遗传学实验教案

时间:2024.3.23

河南师范大学生命科学学院

生物科学、生物技术和水产养殖学专业

课程教案

课程名称:遗传学实验

讲授人:周延清 教授

杜启艳 副教授

邓传良 副教授

南 平 讲师

20xx年4月

《遗传学实验》课程基本信息

(一)课程名称:遗传学实验

(二)学时: 周3学时

(三)预修课:动物学、植物学、细胞生物学、生物化学、免疫学和微生物学等

(四)使用教材:

刘祖洞主编:《遗传学实验》(第2版),高等教育出版社,19xx年5月版。

(五)教学参考书:

卢龙斗,常重杰,杜启艳等主编:《遗传学实验技术》,中国科学技术大学出版社,19xx年1月版。

(六)教学方法:课堂讲授,启发式教学,提问式教学,研究性教学等。

(七)教学手段:普通讲授式教学。

(八)考核方式:平时成绩,占总成绩占20%

(九)学生创新精神与实践能力的培养方法:让学生做设计实验和创新实验,培养学生的动手

能力;让学生与老师互动与交流、学生之间交流和沟通,使学生在课堂上讲解,提高学生的沟通能力和表达能力。

(十)其它:执笔人:杜启艳,邓传良,南平,周延清

审定人:周延清

批准人:

第一部分 基础实验

实验一 植物细胞减数分裂

一、实验目的:

(1) 学习并掌握制备减数分裂玻片标本的方法和技术;

(2) 了解高等植物的花粉形成中的减数分裂过程,观察其染色体的动态变化。

二、实验原理:

在高等生物性细胞形成过程中发生连续两次的核分裂,而染色体只复制一次,最终产生四个小孢子或精细胞,或是分别产生一个大孢子或卵细胞及三个退化的极体。在分裂过程中,可以辨认染色体形态和数量上的动态变化,为遗传学的研究提供了直接和间接的的证据。

三、实验材料及药品:

玉米(Zea mays,2n = 20)的花药

显微镜、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、酒精灯、吸水纸、固定液(甲醇:丙乙酸 = 3:1)、无水乙醇、醋酸洋红

四、实验步骤:

1、取材和固定:选取适当大小的花蕾,置于Carnoy’s 固定液中固定12-24小时(视材料不同而不同)。

2、染色和压片:用蒸馏水将从固定液或从70%酒精保存液中取出的花蕾冲洗数遍,然后剥开花蕾,放在载玻片上,加一滴醋酸洋红在花药上,用镊子将材料夹碎(直到看不到碎片),染色5-10分钟。加盖玻片,使染液刚好布满载玻片与盖玻片之间成一薄层(不可过多,过多花粉母细胞会逸出盖玻片边缘),上面放吸水纸,用拇指适当加压,把周围的染色液吸干。

3、镜检:在显微镜下查找花粉母细胞,二分体、四分体,花粉粒以及各个时期的细胞。

五、实验作业:

可观察到两类细胞:

一类为花粉母细胞,大、圆

一类为花药壁细胞,小、矩形

绘制观察到的植物细胞减数分裂不同时期的典型细胞(示染色体动态特征)。 思考题:减数分裂过程中遗传物质的变化(形成的四个花粉粒,遗传物质是一样的吗?)

实验二 果蝇形态和生活史的观察

一、实验目的

1.了解果蝇生活史中各个阶段的形态特征,观察果蝇的几种常见突变型。

2.掌握鉴别雌、雄蝇的方法。

3.学会实验果蝇的饲养管理,以及实验处理方法和技术。

二、实验原理

普通果蝇为双翅目昆虫,具完全变态,具有以下特点:生长迅速、生活史较短,每12 天左右即可完成一个世代;繁殖能力较强,在短时间内即可获得多数子代,有利于遗传学的分析;容易饲养,饲料如玉米粉等简便易得,常温下容易生长、繁育;突变性状多达400 个以上,而且多数是形态变异,便于观察。因此,果蝇是遗传学研究中常用的实验材料,积累了许多典型材料。

三、材料

野生型和几种常见的突变型果蝇成虫(♀、♂)装片,果蝇卵、蛹装片,以及饲养的野生型果蝇的成虫和幼虫。

四、实验器具和药品

用具:双筒解剖镜、放大镜、麻醉瓶、培养瓶、白瓷板、新毛笔

药品:乙醚、酒精等

五、实验步骤:

1.生活史的观察

用放大镜从培养瓶外观察果蝇生活史中的四个时期:

成蝇→卵→受精卵→幼虫

↑ 精子↗ ↓

蛹←三龄幼虫←二龄幼虫

(1)卵:羽化后的雌果蝇一般在12小时之后开始交配,交配后两天开始产卵。果蝇的卵呈椭圆形、在背面的前端伸出一对触丝;

(2)幼虫: 蜕皮 蜕皮

↓ ↓

1龄幼虫 → 2龄幼虫 → 3龄幼虫(三者形态相似、只是大小不同)

(3)蛹:幼虫生活7-8之后开始化蛹,果蝇的蛹呈梭形,前部有两个呼吸孔、后部有尾芽,起初为淡黄色,3-4天后为褐色,以示要羽化了。

(4)成虫:头(一对大的复眼、三个单眼和一对触角)、胸(三对足、一对翅和一对平衡棒)、

腹(背面有黑色横纹、腹面有腹片、外生殖器)三部分,全身生有体毛和刚毛。

2.果蝇的雌雄性鉴别

成蝇雌雄性别的辨别可依据如下几个特征(表1):

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3.果蝇几种突变型的观察: 残翅(vg)、檀黑体(e)、白眼(w)

正常果蝇:红眼黑身长翅;突变型:残翅(vg):翅退化,部分残留不能飞,vg位于Ⅱ号常染色体;檀黑体(e):体呈乌木色、黑亮,e位于Ⅲ号常染色体;白眼(w):复眼白色,w位于X染色体。

六、作业:

绘制果蝇的生活史图

实验三 果蝇唾腺染色体观察

一、实验目的:

(1)练习剖取果蝇三龄幼虫唾液腺的方法。

(2)掌握制作果蝇唾液腺染色体标本的技术。

(3)观察果蝇唾液腺染色体的形态特征。

二、实验原理:

唾腺染色体是处于体细胞同源染色体的配对状态,它们的巨大性是由于重复分裂后的众多染色线没有分开的结果,因此又称为多线染色体。一般来说,多线染色体是处于永久性前期中的一种体细胞染色体配对形式。它普遍存在于双翅目昆虫某些物种的幼虫唾腺细胞内。唾腺染色体经染色后,出现深浅不同、疏密各别的横纹,这些横纹的数目和位置往往是恒定的,代表着种的特征。如染色体有缺失、重复、倒位、易位等,很容易在唾腺染色体上识别出来。

三、实验材料器具和药品:

材料:果蝇的三龄幼虫

用具:双筒解剖镜、显微镜、解剖针、载片及盖片、酒精灯等

药品:1%改良的苯酚品红、生理盐水(0.7% NaCL)

四、实验步骤:

1.唾腺的剥取:选取发育良好的三龄幼虫(化蛹之前,常爬出培养基,附在瓶壁上),放在有一滴生理盐水的载玻片上。两手各持一解剖针,左手压住幼虫后端1/3 处,固定幼虫,右手按住头部黑点处(口器)稍后,轻缓地向前移动,头部被扯开,唾腺随之拉出,为一对透明的棒状腺体。

2.染色压片:在载玻片上除去幼虫的其它组织,将唾腺移到干净的载玻片上(将幼虫的其它部位用吸水纸吸干净,不移动唾液腺),吸去生理盐水,滴加改良的苯酚品红染色15-20min。盖上盖片,用滤纸吸去多余的染液,用拇指压片。

3.观察

五、作业:绘出显微镜下观察到的染色体略图

实验四 粗糙链孢霉的顺序四分子分析

一、实验目的

1. 学习和掌握链孢霉培养技术和杂交方法。

2. 验证分离定律和连锁互换定律。

二.实验原理:

粗糙链孢霉(Neurospore crasa)属于真菌类,其营养体由单倍体(n=7)成,生殖方式有两大类:无性繁殖和有性繁殖。其中有性生殖方式形成的二倍性(2=14)合子可减数分裂形成4个子细胞,每个子细胞又经一次有丝分裂形成2个子细胞,这样,共形成8个子细胞,进一步发育可形成8个子囊孢子,并且,8个子囊孢子有序地直线排列在子囊中。另外,在粗糙链孢霉中存在有野生型(Lys)和赖氨酸依赖型(Lys)两种类型,其中,Lys的菌丝为红色,其子囊孢子成熟的较快;Lys的菌丝为白色,其子囊孢子成熟的较慢。这样,当Lys 与Lys发生有性生殖时,在某一特定时候,就可以观察到黑(以“+”表示)白(以“—”表示)孢子,其中++++————和————++++为非交换型子囊孢子;++——++——、——++——++、++————++和——++++——为交换型子囊孢子。因此,粗糙链孢霉杂交实验可以在显微镜下直接观察基因的分离现象。

交换型子囊孢子的出现是由于基因Lys或Lys与着丝粒之间发生了交换,所以,通过计算交换型子囊的百分数就可以推算出Lys基因与着丝粒之间的相对距离:

重组值=交换型子囊数/(交换型子囊数+非交换型子囊数)×100%×1/2

三.实验材料和器具:

Lys和ys菌株;一般培养基和添加有赖氨酸的培养基、培养瓶、接种环等。

四、实验步骤:

1. 菌株活化:23℃培养5-6天。

2. 杂交培养:25℃培养2-3周。

3. 挑取子囊果。

4. 挤出子囊果的内含物。

5. 压片:加少量生理盐水,轻盖上盖玻片,让其自然落下即可。

6. 观察、并将观察到的各种类型子囊数记录下表1中。

7. 计算

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+—++——+—+—+

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六、作业:

写出实验报告,计算Lys 基因与着丝粒之间的重组值。

实验五 人类染色体组型分析

一、教学目的:

1.通过对人类染色体组型进行分析,使学生初步学会对染色体进行分析的方法。

2.初步掌握人类染色体的数目和形态特征。

二、实验原理:

染色体核型通常是指生物体所有可测定的表型特征总称,包括染色体的总数、染色体组的数目、组内染色体基数、每条染色体大小、形态。它是物种特有的染色体信息之一,具有很高的稳定性和再现性。染色体组型分析是对染色体进行分组、对核型的各种特征进行定量和定性描述,是研究染色体的基本手段之一,可以用来鉴别真假杂种、对研究染色体结构变异、染色体数目变异、B染色体、物种的起源和植物的遗传进化,基因定位等有很大的参考价值。进行核型分析可以利用有丝分裂染色体或减数分裂染色体,其中最常用的是有丝分裂染色体。

三、实验材料:

人类染色体正常染色体(46,XY)、21三体(47,XY+21)、Klinefelter综合征(47,XXY)和Turner综合征(45,X)的染色体图片。

四、实验步骤:

1.剪取染色体照片 剪取染色体时,要从大到小依次剪取,每个染色体的周围要留出一圈白边,以便于粘贴。

2.染色体配对 进行染色体配对时,先通过目测比较染色体长度和着丝粒的位置,然后进行配对。

3.染色体排列 进行染色体排列时,将已配对的染色体从大到小按长度顺序排列,平放于白纸上。排列的原则是:总臂长度由长到短。凡臂长相等的,短臂长的排列在前,短臂短的排列在后。

4.调整后再编号 染色体编号时,将每对染色体编成一个号,由大到小从1号编至22号。编号时要注意X染色体与6、7号染色体的区别,三者均为亚中着丝粒型,但可以根据X染色体的大小介于6号和7号染色体之间,以及它的着丝粒更接近中部,将X染色体与6、7号染色体区别开来,并从中挑出。Y染色体与21、22号染色体相似但21、22号染色体的长臂常分开,而Y染色体长臂的两条染色单体常并拢,依据此特点,可以将Y染色体挑出。注意将性染色体单独排列。

5.染色体的分组 染色体分组时,可以根据染色体的形态、大小和着丝粒的位置这两个特点,将染色体分成7组。分组完成后,应在每组染色体的下面用铅笔划一道横线,并注明染色体序号,再在每组的横线中间处,用英文字母(A→G)注明组号。

6.粘贴 粘贴时,同一对染色体应靠拢,两对染色体之间应留出一定距离,而各组染色体之间则应留出较大的距离。

实验注意事项:

1.实验操作过程中,应遵循先排列、再分组、后粘贴的原则,不要边排列边分组边粘贴。否则,

发生错误之后,已粘贴上的染色体不容易取下来。

2.粘贴染色体时,操作者不要喘粗气,以免将已经排列好的染色体吹散、丢失。

实验六 蚕豆根尖微核检测技术

一、实验目的

(1)了解微核检测的原理及其在病理遗传学上的意义。

(2)掌握小鼠骨髓细胞和蚕豆根尖的微核检测技术。

二、实验原理

微核是染色体畸变的另一种表现形式。为有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体片断,在间期细胞的细胞质中形成的一个或多个圆形或杏仁状结构。通过一定制备方法,可以在间期细胞中进行观察和计数。70年代初,Matter和Schmid等首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定怀疑具有诱变活力的化合物,并称之为微核测定法。

许多理化因素,如辐射、化学药剂等作用于分裂细胞而产生微核。在间期细胞中,微核呈圆形或椭圆形,游离于主核之外,大小在主核的1/3以下。微核的折光率及细胞化学反应性质和主核一样,也具有合成DNA的能力。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的染色体断片产生的,但是已有实验证明,整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在有丝分裂过程中行动滞后,在分裂末期未能进入主核,便形成了独立于主核之外的核物质块。当子细胞进入下一次分裂间期时,它们便浓缩形成主核之外的小核,即形成微核。已经证实,微核率同作用因子的剂量呈正相关。所以可用简易的微核计数来代替繁杂的中期畸变染色体计数。由于大量新的化合物的合成,原子能的应用,各种各样工业废物的排放等都存在污染环境的可能性,欲了解这些因素对机体潜在的遗传危害,需要一套高度灵敏,技术简单易行的测试系统来监测环境的变化。只有真核类的测试系统更能直接推测诱变物质对人类或其它高等生物的遗传危害。在这方面,微核测试是一种比较理想的方法。目前,国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价,以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。华中师范大学生物系自19xx年开始,建立了一套蚕豆根尖微核技术(参见附录6),并首次用于监测水环境污染,经鉴定已列入国家《生物监测技术规范(水环境部分)》。

本实验介绍了小鼠骨髓细胞微核测试。

三、实验材料

成年小鼠(雌雄不限)。

四、实验器具和药品

1.器具 显微镜、刻度离心管、吸管、载玻片、离心机、注射器、烧杯、解剖工具。

2.药品 环磷酰胺(1mg/m1)溶液、生理盐水、小牛血清、甲醇、1/15mol/L磷酸缓冲液(pI-H6.8)、Giemsa原液。

五、实验步骤

1.微核的诱发 按40μg/g体重的剂量对小鼠腹腔注射环磷酰胺溶液,诱发微核(若进行其它因子测定或自然环境测定按下续步骤直接操作)。

2.取股骨处理24—36小时后,采用脱颈椎处死小鼠,迅速剥取两根股骨,剔净肌肉等软组织,并擦净股骨上的血污。

3.冲洗骨髓细胞 剪去股骨两端的骨骺,用注射器吸取2—3ml预温到37℃的生理盐水,然后将针头插入股骨腔,尽量将骨髓细胞冲洗出来,置于10ml试管中,把细胞团块用吸管吹打散。然后将细胞悬液转入离心管内,弃去残渣。

4.洗涤细胞1000rpm离心5分钟,收集细胞.弃去上清液,尽可能不留残液。滴加2—3滴灭活小牛血清,将细胞轻轻吹打均匀。

5.制细胞悬液 1000rpm离心5分钟,收集细胞,弃去上清液,再加1滴灭活小牛血清,用吸管轻轻混匀。

注:以上两步骤的小牛血清也可用1%柠檬酸钠代替,但两步骤须在15分钟内完成。

6.涂片 滴一小滴细胞悬液在洁净的载玻片上,涂成均匀涂片,在空气中干燥。

7.固定 放入甲醇中固定10分钟,取出干燥。

8.染色 用1:10 Giemsa染液染色10分钟,迅速用缓冲液洗片,干燥后即可观察。

六、实验结果

选择细胞密度适中,铺展均匀,染色良好的地方,随机观察计数。骨髓细胞中有核的细胞均出现微核,但是在只有少量胞浆的有核细胞中,微核常很难与正常核叶及核的突出物相鉴别,而在无核的嗜多染红细胞的胞浆中,微核却易于辨认。因为嗜多染红细胞为骨髓细胞中一类主核刚被排出的年幼红细胞,在它完成最后一次有丝分裂后几小时,将主核排出。而由染色体断片形成的微核则保留在细胞中。因此,一般观察计数嗜多染红细胞中的微核。

嗜多染红细胞经Giemsa染液染色呈灰蓝色。成熟红细胞呈桔红色。微核大多数呈圆形或椭圆形。边缘光滑整齐,嗜染性与核质一样.呈紫红色或紫蓝色。每只动物计数1000—2000个嗜多染红细胞。观察含有微核的嗜多染红细胞数,微核率以千分率表示。一个嗜多染红细胞中出现一个以上微核,仍按一个细胞计数。

正常小鼠嗜多染红细胞微核率为2.8‰±0.41,即正常小鼠嗜多染红细胞微核率为5‰以下,超过该值为异常。

七、实验作业

统计你所测定的材料的微核率。综合本班所有同学的测定结果,判断你所测定的物质是否具有诱变能力。

实验七 人类X小体检测

一、实验目的:

1. 掌握人类X小体玻片标本的制作方法。

2. 观察与识别X小体的形态特征及所在部位,为进一步研究人体性染色体的性别畸变与疾病提供参考。

二、实验原理:

19xx年,巴尔(Barr)等人在研究猫的间期神经细胞时发现雌猫体细胞核膜边缘有一个可被碱性染料染色的小体,而雄猫中没有。进一步研究发现,所有哺乳动物雌性个体体细胞中都有这种小体,科学家们认为这种小体是两条X-染色体在间期时有一条(或这条的大部分)处于凝集或不活动状态,形成了这种X-染色质,所以又称X小体或Barr 小体(=n-1,其中n是某一生物中X染色体的数目)。在人类中,正常女性性染色体为XX,所以只有一个X小体;而正常男性性染色体为XY,所以没有X小体。据此,可根据X小体的有无及个数来鉴定胎儿性别和性别畸形。

三、实验材料:

口腔粘膜细胞

四、实验用具及试剂:

显微镜、载片、盖片、吸水纸、牙签、 生理盐水、蒸馏水和龙胆紫染液。

五、实验方法和步骤:

1. 取材:首先让受检者用水漱口数次,以尽可能除去细菌及杂物,然后用灭菌的牙签从女性口腔两侧颊部刮取上皮粘膜细胞,在原位刮取2-3次,第一次的刮取物弃之,将第二次、第三次的刮取物分别置入一滴干净的生理盐水中,并涂布在干净的载片上、室温自然晾干。

2. 滴加1-2 滴龙胆紫染液,在室温下染色1-2分钟,用水冲洗掉燃料,室温自然晾干。

3. 100倍镜下镜检。

六、作业:

绘制4-5个典型细胞,以示口腔颊部粘膜细胞的Barr 小体的形态部位。

七、注意事项:

1.刮取口腔粘膜细胞时用牙签的钝端,以免划破被测试者口腔;

2.染色时间一定不要超过2分钟,以免染色时间过长,致使X小体与其背景色反差过小或无反差而不易观察到X小体。

3.油镜使用完毕后,一定要妥善清洗干净镜头。

第二部分 综合性实验

实验八 小白鼠骨髓细胞染色体的制备和观察

一、 实验目的

1.掌握动物骨髓细胞染色体标本的制备方法。

2.了解小白鼠染色体的形态特征。

二、 实验原理

在骨髓细胞中,有丝分裂的指数是相当高的,因此可以直接得到中期细胞而不必像血淋巴细胞那样要经过体外培养。通过骨髓得到染色体是比较简便的,一般也无需无菌操作。在临床上多用于白血病的研究,在实验条件下,这种染色体是机体内真实情况的反映,而且用骨髓制片的方法易于观察毒性物质在体内对细胞和染色体的影响。

直接制片法,是直接从骨髓中取出细胞,经压片法或空气干燥法制片。所谓空气干燥法,实际上是将细胞经过秋水仙素处理─低渗处理─充分的固定─滴片等步骤之后在载玻片上得到染色体制片的技术。有时,有人把滴片的步骤叫做染色体分散,也有人把这一步和随后的干燥称为空气干燥法。“空气干燥”就是滴片后,不加热或任何处理,使载片在室温下自然干燥的方法。空气干燥法是一个十分有用的基本技术,要熟练掌握。

三、 实验材料

小白鼠

四、 实验器具和药品试剂

1.用具

冰箱、离心机、恒温水浴锅、显微镜、分析天平、药物天平、试管架、离心管、吸管、烧杯、量筒、注射器(1ml、5ml)、5号针头、载玻片、解剖盘、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、切片盒、切片架、纱布。

2.药品

秋水仙素、柠檬酸钠、氯化钾、冰醋酸、甲醇、磷酸缓冲液、Giemsa、甘油。

五、实验方法和步骤

1.秋水仙预素处理:取骨髓前3~4小时先给小白鼠经腹腔注入0.1%的秋水仙素,注射剂量为4毫克/每公斤动物体重。

2.取骨髓:经秋水仙素处理的小白鼠,可用损伤脊髓法处死,然后用剪刀剪开大腿上的皮肤和肌肉,取出大腿骨和胫骨,用一小块纱布来回搓干净附在骨上的肌肉碎渣。

3.取骨髓细胞:剪掉股骨两端膨大的关节头,然后用装有1%柠檬酸钠溶液的5ml注射器插入股骨的上端,缓慢注射冲洗骨髓腔,冲洗的溶液一滴滴从股骨下端渗入到离心管中,反复冲洗

直至股骨变为灰白色,经1000rpm离心10分钟后弃去上清液(注意:每次离心前都要平衡)。

4.低渗:在离心管中加入加0.075MKCL溶液5ml,用吸管将细胞吹散打匀,在37℃恒温水浴锅中低渗30分钟。

5.固定:低渗处理后的材料,加入1ml固定液并用吸管吹匀进行预固定,然后1000rpm离心10分钟,吸去上清液,留0.2ml沉淀物,用吸管吹散沉淀物,沿管壁加固定液至6毫升,冲匀后静止固定20分钟,即第一次固定。按上述条件离心,去上清液,再次加入固定液至6ml,进行第二次固定。20分钟后离心吸去上清液,留0.2ml沉淀物,再往沉淀物中滴加4滴固定液,冲匀制成细胞悬液。

6.滴片:取事先在冰箱中预冷的载玻片(载玻片须经硫酸洗液浸泡10天以上,经清水冲洗,用蒸馏水浸泡),滴2~3滴细胞悬液于粘有冰水的载玻片上,用嘴吹气,使细胞迅速分散。将载片插放在切片架上晾干。

7.染色:取2张制片平放在玻璃板上,用10:1Giemsa染液染色20分钟,流水冲洗后晾干即可镜检。

8.观察:用中倍镜选择分散适度,不重迭的染色体分裂相,转高倍镜详细观察小白鼠染色体的形态特征,并计算2n的染色体数目。

六、实验作业

1.绘小白鼠骨髓细胞染色体图。

2.每人交两张制作好的染色体玻片标本。

实验九 作物有性杂交

一、实验目的

1.了解有性杂交原理。

2.了解小麦花器构造和开花生物学特性。

3.掌握小麦有性杂交技术。

二、实验内容

植物有性杂交是人工创造新的变异类型最常用的有效方法,也是现代植物育种上卓有成效的育种方法之一。通过将雌雄性细胞结合的有性杂交方式,重新组合基因,借以产生各种性状的新组合,从中选择出最需要的基因型,进而创造出对人类有利的新种。用小麦作为实验材料,利用遗传性状不同的亲本进行交配,以组合两个或多个亲本的优良性状,杂交时先选好合适的杂交组合,并在合适的时期进行去雄和授粉,待作物成熟后收获种子,统计结实率。

三、实验用品

纸袋 曲别针 剪刀 铅笔 纸牌

四、实验步骤:

1.选穗:选择发育良好、健壮、具有本品种特征的主茎穗或大分蘖穗作母本。一般在麦穗抽出、茎部离叶鞘约半寸左右时去雄较为合适。气温较高时或后期抽穗的可适当提早。选中穗后,用镊子打开穗中部两侧的小花,检查其花药。若为绿色,这样的穗在去雄后第2-3天授粉最易成功。花药过嫩时去雄容易损伤花器;过老时去雄花粉囊易裂散粉而发生自交。在实际操作中去雄的穗子宁可嫩些不可过老。

2.整穗:母本穗选定后,先用镊子去掉穗子上下部发育不好的小穗,仅留中部5-6对大的小穗,再将所留小穗中上部的几朵小花除去,每小穗只保留基部两朵发育最好的小花,剪去芒。

3.去雄(剪颖去雄法):在整穗时要把去雄花朵的护颖和内外颖剪去五分之二,然后从剪口中把花药用镊子取出。此法去雄较快,但要注意勿损伤柱头。去雄后套上透明纸袋,纸袋下部开口沿穗轴折合,用大头针别住,防止自然杂交。注意不要别住剑叶。然后挂上标牌,用铅笔写上母本名称、去雄日期、操作者学号或姓名。

4.采粉及授粉:当去雄花朵的柱头呈羽毛状分叉并带有光泽时。表明柱头已经成熟,应即进行授粉。授粉工作一般在去雄工作后的第二天上午8点以后或下午4点以前进行。如去雄后遇到阴雨天,温度较低,可在去雄后3-4天进行授粉。

选将要开花小穗的父本穗为供粉穗。将供粉穗取下剪颖,使其花药露出来,促其散粉,把剪颖去雄的隔离纸袋的顶端剪成敞口,而后把散粉的供粉穗从敞口处插入纸袋,凌空捻转数下,使

花粉散落于柱头上,然后将供粉穗取出或不取出,纸袋口用大头针别合。纸牌上写明父本名称和授粉日期。

5.授粉情况检查:小麦授粉后1-2小时,花粉粒就在柱头上开始萌发。约经40多小时就可以受精。在受粉后的第3-4天可以打开纸袋检查子房的膨大情况。如果子房已膨大,内外颖合拢,说明已正常受精。如果内外颖仍然开张子房不见膨大,说明未能受精。受精后一般不需要继续隔离,可以除去纸袋。但为了防止意外损失和收获时易于辨认可以不除去纸袋,连同母本穗一起收回。

6.收获:按组合收,写明组合名称、种子粒数,保存好以备播种。

五、作业

在农作物育种工作中,有性杂交是常用的一种技术。本实验通过对小麦选穗,整穗和去雄,采粉和授粉的练习,要求掌握其的有性杂交技术,为以后进行农作物性状遗传规律的研究和从事作物的育种工作提供实验手段。

实验十 植物多倍体的诱发与鉴定

一、实验目的

(1)了解人工诱发多倍体植物的原理、方法及其在植物育种上的意义。

(2)初步掌握用秋水仙素诱发多倍体的实验技术和多倍体的鉴定方法。

二、实验原理

多倍体广泛地存在于植物界,目前已知被子植物中有三分之一以上的物种是多倍体,如普通小麦是异源六倍体,棉花是四倍体,此外还有烟草等,这些部是自然界存在的多倍体。多倍体产生的途径除自然发生外。也可以采用高温、低温、嫁接、切断和射线处理等物理方法和化学药剂处理方法,在这些方法中以化学药剂处理最为有效,如秋水仙素,萘嵌戊烷、异生长素、植物激素、富民隆等,都可诱发多倍体,其中应用最广泛、效果最好的是秋水仙素。

秋水仙素是由百合科秋水仙属的秋种番红花一一秋水仙素(Colchicum autumnale)的种子和器官中提炼出来的一种生物碱。化学分子式为C22H25NO6?1H2O。它具有麻醉作用,对植物的种子、幼芽、花蕾、花粉、嫩枝等可产生诱变作用,它的作用机理是抑制细胞分裂时纺缍体的形成,使复制后的染色体不能拉向两极,细胞不能继续分裂形成两个子细胞,从而导致染色体加倍,形成多倍体细胞,在此基础上进一步发育成多倍体植物,多倍体植物可以通过有性繁殖进行繁殖下去。用人工方法诱导的多倍体,可以得到一般二倍体没有的优良性状,如大粒、大穗、内含物量增加、抗病性强等。人工培育的三倍体西瓜、三倍体甜菜、八倍体小黑麦已在生严上厂泛应用。

对多倍体的鉴定,除了检查染色体数目变化外,形态特征的变异也是一个重要方面。多倍体植物的气孔、花器、花粉粒、种子、果实等部分明显变大,气孔数目减少而密度变稀,同源多倍体育性有一定的降低,所以同源多倍体中有部分畸形的不育花粉粒。

三、实验材料

(1)洋葱(Allium cepa 2n=16)、大麦(Hordeum spp. 2n=14)、大蒜(Allium sativum 2n=16)、西瓜(Citrullus vulgaris 2n=22)、玉米(Zea mays 2n=20)、蚕豆(Vicia faba 2n=12)等的种子、鳞茎。

(2)葡萄植株、插条或其它果树植株。

四、实验器具和药品

1. 器具 显微镜、剪刀、培养皿、载玻片、盖玻片、吸水纸、培养箱、镊子、纱布、脱脂棉、酒精灯、测微尺。

2. 药品 秋水仙索(0.1%和0.025%)、HCl (mol/L)、硝酸银(O.1%一0.2%)、碘化钾(1%)、固定液、醋酸洋红或卡宝品红染色液。

五、实验步骤 12

1.植物根尖多倍体的诱发 将玉米、大麦等植物种子洗净后用水浸泡1—2天,然后摆放在铺有湿润滤纸(或纱布)的培养皿中置于25一28℃条件下发芽,当根长到1cm时取出洗净,把水吸干后移到0.01%一0.1%的秋水仙素溶液中,使植物根部浸在药液中,根尖朝下,25℃条件下处理直到根尖明显膨大为止。另外设加入清水的作为对照,然后取出材料洗净,用卡诺氏固定液固定1小时,以备镜检。若用洋葱作材料时,必须先剪去老根,然后置于盛满水的瓶口上。当长出新的不定根后,再用秋水仙素处理。

2.多倍体植物的诱发

(1)处理种子:将植物的种子放在0.1%秋水仙素溶液中浸种24小时,取出种子用自来水冲洗2—3次,然后将种子移到放有被0.025%秋水仙素溶液润湿了的吸水纸的培养皿中,为避免蒸发,加上盖放入20℃培养箱内发芽,一般处理两天就可长出幼苗。对干燥种子比浸过种的种子要多处理1天,种皮厚发芽慢的种子应先催芽后进行处理。用秋水仙素能阻碍根系发育,所以对已发芽的种子应用较低的秋水仙素溶液处理较短的时间。处理后取出幼苗,用自来水缓缓冲洗以免损伤,然后将幼苗移栽到大田或盆钵内,同时播种未经处理的种子幼苗作为对照。

(2)处理幼苗:对于发芽慢的种子在出苗后处理效果更好。以西瓜为例:先将二倍体西瓜籽浸种催芽。当胚根长到1—1.5cm时,将胚根倒置于0.2%一0.4%秋水仙素溶液的培养皿中置25℃温度下浸渍20一24小时,注意处理时需要用湿滤纸将根盖好,避免失水。处理后的幼苗,经水洗进行栽种或砂培。另外也可以采用田间处理幼苗的方法,即当幼苗子叶展平时。每天早晚用0.25%或0.4%秋水仙素溶液滴浸生长点各一次,每次1—2滴,连续处理4天,遮阴保持湿度。以上两种方法如果成功可获得四倍体西瓜,再用它和二倍体西瓜杂交就可育成三倍体无籽西瓜。

(3)处理芽:选用葡萄植株或插条等果树的顶芽或腋芽生长点进行处理。将芽部固定一个蘸有0.5%一0.7%的秋水仙素棉球(最好外罩一塑料袋防止蒸发)连续处理2—3天后,去掉棉球,反复用清水冲洗生长点。也可将蘸有秋水仙素的棉球涂抹生长点,待进一步生长后,再进行观察和鉴定。

3.多倍体的鉴定

(1)细胞学鉴定:对已经加倍和未加倍(对照)的植株根尖或茎尖制成临时片,观察有丝分裂中期的染色体数目。对收获的可能为同源多倍体的大粒种子发芽制成根尖压片,进行检查染色体数目。

(2)形态鉴定:观察植物多倍体植株,分别比较鉴定二倍体和多倍体在形态上的主要区别。

(3)气孔鉴定:在同源多倍体植物叶片背面中部划一切口用尖头镊子夹住切口部分,撕下一薄层下表皮,放在载玻片上,加一滴蒸馏水铺平,盖上盖玻片,制成表皮装片,用同样方法,制作一张二倍体植物的表皮装片作为对照,镜检比较多倍体和二倍体气孔和保卫细胞的大小,

各测定30个计算出平均值。统计气孔数目,各观察10个视野,计算气孔密度。气孔保卫细胞的大小测定用测微尺测量:

目镜测微尺每格长度(?m)?

镜台测微尺格数?10目镜测微尺格数

气孔密度测定方法:将叶片表皮制片于显微镜下检查,计算每个视野气孔数,移动制片重复10次,求出平均值。视野面积的计算,用目镜测微尺量出视野直径,按公式S??r求视野面积。得每平方毫米叶面积的气孔数。

(4)保卫细胞内叶绿体数目测定:取叶下表皮于载玻片上,滴加0.1%一0.2%AgNO3溶液数秒后,加盖玻片,在显微镜下观察保卫细胞内的叶绿体数目。

(5)花粉粒的鉴定:从同源多倍体和二倍体植株上采集花粉放入45%醋酸中,用滴管各吸取一滴花粉粒悬浮液分别放到载玻片上,加上碘化钾溶液,盖上盖玻片制成花粉粒制片,然后镜检,观察同源多倍体和二倍体花粉形态大小是否整齐、有无畸形,若大小差异不明显时,可用测微尺各测定30个花粉粒大小,求平均值。

六、实验结果

将镜检结果填入表26.1。

七、实验作业

(1)对实验结果进行分析。

(2)绘制一多倍体植物中期染色体图像。

(3)交1—2张好的多倍体根尖制片。

(4)简述多倍体诱发的基本原理及意义。

遗传学实验教案

2

第三部分 创新性性实验

实验十一 植物基因组DNA的提取(CTAB法)

一、实验目的和要求

学习高等真核生物基因组DNA的快速提取方法,了解真核基因组DNA的有关特性

二、实验原理

黄化苗经液氮研磨,可使细胞壁破裂,加入去污剂CTAB和EDTA消化细胞,可使核蛋白体解析,然后使蛋白和多糖杂质沉淀,DNA进入水相,再用酚、氯仿抽提纯化。

三、实验用品

1、 设备及器具:冷冻离心机、高速离心机、冰盘、研钵、塑料烧杯、200μl微量加样器、水浴锅(65℃)、枪头及EP管

2、 实验材料:水稻或其它植物材料

3、 药品

(1)提取缓冲液

100mmo/L NaCl

100mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

50mmol/L EDTA

1%疏基乙醇

(2)20%SDS

(3)5mol/L醋酸钾

取29.5ml冰醋酸,用KOH颗粒调校至PH4.8,加水至100ml,室温保存,不可灭菌。

(4)酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)

(5)异丙醇

(6)70%乙醇

四、实验方法

SDS法:

1.称取0.1g小麦黄化苗叶片于预冷的研钵中,加入3倍体积(W/V,约300μl)提取缓冲液,在冰盘上研磨。

2.研碎后转入一EP管中,再加约300μl提取缓冲液。

3.加入20%SDS至终浓度为2%,约66μl。

4.轻轻混匀后于65℃水浴,10min。

5.加入1/10体积的5mol/L醋酸钾(约66μl),于水浴中反应30min。

6.离心(15krpm,10min,4℃)。

7.取上相转入一新的EP管中,用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提一次(上下晃动几次即可)。

8.离心(12krpm,10min,20℃)。

9.取上相转入一新的EP管中,加入等体积的异丙醇,于室温下反应5~10min,其间将管至少颠倒5次。

10.离心(15krpm,10min,4℃)。

11.弃上清液,用70%乙醇冲洗沉淀物,真空抽干或吹干,最后溶于1×TE中(约50μl)。 CTAB法:

1.准 备: 将CTAB溶液于65℃水浴中预热。

2.研 磨: 方法1. 5.0g样品液氮中研磨成粉末, 倒入50ml离心管中。 方法2. 取磨碎的植物干燥组织0.7-0.8g于50ml离心管中。

3.裂 解: 加入约20ml预热至65℃的CTAB, 混匀, 使组织尽量分散于65℃水浴中反应60-90min., 不时小心摇动离心管。

4.抽 提: 待冷至室温25℃后,加入等体积氯仿:异戊醇(24:1),小心颠倒Eppendorf管几次至有机相由无色→绿色→黑色(深绿色)。

5.离 心: 室温下(<25℃), 8,000rpm离心10min.,将上清液移至另一离心管中, 若上清液仍为绿色, 应重复抽提步骤, 直至上清液变为透明色。

6.沉 淀: 加2/3体积异丙醇, 小心混匀, 用1ml吸头移出DNA。

7.离 析: 置于400ul 1M NaCl, 必要时56℃助溶. (必要时用4ul 10mg/ml RNase A稀释至50ml(20U/ml)处理)

8.沉 淀: 加入2×体积无水乙醇, 混匀, -20℃沉淀过夜。

9.离 心: 15,000rpm离心2min. 沉淀用70%乙醇洗涤2次。

10.溶 解: 将DNA吹干, 加入适量TE-8.0或无菌ddH2O, 于65℃水浴中15min.以溶解DNA。

11.电泳检测

五、实验说明

1.研磨后应迅速加入提取液,因为提取液中含EDTA,能够螯合Mg2+等二价阳离子,防止破碎细胞中的DNA酶降解DNA。

2.提取过程中,转移上清液时所用的枪头最好用剪刀将尖头剪去,以避免对DNA造成的不必要的机械损伤。

3.干燥DNA时,要注意,过干或过湿都不利于DNA的溶解。

六、作业和思考

电泳检测DNA,分析结果,分析实验成败的原因。

实验十二 果蝇杂交试验及其设计

一、实验目的:

1. 学习果蝇杂交技术和统计方法。

2. 学习实验方案的设计。

3. 验证和加深理解分离定律、自由组合定律和伴性遗传三个基本规律。

二.实验原理:

1. 分离定律:果蝇一对相对性状的杂交实验,如:长翅和短翅是果蝇的一对相对性状,控制该性状的基因(Vg/vg)位于Ⅱ号染色体上,其中,显性基因Vg控制的是长翅,它对隐性基因vg为完全显性。因此,VgVg×vgvg→F1:Vgvg,全长翅(自交)→F2:VgVg: Vgvg: vgvg=1:2:1,表型为长翅:残翅=3:1。以上是典型的孟德尔分离定律。

2. 自由组合定律:果蝇两对相对性状的杂交实验。除了残翅与长翅之外,灰身与黑体是果蝇的又一对相对性状,由位于Ⅲ号染色体上的一对等位基因(E/e)控制,其中E为完全显性,控制的是灰身。根据自由组合定律,则有:EEvgvg×eeVgVg→F1:EeVgvg,全长翅灰身(自交)→F2:EEvgvg: Eevgvg:eeVgvg: eevgvg=9:3:3:1.

3. 伴性遗传:果蝇的红眼与白眼又是一对典型的相对性状,并且,控制果蝇的眼色基因(W/w)是位于X染色体上,其中,红眼(W)为完全显性。与以上两种定律最大的区别在于:伴性遗传中控制性状基因是位于性染色体上,表型受性别的影响,因此,正反交结果不一样。这在理论上我们已作了详细的讲解,在此就不多讲。

三.实验用具及材料:

实验材料:纯系的野生型及不同的突变型果蝇:长翅、残翅、白眼、红眼等。

实验用具:培养瓶、麻醉瓶、放大镜、毛笔、滤纸、白磁板、乙醚等。

四.实验设计:

处女蝇的选育:实验杂交的雌蝇应为处女蝇,雌蝇孵出后,一般在12 小时内不进行交配,因此获得处女蝇的方法是:将已孵化出的果蝇从培养瓶中移出(注意一个也不能留下),以后12 小时内孵化出的雌蝇均为处女蝇,即可分别收集做杂交亲本用。如能在8 小时内收集更为可靠。一般于前一天晚上8 点以后将所有果蝇从培养瓶中移出,第二天早上8 点收集到的雌蝇均为处女蝇。

(一)分离规律的验证——一对因子的杂交和测交实验

选取具有一对相对形状的果蝇,如长翅与残翅杂交,观察后代中这一对相对性状的遗传表现,从而验证孟德尔分离规律,实验步骤如下:

1.选取残翅处女蝇与野生型雄蝇各3-5 只为亲本,放入装好饲料的培养瓶

中,瓶上帖好标签,注明杂交组合、日期及实验者姓名等。第二天检查一

下亲本的成活情况,如有死亡应给予补充。

2.7-8 天后,移出全部亲本,观察并核对亲本性状。

3.待培养瓶中成蝇孵出后,检查F1 代的有关性状。每2-3 天检查一次,并

做记录,共检查3 次,约100-200 只,检查后的果蝇移去处理。

4.选取F1 代果蝇3-5 对移入新培养瓶中,进行兄妹交配繁殖(此时不一定选用处女蝇),同时选F1 代的处女蝇与野性亲本的雄蝇(残翅型)各3-5只,移入另一个新培养瓶中,进行测交实验。

5.7-8 天后,从以上两组杂交的培养瓶中分别移出亲蝇,然后对各瓶中孵出的F2 代果蝇记录不同类型的数目,每隔一天检查一次,检查计数的果蝇应立即移去处理,如此连续统计3-4 次,约需100-200 只。

6. 用χ2(卡平方)法检验实验结果。

(二)自由组合规律的验证——两对因子的杂交实验

选取具有非同一连锁群的两对相对性状的果蝇,如灰身长翅与檀黑身残翅、或其他类型者杂交,观察后代中这两对相对性状的遗传表现,从而验证孟德尔自由组合规律。实验步骤如下:

1. 选取灰身长翅的处女蝇与檀身残翅的雄蝇各4~5 只,放入装好饲料的培养瓶中,瓶外 贴好

标签,注明杂交组合、日期及实验者姓名等,第二天要检查亲本成活的情况。

2.7~8 天后移出亲本,并观察核对亲本的性状。

3.待出现F1成蝇后,观察有关性状的表现及数量。以后每隔两天统计纪录一次,共约4 次,要

求达到100~200 只。检查记录过的果蝇要及时移去处理。

4.取F1雌雄蝇4~5 对移入一个新培养瓶中,使其交配繁殖。

5.7~8 天后移出F1雌雄蝇,待F2成蝇孵出后,每隔两天观察统计记录一次,要求统计到200~300

只。

6. 用χ2(卡平方)法检验实验结果。

(三)伴性遗传实验

a、正交

1.取野生型处女蝇与白眼雄蝇各3~5 只,放入新培养瓶中,贴好标签,注明杂交组合、日期和

实验者姓名。

2.~8 天后移去亲本蝇,并核对其性状。

3.F1成蝇孵出后,每隔两天取出观察与统计一次,共4~5 次。统计过的果蝇移去处理。

4. 3~5 对F1雌、雄蝇放入新培养瓶中,使其繁殖。同时选取F1红眼处女蝇与亲本白眼雄蝇各

3~5 只,放入另一新培养瓶中进行回交。

5. 查F2及B1 F1的果蝇表现型,按性别及颜色的红白分别鉴定, 并记录统计数字。

6. 用χ2(卡平方)法检验实验结果。

b、反交

选用白眼处女蝇与野生型雄蝇做亲本,采取和上述相同的步骤进行杂交、兄妹交与回交, 观察并统计其结果,与正交的结果作一比较和说明。

五、作业:

1. 设计报告

2. 果蝇杂交实验结果及其统计分析结果

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