Western blot实验报告
摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法
方法：western blot
结果：见后文
结论：western blot能很好地分离蛋白
关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白
Western blot test report
Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transfer
Results: see below
Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein
前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。本试验采用湿法转移。免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。大多数应用前者。本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
1 试剂与仪器
1.1 试剂（所有试剂均供两组用）
1.1.1 8%电泳分离胶的配制
H2O 6.9ml
30%丙烯酰胺 4.0ml
1.5mol/L Tris 3.8 ml
10%SDS 0.15 ml
10%过硫酸胺溶液 0.15 ml
TEMED 0.015 ml
1.1.2 5%浓缩胶配制
H2O 5.5ml
30%丙烯酰胺 1.3ml
1.0mol/L Tris 1.0 ml
10%SDS 0.08 ml
10%过硫酸胺溶液 1.08 ml
TEMED 0.015 ml
1.2 仪器 夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸
2 试验步骤
2.1 蛋白质的提取
2.1.1取小鼠组织0.2g，用生理盐水洗去表面毛发等杂物，剪碎，加入生理盐水2ml；
2.1.2 移入匀浆器，匀碎
2.1.3 用移液枪移取1ml匀浆液入1号EP管中；
2.1.4 离心12000转，10min
2.1.5 取1号EP管中层清液入2号EP管
2.1 SDS-PAGE电泳分离
2.1.1 2片玻璃片以清水洗净，再以卫生纸擦干，欲做胶的那一面以酒精洗净，再以拭镜纸擦干净，最後將2片玻璃片贴好。將2片玻璃片放入造胶台中，注意2片玻璃片的底部需相当平整，再將水加滿，观察5分钟后水外漏的比率，若外漏速率太快，则拆掉重新摆放。倒掉2片玻璃片间的水，用滤纸將水吸除，尽量完全吸干，避免胶体浓度不足
2.1.2 使用塑胶滴管將配好的溶液加入製胶台中，約加到绿色橫桿下缘，尽量不要太多，否則齿梳會直接刺到下层胶(上胶预留2cm空間) ，在上面铺一层水，与空气隔绝，加速凝固。
2.1.3倒掉H2O，用滤纸將水吸干，但不要碰到胶，用塑胶滴管吸取上胶的溶液，滴入至玻璃片全滿的位置，將齿梳插入，含有acrylamide之溶液有毒，避免接触到身体，此時液体可能会喷出
2.1.4等待20分钟，可以观察烧杯留下一些剩余液体，可以判断凝固程度，如果烧杯中的残留液体凝固，则代表胶体已经凝固，拆除齿梳。
2.1.5紅色在左邊，黑色在右邊，小格之running buffer需加到全滿；大格的running buffer之需要加到淹過白金线即可。蓋上上蓋，转到电压那部分，上胶跑90V/70V；下胶跑110V/100V。(看到marker顏色分開即转至110V)，跑80min。
2.2 转移蛋白质到硝酸纤维素膜上（电转移）
2.2.1 切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液浸泡5min使没有气泡。
2.2.2 剪2张滤纸与胶尺寸大小相符，将其与海绵一起浸泡在转移缓冲液中。
2.2.3 打开转移槽的胶板，依次放入：a. 一张浸湿的海绵；b. 一张用转移缓冲液饱和的滤纸；c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心的赶走滤纸和胶之间的气泡；d. 硝酸纤维素膜，正面对着胶，在胶和膜的右下角剪一小角，以标明方向；e. 一张用转移缓冲液饱和的滤纸；f. 一张浸湿后的海绵。
2.2.4 小心的合上胶板，并立即放入转移电泳槽中。加转移缓冲液至满。
2.2.5 插好电极，注意正负极方向，胶侧为负，NC膜侧为正。打开电泳仪开关调至稳压60v，电泳2h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
2.3 染色、脱色
2.3.1 转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层
2.3.2 用铅笔或剪刀在NC膜的上缘作好标记，将NC膜放入盛有丽春红的培养皿中8分钟，再经自来水脱色，观察转移结果。将转移后的凝胶放入氨基黑染液中染色1分钟，再经洗脱液脱色，观察转移结果。(注意电泳缓冲液 、 转移缓冲液要回收)
3 实验结果
3.1 显色后的凝胶及印迹膜
图1：显色后的凝胶及印迹膜
4 讨论
5.1 从实验结果我们可以看到，凝胶上的有几个样品的蛋白分离程度还可以，但是中间大部分都模糊不清，甚至是没有跑出多少蛋白。为什么一样的实验条件却做出不一样的结果呢？可能的原因有：①没有处理好样品，导致提取的蛋白量不多，或者不纯；②加样时意外打到电泳液中等
5.2 本实验所用的免疫印迹方法，其方法简单，方便迅速，特异性强。ELISA是由抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。并且抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出现可见反应。
5.3 转移之后，蛋白质在硝酸纤维素膜两面分布不完全相同，因此显色反应同时注意两面的信号。
第二篇：Western-Blot(免疫印迹法)实验方法步骤
Western Blot（免疫印迹法）实验方法步骤
发布日期:20##—8-25 热门指数:4360
Western Blot(免疫印迹法)
主要包括以下4个基本步骤：
n 样品制备
n 电泳分离
n 蛋白的膜转移
n 免疫杂交与显色――蛋白检测
溶液和试剂
n 1X 磷酸盐缓冲液（PBS)
n Modified RIPA buffer
Tris-HCl: 50 mM， pH 7.4 ; NP—40: 1% ;Na-deoxycholate： 0。25% ;NaCl： 150 mM ；EDTA： 1 mM ；PMSF: 1 mM ；Aprotinin, leupeptin, pepstatin： 1 microgram/ml each ；Na3VO4: 1 mM ；NaF： 1 mM
n 1X SDS 样品缓冲液
62.5 mM Tris—HCl （pH 6。8 于 25°C）， 2％ w/v SDS, 10%甘油，50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝
n 转移缓冲液
25 mM Tris base, 0。2 M 甘氨酸， 20％甲醇 (pH 8。3）
n 10X Tris缓冲盐 (TBS)
准备1L 10X TBS： 24.2 g Tris base, 80 g NaCl；用1N HCl调pH为 7。6
n 脱脂奶粉或BSA
n 甲醇
n TBS/T缓冲液
1X TBS， 0。1％ Tween—20
n 封闭缓冲液（TBS/T）
1X TBS, 0.1％ Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA
n 一抗的稀释
1X TBS， 0。1％ Tween-20 加 5％ BSA (多抗）或 5％脱脂奶粉（单抗）
Note: 一般来说， BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率
样品制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法,其余的样品制备方法参阅相关文献.
1．培养细胞或药物处理.
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3．加入1X SDS样品缓冲液(6—well plate, 100 µl /w或 75 cm2 plate, 500-1000 µl/瓶）,刮落细胞，转移到Ep管.注意:冰上操作。
4．超声 10～15秒剪切DNA以减低样品粘性。
5．煮沸样品5 minutes。
6．离心12000g, 5 min,取上清.
7．电泳分离:上样15µl～20 µl 至 SDS-PAGE 胶 (10 cm x 10 cm)电泳。
如要定量检测某蛋白的表达水平,应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/100 mm dish/150 cm2 flask）裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4~15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照,通常用beta—actin。
注意：一般上样20～30 µg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白,可加大上样量至100µg，但电泳条带易拖尾,可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。
电泳分离(参照SDS-PAGE电泳方法)
转膜
杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节.应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜.用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物,在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0。45µm和0。2µm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45µm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2µm的膜了，如用0。45µm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测.但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移.前者操作容易，转移效率高;而后者适用于大胶的蛋白转移,所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤.
1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min.
注意:如检测小分子蛋白，可省略此步,因小分子蛋白容易扩散出胶。
2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min.如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
3。 装配转移三明治：海绵®3层滤纸®胶®膜®3层滤纸®海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记:胶放于负极面（黑色面）.
4。 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面）,加转移缓冲液，插上电极，100V，1h(电流约为0。3A）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5。 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
免疫杂交与显色
1．用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动.
2．置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。
3．15ml TBS/T洗3次(5 min/T）。
4．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
6．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动.
7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
8．15 ml TBS洗1次.
9．蛋白检测（显色法或发光法，按相应试剂说明操作).
注意事项：
1．操作中戴手套，不要用手触膜。
2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。
3．如检测小于20kD的蛋白应用0.2µm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。
4．某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱,此时可用1。0% BSA代替Tween—20。
5．关于封闭剂的选择：5％脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.3～3％ BSA in PBS:低的内源性交叉反应性.
6．如用0。 1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。
如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。
Western-blot 实验步骤与ELISA差不多,WB只是在膜上做而已。
注意事项
关键是膜的质量与封闭液。