套采用分子标记鉴定核桃品种的有效方法。

本文主要对 SSR的发现、 原理、 特点以及在作物遗传育种中的应用作简要概述。 1 SSR分子标记的发现

SSR ( Simple Sequence Repeats)又称微卫星DNA (Micro - satelliteDNA)标记,关于微卫星最早的报道是 19xx年 Skinner等在研究寄居蟹的DNA序列时发现了一些类似于 ( TAGG)n的简单重复序列,但在当时并没有引起很大注意[12]。直到19xx年,Ali等首次将合成的微卫星寡聚核苷酸用于人的指纹分析[13],微卫星才被关注;19xx年,Jefreys等进一步将微卫星发展成一种新的遗传标记系统;19xx年,人类遗传学家Iitt和IJuty研究了几个SSR位点上的12个等位基因时发现,这些序列中有3个(AAT)n或4个(AGAT) n核苷酸重复的序列,并将其命名为“Microsate Ilite” 即微卫星[14]。SSR这一技术一经问世 ,便很快在动植物的遗传分析中得到广泛应用。

2 SSR分子标记技术的原理和特点

2.1 SSR分子标记技术的原理

在真核生物的基因组中,每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大,因此形成其座位的多态性[15],并且每个SSR座位两端有一段保守的DNA序列,可以根据此保守序列设计引物,利用 PCR技术进行扩增,然后用高浓度琼脂糖凝胶或变性聚丙稀酰胺凝胶电泳进行分析。由于SSR多态性是由简单序列重复次数的差异引起的,因此在扩增的 PCR带上会出现小片段或不连续的带[16]。由此可见,SSR分子标记的基本原理就是要了解SSR座位两侧的核苷酸序列,寻找其中的特异保护区。

2.2 SSR分子标记技术的特点

SSR标记的优越性体现在: (1)遗传信息量大,一个 SSR座位最多可以检测到 26个等位基因;(2)呈孟德尔共显性遗传,可以鉴别纯合基因型和杂合基因型,提供完整的遗传信息;(3)态性丰富,数量充足;(4)可靠性强,仅需要少量的DNA,受外界因素干扰小等;(5)实验程序简单,耗时短,结果重复性好。此外,该技术还有交流方便等优点。但是SSR标记技术也具有不足之处,主要的缺点是必须依赖每类SSR两端序列测序设计引物,但总的来说它还是一种比较理想的分子标记技术。

3 SSR技术试验流程

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SSR技术试验流程主要包括 DNA提取、引物设计、 PCR扩增、电泳及染色、观察结果及统计分析等步骤。

3.1 DNA提取

可采用常规方法提取用于SSR分析的DNA样品 ,如CTAB法或常规的酚 /氯仿提取。目前研究发现用改进的CTAB法提取的DNA片段大而完整且无RNA污染也未发生明显的降解现象并能成功地进行SSR扩增,可以考虑用改进的方法代替传统的方法来提取和纯化 DNA[17]。提取完毕将样品保存在4 ℃下备用。

3.2引物设计

检测SSR标记的关键在于必须设计出一对特异的PCR引物,而开发SSR引物序列首先要建立DNA文库,筛选鉴定微卫星 DNA克隆,然后测定这些克隆的侧翼序列,最后根据SSR两侧序列在同一物种内高度保守的特性设计引物。在这一过程中,了解SSR座位两侧的核苷酸序列,寻找其中的特异保守区是重点所在。另外,从数据库或已发表的有关文献中查询,使用亲缘关系比较接近的其他物种的引物也是获得所需引物的有效途径。目前,一般的实验室都是利用现成的商业化的SSR引物进行PCR扩增的。

3.3 PCR扩增反应

在确定了引物的基础上就可以在PCR仪上对基因组中的SSR序列进行扩增。由于不同引物、 不同材料的扩增条件存在着差异,这就需要对引物浓度、Tag酶、Mg2 +浓度、pH值、 变性温度、退火温度等进行优化,以便获得清晰、准确、便于统计的电泳图谱。在这里值得一提的是最好选用一家公司同一批次的Tag酶以便增加可比性,减小不必要的误差。由于 Mg2 +是TagDNA聚合酶的激活剂,所以它的浓度不仅影响酶的活性和合成的可靠性而且还影响引物与模板的结合效率和产物的特异性[18]。高浓度的Mg2 +虽然可以保证PCR反应的顺利进行,但有时产物带有明显的背景,适当降低Mg2 +浓度则可以有效地消除背景,其作用比提高退火温度更明显[19];在实验时要根据引物、材料的不同确定合适的Mg2 +浓度。退火温度是指引物与模板特异结合的最佳温度,是任何PCR 反应最重要的参数[20]。退火温度对SSR影响也较大,退火温度低,引物和模板结合特异性较差,出现的条带可能增多;退火温度高,引物和模板结合特异性增加[21]。并且在SSR扩增反应中,不同的材料,引物浓度不相同;相同的材料,由于引物浓度的差异,退火温度也是不相同的,所以在试验时要设计几个不同的温度梯度,反复调试,选择最佳退火温度。目前,一般SSR试验采用的退火温度在55 ℃左右。

3.4电泳及染色

PCR产物需经电泳分离、染色显示后才能进行谱带观察、统计。用于分离琼脂糖凝胶电泳的类型可以分为垂直型和水平型两种,前者由于制胶简单,加样方便,可操作性强等优

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泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX 点而更受欢迎。电泳系统对温度的要求不是很高,但是对浓度的要求比较严格,SSR电泳琼脂糖浓度一般在1.5%~2.0%之间,聚丙烯酰胺常用浓度为6%;染色可用同位素、银染、EB或SYBR Green I等方法,在大多数实验室中,常用硝酸银或荧光染料溴化乙锭(EB)染色,染色后在可见光(银染)或紫外光(EB染色)下进行观察记录,一般而言,聚丙烯酰胺和银染的分辨效果比琼脂糖和溴化乙锭要高[22]。最后利用相关软件进行有关的数据分析。 4 SSR在植物育种方面的应用

4.1遗传作图

在大麦中已研究了60个RAMP,鉴定出45个SSRS位点,其中5个位点与RFLP位点共分离,增加了40个新位点到RFLP图谱中,这些位点主要分布在大麦第6条染色体上[23]。Gupta等把25个随机扩增的微卫星位点作图到玉米的9条染色体上[24]。

4.2遗传标记

Devos用构成γ-麦醇溶蛋白假定基因的(CAA)n微卫星和(CAG)n(CAA)n复合微卫星框内的前侧专一DNA序列为引物并结合其反转引物(reverse primer)扩增r-麦醇溶蛋白基因的微卫星序列,也开发了一套引物来扩增低分子量(LMW)麦谷蛋白基因的微卫星序列。找到了离(Glu-3) -1B 1.5cM的SSRS标记[25]。Yu等在大豆中找到了与抗大豆花叶病毒基因(Rsv)紧密连锁的SSR标记Sm176,遗传距离为0.5cM,用Sm176检测了(感×抗)F2107株个体和其它一系列具Rsv等位基因的近等基因系材料,进一步验证Rsv具有多个等位基因点[26]。该项工作为Rsv基因的克隆奠定了基础,也为育种家在早代筛选出育种群体中的Rsv个体,迅速把抗性基因转移到优良品种中去及积累多个抗性基因到某一品种中去提供了有力的检测手段,Sm176本身是一个编码大豆低分子量热激蛋白(HSP, hot shock protein)基因。

4.3建立DNA指纹,鉴定品种

Yanagisawa 用地高辛标记的SSRS互补寡聚核苷酸作探针研究了43份栽培大豆和14份野生大豆材料的多态性和亲缘关系。用(AAT)6作探针获得了每个栽培品种的明显不同的指纹,每个品种中各个体间的DNA指纹基本相同;用(CT)8(GAA)5和(AAGG)4作探针在野生大豆材料中基本上未发现多态性,但在豆科各物种之间呈多态性[27]。SSR标记和同功酶及其它标记的研究结果一致,栽培大豆和野生大豆之间显示出低水平的多态性,说明它们的基因组结构非常接近。有报道用放射性同位素标记的与SSRS互补的寡聚核苷酸作探针已对鹰嘴豆(Weis-ing,1992)、甜菜(Schmidt,1993)、油菜(Poulsen,1993)、蕃茄(Vosmen,1993)等作物进行了DNA指纹分析,用(GATA)4作探针在鹰嘴豆的13份材料中有多态性,在15个蕃茄品种中呈多态性。此外,该探针的DNA指纹能区别鹰嘴豆、油菜和甜菜的特殊个体。在植物中

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泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX 用各种重复序列和重复单位数目不同的SSRS作探针的DNA指纹可用来鉴定品种和估计不同品种间的遗传距离。

4.4进化和遗传多样性研究

微卫星DNA已被用于大麦、大豆、水稻、小麦的遗传多样性研究。一系列的研究结果表明SSRS位点的等位基因数且比其它任何标记所揭示的等位基因都多,SSR等位基因数目与重复单位数目有明显的正相关,SSR序列位点标记比RFLP和RAPD标记更能有效地揭示遗传多样性,特别适用于其它类型标记所揭示变异水平低的物种。

SSRS是较理想的遗传标记,尽管做起来需要设计和合成引物,化费较大,但是由于它具有①异常丰富;②随机均匀地分布在整个基因组;③多态性强;④可通过PCR迅速测定分析,易于使用;⑤引物序列公开发表易在各实验室中广为传播使用等特点。使得SSRS特别适用于大量样本的研究,为群体及进化研究,种质评估,育种中分子标记辅助选择(DNA marker-assisted seleetion, MAS)提供了强有力的工具。

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泰山医学院本科毕业论文 XXXXXX

致 谢

衷心感谢我的指导老师XXXX老师。

本文的研究工作是在XXXX老师的悉心指导下完成的,从论文的选题、研究计划的制定、技术路线的选择到结果的统计分析,各个方面都离不开XXXXX老师热情耐心的帮助和教导。在实习阶段的日子里,XXXX老师认真的工作态度,诚信宽厚的为人处世态度,都给我留下了难以磨灭的印象,也为我今后的工作树立了优秀的榜样。

三个月的学习和科研工作,不仅使我的知识结构和科研能力上了一个新台阶,更重要的是,各方面的素质得到了提高。而这一切,都要归功于XXXX老师的深切教诲与热情鼓励。值此论文顺利完成之际,我首先要向我尊敬的指导老师XXXXX老师表达深深的敬意和无以言表的感谢。同时感谢工作室的阿姨们在我实习期间给予的帮助。

感谢和我一个实验室的XXXX、XXX和山东农业大学的XXXX、XXXX和XXXX同学。她们灵活考虑问题的方式,严谨的解决问题的态度,扎实的专业知识功底,认真的科研态度都给我留下了深刻的印象,没有他们无私的帮助,我是无法完成论文工作的。

最后深深的感谢呵护我成长的父母。每当我遇到困难的时候,父母总是第一个给我鼓励的人。回顾20多年来走过的路,每一个脚印都浸满着他们无私的关爱和谆谆教诲,4年的在外求学之路,寄托着父母对我的殷切期望。他们在精神上和物质上的无私支持,坚定了我追求人生理想的信念。父母的爱是天下最无私的最宽厚的爱。大恩无以言报,惟有以永无止境的奋斗,期待将来辉煌的事业让父母为之骄傲。我亦相信自己能达到目标。

最后,向所有关心我的亲人、师长和朋友们表示深深的谢意。

XXXX

2009.6.16

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