环境中诱变物质的微核检测
摘要：微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构，是染色体发生畸变的另一种表现形式，微核发生率用来反映诱变物质对生物的遗传危害程度。本实验以大蒜根尖作为实验材料，分别以清水和一定梯度的叠氮化钠溶液作为阴性对照和阳性对照，用一定梯度的咖啡溶液和电池浸出液对实验组大蒜根尖进行诱变。最后卡诺固定液进行固定、用改良苯酚品红染色、压片后观察统计各组的微核千分率，从而了解微核检测的方法和意义以及通过检测评价环境中常见物质的诱变情况。
1. 引言
微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构，是有丝分裂后期丧失着丝粒的落后的染色体片段形成。微核是染色体畸变的一种表现方式。许多能引起染色体断裂的理化因素，如辐射、化学诱变剂等，均可作用于分裂细胞而产生微核。目前研究表明，微核发生率同作用因子的剂量呈正相关，微核发生率来反映诱变物质对生物的遗传危害程度。
微核试验是一种建立在细胞水平上分析DNA损伤的技术。该技术以其经济、简便、快速、敏感、特异、准确等特点，成为检测致突变剂和环境污染物等经典的短期试验方法。目前许多国家和国际组织将其规定为新药、食品添加剂、农药、化妆品等毒理性安全性评价的必做试验并用于染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。
本试验采用大蒜作为试验材料，具有许多优点：① 用鳞茎进行无性增殖，避免了有性生殖过程中的遗传性变异，具有遗传背景稳定的优势；② 分布广、材料易得，不受地区和季节的限制；③ 培养方便，操作简单，蒜瓣去皮后将基部浸入净水中即可萌生新根，无需其他条件，且蒜瓣体积较小，萌生新根的数目较多；④ 价格低廉，对诱变剂敏感，是一种理想的试验材料。
近年来，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出，日常生活中人类接触到的有潜在遗传毒性的物质越来越多， 其中一个较为突出的就是废旧电池的污染。废旧电池中的化学物质不断渗透在环境中，其污染将持续若干年，直接或间接的影响人们的身体健康，造成很大的危害。
咖啡的主要成分为咖啡因。德国生态学《okeo-test》的研究人员发现，他们所检测的所有24种品牌的研磨咖啡和7个品牌的浓咖啡中都含有致癌物质——丙烯酰胺。检测结果发现，丙烯酰胺也存在于煮熟的咖啡中。绝大多数研究均表明咖啡与膀胱癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等癌症有一定的关系。
为了研究电池浸出液和电池咖啡是否真正具有诱变致癌作用，本次实验通过用咖啡和电池浸出液进行大蒜诱变培养，在阴性和阳性对照设计下，计算其微核率，通过微核检测技术评价咖啡和电池浸出液的诱变情况。
2. 实验材料与方法
2.1 实验材料
材料：大蒜
器材:培养皿、单面刀片、双面刀片、Eppendorf管、油性记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子；
试剂：冰醋酸、无水乙醇、1M HCl溶液、100mmol/L NaN3溶液、电池内部粉末、雀巢速溶咖啡粉末，改良苯酚品红。
2.2 实验方法
2.2.1 取材
选取生长良好、大小相对一致的大蒜，剥成一瓣瓣后置于放清水的培养皿中。于24 ℃水中浸泡24-36 h,选择根长整齐一致，不定根长约0.5－1cm左右的大蒜随机分组。
2.2.2 处理各实验组
将实验材料分为六组，放入8ml不同成分的培养液中，其中1组为阴性对照组，培养液为清水；2、3组为阳性对照组，培养液分别为25mmol/L、50mmol/L NaN3溶液；5——8组培养液分别为0.50g/ml浓度的咖啡和0.25 g/ml浓度的咖啡以及分别添加2.5g和5.0g的电池内部粉末。将培养皿中置于20摄氏度左右室温下培养24h。
表1 实验组浓度梯度的设定
也可以设定时间梯度，检测微核的形成情况。实验组如下
(实验组采用的诱变剂是NaN3，既是实验组，又是阳性对照组)
表2 实验组时间梯度的设定
2.2.3 恢复培养24小时。
2.3.4 固定
卡诺固定液中固定24小时，如不立即检测可移至70%乙醇中4℃下保存。
2.3.5 制片
① 根尖用1MHCl处理的10min,水洗3次。
② 切取近根尖分生区的伸长区组织， 用改良苯酚品红染色10 min。
③ 压片：加上盖玻片后，用铅笔轻敲使细胞分散，最后垂直压下去。
2.3.6 镜检
每个根尖计数1000个细胞，统计含微核的细胞数，然后取平均值，即为该处理的微核千分率。
2.3 结果
2.3.1 实验结果图
图1 含微核的细胞（10*40） 图2 含微核的细胞（10*40）
图3 1组（10*40） 图4 2组（10*40）
图5 3组（10*40） 图6 4组（10*40）
图7 5组（10*40） 图8 6组、7组（10*40）
2.3.2 实验结果分析与统计
图1、2中可以看到含有微核的细胞，这些细胞都有以下特征：（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则型。
图3-8分别为1-6组的其中一个视野结果图。其中，图3中为清水组，没有微核的出现，但是由于加入的染液太多，使得背景呈现紫红色。图4——7视野中均有微核的出现：图4的视野中的某些细胞由于敲片力度过大导致细胞破裂；图5为50mmol/l的NaN3溶液，可看到溶液中几乎全是微核，说明NaN3诱导微核的能力很强。图5与图6进行对照，可看到咖啡的确具有一定的致癌作用，并且浓度越高，致癌作用越强烈。
图8为加入电池内部粉末的实验组，从图中可以看出，没有存活细胞，细胞均死亡，只留下细胞壁。说明我们加入的电池粉末浓度太高，已将细胞全部杀死，不能检测微核的千分率。
数据分析如下：
表3 实验数据分析
根据数据我们发现，咖啡存在一定的致癌率，但致癌作用要弱于NaN3。随着咖啡浓度的升高，微核率也相应增多。由于实验设计存在一些问题，根尖的数量相对较少，实验组的浓度梯度设计的不够多，所以仅根据本次实验无法得出微核率最大的咖啡浓度，只能进行定性分析。
而电池浸出液对照组，因为我们加入的电池粉末太多，导致电池浸出液浓度太高，极大地影响了大蒜根尖的生存，导致他们均死亡，无法检测电池粉末对微核的诱变作用。
3.讨论
实验分析
微核是由有有丝分裂过程中的染色体断片，或丝分裂后期丧失着丝粒的染色体产生的，这些染色体可以使一条，几条染色体也能形成微核。这些断片或脱离的染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，当子细胞进入下一个分裂间期时，它们便浓缩形成主核之外的小核，即形成了微核。
微核的判定标准：①凡主核大小的三分之一以下的小核；②小核着色不论深浅；③小核形态可以是圆形，椭圆形，不规则形；④小核可以与主核分离，与主核有丝或蒂相连，与主核相依，但各自轮廓楞楚的都可作为微核计入，但须注意不要将染色中心当作微核计入。
我们找微核时应注意找的根尖区域。由于进行了恢复培养，形成了微核的细胞应处于靠近分生区的伸长区中，压片观察此区域中的细胞呈正方形，或稍偏长方形，若观察到细胞明显拉长，且细胞核呈长条状的细胞，则为伸长区细胞。
对根尖进行压片观察，清水作为阴性对照组，没有观察到微核，可推测无诱变作用或诱变作用很弱；已知NaN3有很强的诱变作用，所以用25、50mmol/l的NaN3作为阳性对照组，其中50mmol/l的NaN3的根尖压片中可观察到大量微核，其数量是所有实验组中最大的，其千分率几乎为100%。实验组分别用不同浓度的咖啡溶液进行处理，由表中数据可看出，咖啡有诱变作用。且由四组和五组的微核率可以看出，微核发生率同作用因子的剂量呈正相关。这也警示我们日常生活中要少喝咖啡；而电池浸出液浓度太高，已将根尖细胞完全杀死，我们失败的原因是设计实验之前未充分的阅读文献，导致我们的梯度设计的不够合理。这也提醒我们做实验时实验梯度必须谨慎设计，太高会抑制细胞的活动，使细胞分裂活动延缓或终止停止，甚至死亡，以后的实验设计中必须牢记这一点。
从实验数据来看,我们组的微核率普遍偏高,这也反映了我们组没有合理的设计实验梯度,设计的浓度普遍偏高,没有差异,这也为我们提醒了日后独立设计实验时,必须充分阅读资料,制定合理的梯度.
从图中可看出，此次实验压片效果不是很好，对微核率的统计及实验结果造成影响。图6中细胞轮廓不清晰，而且与周围细胞对比可看出装片中有多层细胞重叠的状况，压片时没有使细胞充分分散开。虽然此次实验不需观察染色体，对压片没有那么高的要求，但依旧不能松懈，要做到视野中单层细胞，且细胞不重叠，计数才能更准确，才能获得较好的实验结果。
实验注意事项及改进之处
1. 由于培养大蒜的时候，放的大蒜不够多，导致长出根的大蒜相对较少，根的数量有限，难以进行多组实验。
2. 敲片的力度一定要掌握好，不能过重，也不能过轻。力度过大会导致细胞破裂，无法观察和计数含有微核的细胞。过轻会导致出现多层细胞重叠的现象，也影响微核的观察与计数。
3. NaN3见光会分解，所以在用溶液处理材料时，不要把培养皿放置在窗台，最好放置在恒温箱中，以免对实验产生误差。
4. 后续实验中，可以在本次实验的基础上，再设置不同浓度梯度的咖啡实验组，并且分别处理不同的时间，来观察相应的结果，进行定量分析。而对于电池粉末组则应该在充分阅读相关文献的基础上，重新设计适当的浓度梯度的实验组。
6. 切取根尖时要准确，若切取组织过大，制片后视野中细胞过多，且多层，影响观察；若过小，则丢失细胞。两种情况都会造成观察到微核偏少的现象。我们切取的应是根尖伸长区的细胞
7. 在解离之前和之后，均要用清水洗涤根尖，否则前者影响解离，后者影响染色。
8. 若诱变因子浓度较低，则微核较少；压片时可能压入杂质，染液也可能产生沉淀，所以在压片之后需要认真地进行镜检，不漏掉一个微核，也不把杂质误认为微核。
实验总结
本次实验，我们成功的通过微核检测技术评价咖啡诱变情况，所以日后应该少喝咖啡，并且本次实验我们虽然没有成功的检测电池浸出液的诱变作用，但是也可以从实验中验证废旧电池对生物的巨大危害，这提示我们今后一定要注意不能随意丢弃废旧电池，做好回收工作。此外，生物实验中很重要的一方面就是制作好的片子，要努力制取单层细胞，不发生细胞的重叠。还有今后设计实验,必须设计合理的梯度, 多读文献,了解背景知识.
参考文献
【1】 曾雪、王旭、周材劝、李明、杨艳、都红圩、王山丹. 废旧电池液对多刺裸腹溞的毒性研究. 西华师范大学学报. 20##年12月.
【2】 徐秀芳、张海洋、于淑池. 秋水仙素诱导大蒜微核的遗传学实验方法研究. 安徽农业科学. 20##年15期
【3】 致癌抗癌 咖啡是敌还是友. 黑龙江科技信息. 20##年20期。
【4】 崔蕴霞, 崔常安. 咖啡与致癌 (综述)[J]. 暨南大学学报 (自然科学与医学版), 1995, 2
第二篇：遗传实验指导
遗传学实验指导
一、实验项目
1、减数分裂的观察
2、果蝇唾液腺染色体的观察
3、花粉母细胞涂抹制片
4、分离规律
5、等位基因分离的验证
6、独立分配规律
7、基因的连锁与交换
8、有丝分裂
9、石蜡切片技术
10、染色体数目变异的诱发及鉴定
11、显微摄影技术
12、植物染色体组型分析
13、细胞核内DNA的鉴定
14、高等植物核DNA的简易快速提取
15、外源DNA的花粉管道导入技术
16、大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的制备和转化
二、实验项目
实验一 减数分裂的观察
一、实验目的
观察并熟悉减数分裂的全过程，以及各个时期染色体的行为和变化，为学习遗传学基本规律奠定基础。
二、实验说明
减数分裂是在性母细胞成熟时，配子形成过程中所发生的一种特殊的有丝分裂。在性母细胞形成过程中，先由有性组织（如花药、胚珠）中的某些细胞分化为孢母细胞（2n），以后进一步由这些孢母细胞进行两次连续的分裂，而染色体只分裂一次，结果产生四个染色体数目减半的大（小）孢子（n）。这些孢子进一步发育为雌（雄）配子，通过雌雄配子的受精结合，新个体的染色体又恢复到与亲本相同的数目，从而保证了亲代和子代间染色体数目的恒定性。
减数分裂各时期的主要特点如下：
第一次分裂
前期Ⅰ 这一时期较长，变化也较复杂，一般又分为五个时期。
1、细线期：这是减数分裂开始时期，染色体细长如线，首尾不分，绕作一团，核仁明显，电子显微镜下观察，数目成双。
2、偶线期：由于螺旋化，染色体开始变短、变粗，同源染色体配对，出现联会，呈二价体状态是这一时期的主要特征。
3、粗线期：配对后的染色体逐渐缩短变粗，由于各染色体是由已复制的两条染色单体通过着丝粒连接起来，故每一配对的染色体中就含有四条染色单体，又称四合体。
4、双线期：四合体继续缩短变粗，同源染色体虽因非姊妹染色单体相互排斥而分开，但由于非姊妹染色单体之间发生交换，而在同源染色体的一定区段出现交叉结。
5、终变期：染色体变得更短更粗，交叉结向端部移动（端化），核仁、核膜开始消失，染色体分散在整个核内，此时观察染色体最为清楚，便于计数。
中期Ⅰ 核仁、核膜消失，染色体排列在赤道板上，成对染色体的着丝粒转向两极，纺锤丝出现。
后期Ⅰ 同源染色体由纺锤丝牵引着丝粒，向两极移动，由于各染色体的着丝粒尚未分裂，每一极只分到每对同源染色体中的一个，故两个子细胞将只有半数的染色体，从而实现了染色体数目的减半（2n→n）。
末期Ⅰ 染色体移到两极后，松开变细，形成子核，细胞质分裂，在中央由纺锤丝形成细胞板，形成二分体。
第二次分裂
前期Ⅱ 染色体又开始明显缩短，二分染色体的两个染色单体相互散开，但仍和着丝粒连在一起，没有分开。
中期Ⅱ 每个二分染色体又整齐地排列在各个分裂细胞的赤道板上。
后期Ⅱ 每个二分染色体的着丝粒纵裂为二，姊妹染色单体分别移向两极。
末期Ⅱ 拉向两极的染色单体形成新的细胞核，同时细胞质又分为两部分。这样经过两次分裂，形成四个子细胞，又叫四分体或四分孢子，每个孢子内只含有最初细胞的半数染色体，以后就开始了配子体的发育。
三、实验材料用具
1、材料玉米（2n=20）、普通小麦（2n=42）、水稻（2n=24）、黑麦（2n=14）、蚕豆（2n=12）花粉母细胞减数分裂各时期的永久制片。
2、用具 显微镜、二甲苯、擦镜纸等。
四、实验方法
根据前述减数分裂各时期的特点，在显微镜下，先低倍后高倍寻找花粉母细胞分裂相，仔细观察，并分析确定时期，最后按显微镜下观察的实际情况绘图。
五、作业
绘出减数分裂各时期的图象。
实验二 果蝇唾液腺染色体的观察
一、实验目的
学习解剖果蝇三龄幼虫的唾液腺及唾液腺染色体的制片方法，观察果蝇唾液腺染色体。二、实验原理
果蝇的唾液腺位于幼虫前端的食道两侧和神经球附近（图2-1）。剖取果蝇唾液腺细胞进行制片观察，可见到一个由4对染色体的着丝粒结合形成的染色中心，以及向四周伸展的5条染色体臂（X、2L、2R、3L、3R），其中第4对染色体为粒状，与染色中心密切相联，总称为唾液腺染色体（图2-2）。
果蝇唾液腺染色体是一种典型的多线染色体。它是果蝇唾液腺细胞核内有丝分裂所致，即核内染色体中的染色线连续复制而染色体并不分裂，结果使每条染色体中的染色线可多达500～1000条，长度和体积分别比其它细胞的染色体长100～200倍、大1000～2000倍，因此也称巨型染色体。由于每条染色体的染色线在不同的区段螺旋化程度不一，因而出现一系列宽窄不同、染色深浅不一或明暗相间的横纹。不同染色体的横纹数量、形状和排列顺序是恒定的。利用这些特征不仅可以鉴别不同的染色体，还可以结合遗传实验结果进行基因定位。此外，由于其体细胞同源染色体的配对，故易于进行染色体的缺失、重复、倒位和易位的细胞学观察和研究。
三、实验材料用具药品
1、材料 果蝇的三龄幼虫活体。
2、用具 显微镜、双筒解剖镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、吸水纸、洒精灯、火柴等。
3、药品 无水洒精、冰醋酸、1%醋酸洋红、生理盐水（0.7%NaCl）、1M盐酸、蒸馏水。
4、培养基 采用玉米粉培养基。
玉米粉培养基配方
水 150ml
琼 脂 1.5g
蔗 糖 13g
玉米粉 17g
酵母粉 1.4g
丙 酸 1ml
配制时根据各成分的配比（配制量根据所用培养瓶和实验人数而定），先取应加水量
的一半，加入琼脂和蔗糖，煮沸使之充分溶解。
取另一半水混和玉米粉，加热调成糊状。
将上述两者混和煮沸。
待稍冷后加入酵母粉及丙酸，充分调匀，最后分装到经灭菌的培养瓶中。
四、实验步骤
1、幼虫饲养 选野生型雌雄果蝇各 5只，放入培养瓶中繁殖，置于16～18℃下饲养，当幼虫爬上瓶壁准备化蛹前，即为三龄幼虫，此时虫体肥大，便于解剖，是制备唾液腺染色体的最理想时期。
2、唾液腺剖取 选取发育良好、虫体肥大的三龄虫，置于载玻片上，加几滴0.7%生理盐水，在双筒解剖镜下左手持镊子压住虫体中后部，右手持解剖针按住头剖（即口器稍后处），轻轻向前拉动，使头部扯离虫体，从而拉出唾液腺。这时可看到一对透明微白的长形小囊，即是由单细胞层构成的唾液腺，在解剖镜下隐约可见其细胞界限，唾液腺的一侧有一条泡沫状脂肪体，可用解剖针剔除，以保证制片质量。整个剖取过程须在生理盐水中进行。
3、解离 把载玻片上的幼虫其它部分除去，用吸水纸小心吸去生理盐水（注意吸水纸应离唾液腺远些，以免吸附唾液腺），加1滴1M盐酸，解离2～3min，使组织疏松，以便压片时细胞分散，染色体展开。
4、染色 用吸水纸吸去盐酸，加1滴蒸馏水轻轻冲洗后吸干，加2滴1%醋酸洋红染色15～20min。
5、压片 盖上盖玻片（如染液不够，可在盖玻片四周再加 1滴渗入），在酒精灯上略作加热，然后用吸水纸包被载玻片，吸干多余染色液，并用手指轻压盖玻片，再用铅笔的橡皮头或解剖针柄垂直轻敲，或进一步用拇指在盖玻片上适当用力压片，注意勿使盖玻片移动。
6、观察 先在低倍镜下找到分散相好的唾液腺染色体，然后调高倍镜观察，对染色体分散、个体清楚的片子，应仔细观察染色体的横纹数量、形状和排列顺序，以便对照模式照片辨认出不同的染色体臂。
五、实验作业
每人制2张染色体分散、横纹清晰的临时片。
实验三 花粉母细胞涂抹制片
一、实验目的
学习并掌握花粉母细胞涂抹制片的基本方法，加深对植物减数分裂的认识和理解。
二、实验说明
花粉母细胞涂抹制片技术是一种良好的速成制片法。它具有操作简便省时，能尽快得到植物细胞染色体的分散而清晰的图象等优点，是近代细胞学上常用的研究细胞分裂的手段。学习并掌握花粉母细胞涂抹制片技术，也是我们从事遗传育种研究的基本功之一。
三、实验材料用具药品
1、材料 经过固定，处于减数分裂中的玉米雄穗。
2、用具 显微镜、解剖针、镊子、载玻片、盖玻片、纱布、表面皿、吸水纸、酒精灯、培养皿等。
3、药品配制
（1）卡诺氏固定液
配方Ⅰ 纯酒精（或95%酒精） 3份
冰醋酸 1份
配方Ⅱ 纯酒精 6份
氯 仿 3份
冰醋酸 1份
（2）醋酸洋红染液 量取45ml冰醋酸加入55ml蒸馏水中，即成100ml45%的醋酸。加热至沸，移去火焰徐徐加入2g洋红粉末,加热至沸1～2min并同时悬入一生锈的小铁钉,或者等冷却后加入几滴2%铁明矾（硫酸铁铵），过滤后贮藏于棕色瓶中备用。
（注：放入铁钉或铁明矾或氢氧化铁的45%醋酸饱和液，是使染色剂略具铁质，可以增强染色性能。）
（3）脱水、透明剂
配方Ⅰ 叔丁醇法
① 45%冰醋酸
② 1/2冰醋酸+1/2叔丁醇
③ 纯叔丁醇
配方Ⅱ 正丁醇法
① 1/2 95%乙醇＋1/2冰醋酸+正丁醇（数滴）
② 1/2 95%乙醇＋1/2正丁醇
③ 正丁醇
（4）封片剂 加拿大树胶，可用对应的叔丁醇或正丁醇稀释。
四、实验方法
1、取材固定 取材的时间和材料的大小必须适当，才能获得较多的花粉母细胞分裂相，此外及时固定，也是观察染色体减数分裂的重要条件。
（1）取材 在玉米抽雄前7至10天，即大喇叭口期，用手挤捏喇叭口下部叶鞘，在感觉松软处，以刀片划一纵向切口，剖开取出数条花序分枝观察，如先端小花苞长3～4mm，即可取用。时间在上午7:00～10:00，气温25℃～30℃左右，此时正是玉米花粉母细胞分裂的高峰期。
（2）固定：利用化学药剂把细胞迅速杀死，使蛋白质变性和沉淀，并尽量保持各种结构的原有状态，便于染色及染色体观察分析等细胞遗传学研究。固定方法：取样后应立即投入固定液中，即随取随浸。有芒的穗应剪去，较大的应分段固定，固定时应在低温下，一般在冰箱内固定1～24h。将固定后的材料用95%酒精洗两次，每次10min,再经80%酒精泡洗10min至无酸味时，最后放入70%酒精中保存。
2、染色制片 选择理想的分裂时期是染色制片成功与否的重要前提条件。玉米雄穗分枝，主茎最老，从上至下逐渐幼嫩；每一侧枝的中上部最老，由此向上向下越发幼嫩。每一侧枝小穗成对着生，无柄小穗发育略早于相邻的有柄小穗。每个小穗有两朵小花，第一小花（上部）老于第二小花（基部），每朵小花内有3个花药，第一小花的分裂最有规律，可沿侧枝连续找到各个分裂时期。
先取玉米雄穗分枝置于表面皿中，加少许保存液，以防干去。用镊子取适当部位花药1～3个（最好同一朵花），移置载玻片上，滴一滴染液，用解剖针切断花药，并轻轻挤压，使花粉母细胞从切口处散出。而后将花药壁残渣捡除干净，再搅动染液，使花粉母细胞散开。置低倍镜下初检，如花粉母细胞正处于分裂期，即可加上盖玻片，将载玻片在酒精火焰上来回烘烤几次，注意勿使染液沸腾或干燥，而后用拇指垫上吸水纸轻压盖玻片，注意不能平移。这样才能使染色体染色较深，细胞质染色较淡，两者对比明显且染色体比较分散并处于同一平面内便于观察。如果染色太浅（或太深）可在盖玻片四周稍加染液（或45%醋酸），待其渗透，再烘，再压，直至染色体明显清晰为止。
3、镜检 观察确定分裂时期时应识别以下几种细胞：体细胞、花粉母细胞、四分体脱开后刚发育的幼小花粉粒以及成熟的花粉粒等。一些形态较小而且整齐均一的细胞，就是花药壁体细胞。一些形态显著较大，比前述细胞大十来倍，圆形或扁圆形，其细胞核较大，几乎充满整个细胞，就是花粉母细胞。比体细胞大但比花粉母细胞小，略呈扇形的细胞，就是从四分体脱开的小孢子或幼小花粉粒。形态较大的椭圆形、似有明亮外壳、内部较透明的细胞，就是长大的花粉粒。凡形状大小同花粉母细胞相近且范围内有似空腔的核仁，出现丝状、条状、棒状物者，即正在减数分裂的花粉母细胞，注意对这类细胞进行细致的观察分析，判断所处时期，典型的制成永久制片。
4、永久制片 将配制好的脱水透明液①、②、③号培养皿顺序排好。将制好的临时片翻转，使盖玻片朝下，浸入①号液中，使载玻片一端置于玻棒上且呈倾斜，让盖玻片自行脱落。此时载玻片材料面朝下，盖玻片相反。将载玻片翻转过来，并将盖玻片材料面向上放于载玻片一端，用镊子从①号液取出，稍控干，依次放入②、③号内进行脱水、脱酸、脱色1～2min。取出盖玻片和载玻片，吸去多余的液体，滴一滴树胶于载玻片上有材料的地方，再将盖玻片翻转（有材料的一面向下）盖于载玻片的原位上，最后用镊子轻点盖玻片，使树胶布满为宜。再经镜检材料仍在且符合要求，则贴标签，注明时期、姓名、日期，置阴凉处晾干保存。
五、作业
每人至少交两张减数分裂永久制片。
实验四 分离规律
一、实验目的
通过一对相对性状的遗传杂交实验，分析杂种后代的性状表现，验证分离规律。
二、实验说明
在减数分裂形成配子时，同源染色体上的等位基因，必然随着所在染色体的分离而分离。已知这些相对性状分别受一对基因控制，且这一对基因之间具有显性和隐性的关系。将具有一对相对性状差异的两个亲本杂交，其F1产生的雌雄配子各有两种,其比例为1:1，F2表现型也有两种，其比例为3:1。
三、实验材料用具
1、材料 玉米：甜×非甜F1自交的果穗和测交的果穗。
棉花：正常阔叶×鸡脚叶F1植株及F2植株群体。
2、用具 显微镜、培养皿、载玻片、盖玻片、镊子、解剖针、玻棒、育苗箱等。
四、实验方法
1、玉米 观察玉米子粒甜与非甜的分离 玉米子粒的淀粉层非甜（SuSu）对甜（susu）为显性，非甜的粒形较饱满、光滑，甜的粒形呈皱缩状。每人取玉米杂合体（Susu）F1株上自交和测交的两种果穗，按子粒形状计数各果穗上非甜粒数与甜粒数。最后按各小组观察的数据汇总进行统计分析。
2、棉花 观察棉花叶形的分离 以正常阔叶×鸡脚叶F1株的叶形与双亲植株的叶形进行对比观察，并调查田间F2株群体中正常阔叶、中间叶和鸡脚叶的株数，进行统计分析。
为了验证分离规律，对所观察的数据须按下式进行χ2（卡方）测验。
（o-e）2 d2
χ2=Σ─────=Σ ─
e e
其中：o为实际观察值；e为预期理论数；d=o-e, d为实际观察数与预期理论数的差数。Σ为各项总和。
求得χ2值后,根据自由度df（即分离类型组数n减去1），查χ2值表，求出概率P。再根据P值确定实得结果与理论数是否有显著差异。P＜0.05，表明差异显著如P＞0.05，则表示差异不显著，即说明实际观察数符合预期理论数。
五、作业
1、上述各实验材料所获得的观察数据，全班汇总填入下表，然后分别进行χ2测验，根据自由度和估算的χ2值，查阅χ2值表，求出概率值P。
2、通过分析，对各相对性状的遗传表现作出解释。
一对性状的遗传分析
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
玉 米 棉 花
项 目 ──────────────────────────
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
观察数（o）
预期数（e）
偏差d=o-e
差方d2=(o-e)2
d2
Σ—
e
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
df=n-1= χ2= P=
实验五 等位基因分离的验证
一、实验目的
通过对玉米（或水稻）非糯与糯杂种F1花粉粒性状的观察，验证等位基因分离。
二、实验说明
等位基因位于同源染色体上，减数分裂中同源染色体必然分离，染色体上的基因跟随一道行动而表现分离，形成不同基因的孢子，进而产生不同的配子。具有一对基因之差的两亲本杂交，那么F1产生的雌雄配子，应各有两种，并理论上数目相等，F1自交时，各种雌雄配子随机结合，因此F2中有三种基因型，比例为1∶2∶1，完全显性时有两种表现型，比例为3：1；F1与隐性亲本测定时，后代分离比例为1∶1。通过自交或测交后代的表现型比例，只可以间接推测等位基因的分离形式，而植物某些花粉粒性状或粗糙链孢霉子囊孢子的分离为等位基因的分离提供了直接证据。
在一些植物中，如水稻、玉米、高粱、谷子等禾谷类作物，它们的粒常有糯性与非糯性两种类型，这种性状受一对基因控制，它们分别控制着子粒及花粉粒中的淀粉性质，非糯为直链淀粉，由显性基因Wx控制，糯性为支链淀粉，由隐性基因wx控制，如果用稀碘液处理花粉，前者呈蓝黑色反应，后者呈红棕色反应，通过这种颜色反应，可以直接观察到F1花粉的不同颜色来判断等位基因是否分离。例如非糯玉米与糯玉米杂交的F1花粉经稀碘液处理后，在显微镜下观察，可以清楚地看到花粉粒具有两种不同的颜色反应，而且红棕色和蓝黑色的花粉粒的数目大致相等，因此证实了等位基因分离的原则。
三、实验材料用具药品
1、材料 以非糯与糯杂种玉米（或水稻）F1的花粉为材料，取材时于前一天将雄花套袋，次日上午9:00～11:00盛花期抖落花粉，分藏于冷凉干燥处备用，或于头天取欲将开花散粉的雄花序，放在卡诺氏固定液中保存备用。
2、用具 显微镜、小镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、烧杯、培养皿、铅笔等
3、药品配制 1％I—KI碘—碘化钾液：取2g碘化钾溶于5ml蒸馏水中，加入1克碘，待其溶后再加入295ml水，保存于棕色试剂瓶中。
四、实验方法
1、镜检 检查杂种花粉粒时应以亲本花粉作为对照，其镜检方法如下，挑取少量花粉或整个花药置载玻片上，夹破花药后置低倍镜观察，注意调节镜下反光，稍暗一点，花粉便呈现亮晶晶乳白色光泽。滴少许I—KI溶液，盖上盖玻片，静观花粉粒颜色变化，呈蓝色的是非糯花粉粒，呈红棕色的为糯性花粉粒。对杂种材料每张片子按5点取样，记录5个视野各类花粉粒数目，如此重复检查，检查花粉粒总数应在5000以上。
注意：(1)解剖用具如针、镊子用后随时用水冲洗，洗去粘附的花粉粒，以免混杂干扰结果；(2)调节照明，不用强光以及直射光，调节光栏，直至两种颜色明显区别，先在100倍左右观察，然后在200倍左右计数；(3)仔细鉴别花粉颜色，准确归类，凡畸形瘪皱、特小发育不良的花粉均不计入。
2、适合性测定 用χ2（卡平方）法测验实际分离比例是否与理论预期相符，将各数填入下表：
玉米糯与非糯F1花粉粒分离的卡方测验
┌───┬────┬───────┬────┬────┬──────┐
│花粉粒│观 察 数│理论数（1：1）│ 偏 差 │ 差 方 │差方/理论数 │
│颜色 │ o │ e │d（o-e）│ d2 │ d2/e │
├───┼────┼───────┼────┼────┼──────┤
│深蓝色│ │ │ │ │ │
│红棕色│ │ │ │ │ │
├───┼────┴───────┴────┴────┼──────┤
│合计 │ │χ2= │
└───┴──────────────────────┴──────┘
（o—e）2
χ2＝∑[────] 自由度df＝2—1＝1
e
查χ2表，若χ2值＞3.84（即P＜0.05），说明实际结果不符合1∶1的分离比例；若χ2值≤3.84（即P≥0.05），表示符合分离比例。
五、作业
每人检查玉米（或水稻）糯×非糯F1花粉粒200个，记录不同类型的花粉数，综合全班镜检结果，做卡平方测验，并解释实验结果。
实验六 独立分配规律
一、实验目的
通过两对相对性状的遗传杂交实验，分析杂种后代的性状表现，验证独立分配规律。观察分析玉米杂种后代的胚乳性状、糊粉层及果皮颜色的表现，了解基因互作现象。
二、实验说明
在减数分裂过程中，位于非同源染色体上的两对等位基因在形成配子时，每对等位基因既随同源染色体的分离而分离，又随非同源染色体的重组而自由组合，形成四种类型的配子，其比例相等。因此，两对基因的杂合体在完全显性的条件下，其自交子代的表现型分离比例为9:3:3:1，测交子代的表现型分离比例为1:1:1:1。如果基因间发生互作，则随着互作方式的不同而产生的表现型分离比例有所不同。
玉米子粒是由果皮、胚乳和胚三部分组成，其中胚乳包括糊粉层和淀粉层。已知控制玉米子粒各种性状的基因，具有下列的遗传表现。
果皮颜色性状有红色、棕色和无色。在基本色素基因A1存在时，果皮颜色的表现一般是由P和Bp两对基因互作的结果。
胚乳性状有非甜粒和甜粒。非甜子粒外形饱满，甜子粒外形皱缩。已知甜粒性状是受位于第六染色体上的隐性基因su所控制。
糊粉层颜色性状有紫色、红色和无色。它主要由7对基因（花青素基因A1—a1,A2—a2，A3—a3；糊粉粒色基因C—c,R—r和Pr—pr；色素抑制基因I—i）所控制。只有当显性基因A1、A2、A3、C、R同时存在，而抑制基因又呈现隐性纯合ii时，色素才能形成。而色素形成的类别是由Prpr确定的，当显性基因Pr 存在时，表现紫色，当隐性基因纯合prpr存在时则表现红色。当显性基因A1、A2、A3、C、R中缺少任何一个或所有这些色素基因均为显性，但有显性抑制基因I存在时，均表现为无色。
由于控制玉米子粒、果皮和糊粉层颜色，以及胚乳性状的基因分别位于非同源染色体上，故这些性状的遗传表现为独立分配和基因互作现象。
三、实验材料用具
1、材料 玉米果穗(有色、非甜×无色、甜)F1植株的自交果穗;[(有色、非甜×无色、甜)F1×无色、甜]的测交果穗；用于观察基因互作的不同杂交组合的果穗材料。
2、用具 计算器、计数器等。
四、实验步骤
1、验证独立分配规律
（1）配制玉米子粒有色、非甜×无色、甜的杂交组合，并产生F1植株的自交果穗，然后观察果穗上子粒性状的分离现象。每一果穗的子粒按有色、非甜，无色、非甜，有色、甜，无色、甜四种表现型计数。
（2）将上述有色、非甜×无色、甜的F1植株与无色、甜的亲本进行测交。取F1植株上测交的果穗，观察子粒性状的分离现象，每一果穗的子粒同样按上述四种分离类型分组计数。
2、观察基因互作现象
（1）互补作用 由于A、C、R中缺少任何一个色素显性基因，子粒均为无色，因而将子粒无色，基因型分别为aaCCRR,AAccRR或AACCrr亲本间杂交，例如aaCCRR×AAccRR产生F1为AaCcRR，由于显性基因A和C的互补作用，其F1子粒表现有色。让F1植株自交产生F2果穗，观察F2果穗上子粒的分离现象,按有色和无色两种表现型计数，其F2子粒颜色的分离比例为9有色（9A_C_RR）：7无色（3aaC_RR+3A_ccRR+1aaccRR）。
（2）抑制作用 将有色子粒CCii与无色子粒ccII的亲本杂交，让F1植株自交产生F2果穗。然后观察F2果穗上子粒性状的分离现象，按无色和有色两种表现型计数。上述组合中，由于抑制基因I能抑制所有色素基因的表达，故其双亲虽均具有纯合的A和R基因，但其F2穗子粒性状表现为13无色（9C_I_+3ccI_+1ccii）：3有色（3C_ii）。
（3）隐性上位作用
①果皮颜色 将表现棕色果皮子粒性状的亲本（PPbpbp）与白色果皮子粒形状的亲本（ppBpBp）杂交，让F1植株自交产生F2果穗。观察F2果穗上子粒性状的分离现象。按红色、紫色和白色三种表现型计数，由于上述组合中，玉米子粒P和Bp这两对基因具有互补效应，因此，当具有P_Bp_时，玉米子粒的果皮颜色表现为红色；P_bpbp为棕色；当有pp基因存在时，则表现为无色，这里一对pp隐性纯合基因具有隐性上位作用，从而使F2子粒果皮颜色的分离为三种表现型，其比例为9红色（9P_Bp_）：3棕色（3P_bpbp）:4无色（3ppBp_+1ppbpbp）。
②糊粉层颜色 将玉米子粒糊粉层颜色表现为紫色的亲本（CCPrPr）与无色的亲本（ccprpr）杂交，让F1植株自交产生F2果穗。观察统计F2果穗上子粒糊粉层颜色的分离现象。由于cc隐性纯合基因对产生紫色糊粉层的基因Pr具有隐性上位作用，故F2子粒糊粉层颜色的分离比例为9紫色（9C_Pr_）：3红色（3C_prpr）:4无色（3ccPr_+1ccprpr）。
五、作业
1、观察上述各杂交实验的性状分离和重组的表现型，并写出它们的基因型。各实验观察结果分别按下表填写和分析。
两对性状的遗传分析
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
表 现 型
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观察数（o）
预期数（e）
偏差d=o-e
差方d2=(o-e)2
d2
Σ—
e
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
df=n-1= χ2= P=
2、对以上各实验结果进行χ2测验,从而对各性状的遗传表现作出解释。
（1）验证独立分配规律
①玉米有色、非甜×无色、甜F1植株的自交果穗上的F2子粒色性状的分离现象。
②玉米有色、非甜×无色、甜F1植株与无色、甜的亲本测交，在F2植株上所结测交果穗上的Ft子粒色性状的分离现象。
（2）观察基因互作现象
①互补作用 玉米子粒无色自交系间杂交，产生F1植株的自交果穗上的F2粒色性状的分离现象。
②抑制作用 玉米子粒有色和子粒无色自交系间杂交，产生F1植株的自交果穗上的F2粒色性状的分离现象。
③隐性上位作用 玉米棕色果皮和白色果皮自交系间杂交，产生F1植株的自交果穗上的F2粒色性状的分离现象。
实验七 基因的连锁与交换
一、实验目的
通过玉米三对连锁遗传的相对性状的杂交实验，验证基因的连锁与交换的原则，并掌握基因定位的基本方法。
二、实验说明
生物体在形成配子减数分裂中，位于同源染色体上的等位基因必然分开，表现分离规律；位于非同源染色体上的非等位基因表现独立遗传；位于同一染色体上的非等位基因，往往有保持原来组合状态随同所在染色体一道遗传的趋势，也可能随着非姊妹染色单体的片段交换而交换，从而产生各种可能组合的配子。但总是亲本型配子多，重组型配子少，即表现连锁遗传现象。基因间的连锁强度以交换率即重组配子数占总配子数的百分率来表示，在测交条件下，
测交后代重组型个体数
交换率（%）＝──────────×100
测交后代总个体数
基因在染色体上相距越近，交换机会就越少，交换率就越低，反之越高。基因在染色体上的位置是固定的，基因间的交换率便也是相当恒定的，因此交换率的大小可以作为衡量基因距离的尺度，将1％交换率作为一个遗传单位。根据交换率的大小，可以确定基因在染色体上的相对位置，经典遗传学基因定位的方法有两点测验和三点测验。
连锁基因的交换是生物变异来源之一。连锁与交换的试验结果，提供了基因存在于染色体上的证据，论证了基因在染色体上的线性排列，为遗传工程研究和动植物育种工作提供了基本资料。
三、实验材料用具
1、材料 玉米紫色糊粉层、饱满、非糯自交系与褐色糊粉层、凹陷、糯性自交系的杂种F1与褐色、凹陷、糯性亲本测交的果穗。
已知玉米糊粉层色泽（紫色与褐色）子粒形状（饱满与凹陷）及胚乳质地（非糯性与糯性）基因都位于第9染色体上，此染色体短臂上几个主要基因的位置如下图：
wx sh c
──────────
2、用具 计数器，计算器等。
四、实验方法
1、观察计数 针对子粒的紫色与褐色、饱满与凹陷、非糯性与糯性三对性状，同时进行观测，杂种F1果穗上的子粒全为紫色、饱满、非糯，测交果穗中应有八种不同的子粒表现类型，仔细观察鉴定，准确无误地进行记数，将结果记入下表：
────────┬──────┬─────┬────┬────
测交后代表现型 │F1配子基因型│ 交换类别 │粒 数 │ 交换率
────────┼──────┼─────┼────┼────
饱满、紫色、非糯│ │ 无交换 │ │
凹陷、褐色、 糯 │ │ │ │
────────┼──────┼─────┼────┼────
饱满、褐色、 糯 │ │ 单交换Ⅰ │ │
凹陷、紫色、非糯│ │ │ │
────────┼──────┼─────┼────┼────
饱满、紫色、 糯 │ │ 单交换Ⅱ │ │
凹陷、褐色、非糯│ │ │ │
────────┼──────┼─────┼────┼────
饱满、褐色、非糯│ │ 双交换 │ │
凹陷、紫色、 糯 │ │ │ │
────────┼──────┼─────┼────┼────
合 计 │ │ │ │
────────┴──────┴─────┴────┴────
2、分析计算
（1）确定三种性状（基因）的关系：全部独立遗传，或一个独立两个连锁，或三个基因都连锁。
（2）确定各种交换类型：测交后代中数量最少的类型为双交换型，最多的为无交换型，中间的为单交换型。
（3）确定三种基因的排列顺序：在双交换后代中，有两个性状出现了原亲本的组合类型，则第三个改变了原有组合性状的基因必在中间。
（4）计算交换率
单交换I粒数＋双交换粒数
交换率I（%）＝────────────×100
总粒数
单交换Ⅱ粒数＋双交换粒数
交换率Ⅱ（%）＝────────────×100
总粒数
3、绘制连锁图
按基因顺序，以1％交换率作为一个遗传距离单位，依比例绘图。
五、作业
每人观察两个果穗，综合全班结果，求交换率，进行基因定位，交表，并附连锁图。
实验八 有丝分裂
一、实验目的
观察有丝分裂中染色体的行为变化，并掌握染色制片技术和操作方法。
二、实验说明
有丝分裂是生物体细胞增殖的主要方式。在有丝分裂过程中，细胞核内染色体能准确地复制，并能有规律地、均匀地分配到两个子细胞中去，使子细胞遗传组成与母细胞完全一样，从而可以推断生物性状的遗传与染色体的准确复制和均等分配有关，支配生物性状的遗传物质主要存在于细胞核内的染色体上。
细胞有丝分裂是一个连续过程，可分为前期、中期、后期和末期。有丝分裂在整个细胞周期中约占10%的时间，而其余大部分时间是处于细胞连续两次分裂之间的间期。有丝分裂各时期染色体变化的特征如下：
前期 核内染色质逐渐浓缩为细长而卷曲的染色体，每一染色体含有两个染色单体，它们具有一个共同的着丝点；核仁和核膜逐渐模糊不明显。
中期 核仁和核膜逐渐消失，各染色体排列在赤道板上，从两极出现纺锤丝，分别与各染色体的着丝点相连，形成纺锤体。在中期染色体呈分散状态，便于鉴别染色体的形态和数目。
后期 各染色体着丝点分裂为二，其每条染色单体也相应地分开，并各自随着纺锤丝的收缩而移向两极，每极有一组染色体，其数目和原来的染色体数目相同。
末期 分开在两极的染色体各自组成新的细胞核，在细胞质中央赤道板处形成新的细胞壁，使细胞分裂为二，形成两个子细胞。这时细胞进入分裂间期。
间期 细胞分裂末期到下一次细胞分裂前期之间的一段时期。在光学显微镜下，看不到染色体，只看到均匀一致的细胞核及其中许多的染色质。实质上间期的核是处于高度活跃的生理生化的代谢阶段，为细胞连续分裂准备条件。
高等植物有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织。由于根尖取材容易，操作和鉴定方便，故一般采用根尖作为观察有丝分裂的材料。
三、实验材料用具药品
1、材料 蚕豆、玉米、黑麦、洋葱等的种子或根尖。
2、用具 显微镜，盖玻片，载玻片，培养皿，量筒，烧杯，玻棒，酒精灯，镊子，解剖针，刀片，纱布，吸水纸等。
3、药品配制
（1）0.1%秋水仙碱溶液 取0.1g秋水仙碱溶于100ml蒸馏水中。或者，将原装1g秋水仙碱以少量95%酒精作溶媒，将其溶解后，加蒸馏水定溶100ml即成1%秋水仙碱母液，存于棕色瓶中，放入冰箱保存。用时取一定量的母液稀释至所需的浓度。
（2）果胶酶与纤维素酶混合液
混合浓度 1% 2.5%
果胶酶 1g 2.5g
纤维素酶 1g 2.5g
蒸馏水 100ml 100ml
（3） 1M盐酸
浓盐酸（比重1.19） 82.5ml
蒸馏水 917.5ml
（4） 对二氯苯饱和水溶液 取10g对二氯苯加蒸馏水100ml。
（5）0.002M的8—羟基喹啉水溶液：用分析天平称0.2901g8—羟基喹啉用蒸馏水定溶于1000ml容量瓶中,在60℃下溶解后备用。
（6）卡诺氏固定液、醋酸洋红、脱水透明封片剂配制方法同实验三《花粉母细胞涂抹制片》。
四、实验步骤
1、材料准备 选取蚕豆等种子，在40℃～50℃的热水中催芽12～24h，然后将萌动的种子放于铺有吸水纸的培养皿或放有3～5cm厚锯末或沙子的盆中,置于25～28℃的温箱内发芽,待根长到1～2cm时取出洗净，将水吸干备用。
2、预处理 为了获得较多的中期分裂相，使染色体缩短、分散，便于压片观察，对剪下的根尖可采用下列任一方法进行预处理。
（1）冷冻处理 将根尖浸入蒸馏水中，置于0℃～3℃的冰箱内，处理20～24h，对某些禾本科植物效果良好。
（2） 药剂处理 预处理常用的药剂及其处理时间为：
Δ0.01%～0.2%秋水仙碱水溶液处理2～4h;
Δ对二氯苯饱和水溶液处理3～4h;
Δ0.002M的8—羟基喹啉水溶液处理3～4h。
用以上各种药剂处理时，应注意温度不能过高，以10℃～15℃为宜。
3、固定 经过预处理的材料冲洗干净后，用卡诺氏固定液固定24h,经固定的材料如不立即使用，可置于95%酒精和80%酒精中各半小时，再换到70%酒精中，置于4℃下保存。如保存时间太长，需要重新固定后再用。
4、解离 其作用是除去未固定下来的蛋白质，同时使胞间层的果胶类物质解体，细胞分散便于制片观察。解离所需时间长短，依材料和解离液的成分而不同。
Δ酸解 用1M盐酸在60℃恒温下处理6～20min,或用盐酸（1M）—酒精液（1:1），在室温下处理8～20min；
Δ酶解 用0.5%果胶酶和0.5%纤维素酶的等量混合液，在25℃下处理2～3h，在37℃恒温箱内只需0.5～1h。较难压的材料可先以1M盐酸处理几分钟，经水洗后再移入1%的两酶混合液中处理。
5、染色压片 取处理好的材料，即根尖白色糊状组织置于表面皿中，加几滴醋酸洋红染色0.5～1h,然后纵向分成2～4块,分置几张载玻片上，滴一滴45%醋酸后加盖片，复以吸水纸压片，先用铅笔的橡皮头轻敲几下，再用拇指适当用力下压，注意勿使盖玻片平移，压好片子即可镜检。或者取处理好的根尖分别置于2～4个载玻片上,各加1～2滴醋酸洋红,静置10～15min烤片,在酒精灯上反复3～5次,以载玻片上出现水汽又刚好消失为度，随即拨碎根尖，加盖玻片，复以吸水纸，压片镜检。
6、镜检 根据前述有丝分裂各时期的特点，在显微镜下，先低倍后高倍寻找有丝分裂相，仔细观察，并分析确定时期。如效果理想，即可制成永久制片。
7、永久制片 方法同实验三《花粉母细胞涂抹制片》
五、作业
每人做两张良好的有丝分裂中期图象的永久制片。
实验九 石蜡切片技术
一、实验目的
了解石蜡切片的全过程；掌握取材的原则、切片的方法和染色技术。
二、实验说明
石蜡切片法是动物、植物和病理组织切片制作上最重要、最常用的一种方法。除某些材料确实经不住石蜡法中各种药剂的处理或加温而不能应用外，一般的材料都可以采用石蜡切片法。
石蜡切片法的优点是可以切出极薄的切片，并可制作大批或连续的切片。而且用石蜡包埋的组织块还能长期保存。
三、实验材料用具药品
1、材料 蚕豆、小麦等作物的根、茎、叶、花、果实及子房、花药、胚胎等。
2、用具 单面刀片、温台、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、烧杯、毛笔、切片机等。 3、药品配制
（1）福尔马林—醋酸—酒精混合固定液（F.A.A.）
50%或70%酒精 90ml
冰 醋 酸 5ml
福尔马林（37%～40%甲醛） 5ml
（2） 1%番红酒精（50%）溶液
取1g番红溶于100ml50%酒精中即得1%番红酒精（50%）溶液。
（3） 0.1%固绿酒精（95%）溶液
取0.1g固绿溶于100ml95%酒精中即得0.1%固绿酒精（95%）溶液。
（4） 甘油蛋清粘贴剂
新鲜鸡蛋蛋清 25ml
甘 油 25ml
石 炭 酸 0.5g
四、实验方法
1、取材 取材时用锋利的刀片、剪子，根据观察的目的和要求把材料切（剪）成小块。在不影响观察的情况下应尽可能切小一点，这样有利于固定液的浸入。要显示哪些部位？是横切还是纵切？这些问题在切材料前必须计划周密。（注：材料要用水清洗干净）。
2、固定 将材料放于FAA固定液中固定24h,有的也可用其它固定液如卡诺氏固定液。有些材料在固定后仍须进一步修切，将材料修切整齐后，再继续固定。
3、浸洗 固定后的材料，根据固定液的不同，分别用水（自来水）、蒸馏水或70%酒精浸洗，目的在于洗去固定液。经过浸洗后的材料，可进一步脱水。也可浸入70%酒精中长期保存。
4、脱水 包埋前的第一个重要步骤为脱水。材料经过浸洗后含有部分水份，而水与透明剂是不能相混合的，所以在透明之前，必须将材料内所含的水份脱去。多以酒精为脱水剂，采用逐渐提高酒精浓度（50%、70%、80%、90%、95%、无水酒精）来减少材料中水份的含量，这样可避免组织过度的收缩。脱水时间应根据组织种类和材料的大小不同灵活掌握。材料较大、较紧密的组织脱水的时间应稍长。反之，材料较小、较疏松的组织脱水时间可相应地缩短。在每级酒精中可浸2～24h。但材料在无水酒精中放置的时间不宜过长，以防组织过度变硬、变脆而造成切片困难。浸在95%酒精及无水酒精中时，最好多换一次新液，更有利于脱水。
脱水的步骤很重要，若脱水的时间过短或酒精浓度不足，则材料中的水份不能完全脱去，当浸入透明剂（二甲苯）时，便不能透明，浸蜡时石蜡也难以透入，致使切片困难。
5、透明 酒精不能兼为石蜡的溶剂，因此，必须先经透明剂透明。因为透明剂（二甲苯或氯仿）可以溶解石蜡，有利于石蜡透入，同时，还有透明溶蜡的作用，以及脱酒精的功效。
二甲苯极易使组织收缩变脆，故浸留时间不宜过长，一般以达到材料透明为止。若材料过大，为了防止组织变脆，可采用冬青油透明。透明后再换两次二甲苯洗去冬青油，便可进行浸蜡。
脱水不尽的材料，一投入二甲苯中便会产生乳白色雾状，这样的材料不会透明，可再退回无水酒精、95%酒精重新脱水。
透明时按下列程序进行：2/3酒精+1/3二甲苯→1/2酒精+1/2二甲苯→1/3酒精+2/3二甲苯→二甲苯（两次），每级时间从30min～1.5h不等，视具体情况而定。
6、浸蜡 石蜡能溶于透明剂中。把已透明的材料投入熔化的石蜡中，即可取代透明剂，而使组织中的一切空隙为石蜡透入而填满，这个步骤称为浸蜡。
将已经透明的材料和二甲苯一起倒入包埋用的小烧杯中，此时可把写好的标签投入二甲苯中，然后轻轻倒入溶解的石蜡（视具体情况选用不同熔点的石蜡），这样，石蜡不断在二甲苯中溶解，不断增加碎石蜡，直至饱和为止，换纯蜡1～2次，在60℃恒温箱中过夜。
7、包埋 包埋是将浸过蜡的组织块包于石蜡中，使组织与石蜡在硬度上有适当的配合，以利于切片。包埋前先折一纸盒，其大小、深浅视组织块的大小而定。
将折好的纸盒放在加热的温台上，然后右手持解剖针，左手从温箱中取出盛材料的小烧杯，迅速将石蜡连同材料和标签一起倒入纸盒中，再用加热的解剖针轻轻拨动材料使其排列整齐，同时使标签有字的一面朝外，以便识别。稍停，待盒中石蜡凝到不致动摇，上表面刚凝固时，将纸盒轻轻压入冷水中使之迅速凝固，半小时后即可取出备用。
8、固着与修整 取保存的材料，卸下纸盒，将蜡块沿材料之间切适当的深沟，用手分裂蜡块，然后切去材料四周的蜡，仅留一部分不使材料暴露并成为适当大小的方块，材料四周的蜡面一定要平整，然后将蜡块粘在台木上。
9、切片 切片时将台木固定在切片机上，切片刀装在刀架上，使蜡块被切面与刀口成平行方向。调整刀口与蜡块的角度，一般以10°以内为宜。角度太大或太小均切不出切片。根据需要的厚度，转动厚度调节器调好切片的厚度。切片的厚度可依据组织构造及观察目的而定。一般常切成6～8μm厚。
以上工作准备妥当后，便可以右手摇动手摇柄进行切片，左手持毛笔轻轻挑起切片。若连续切片，则每片切片会互相连接成为切片带。
10、粘片 粘贴时，在擦净的载玻片上滴一滴粘贴剂，用洁净的小指涂匀，加几滴蒸馏水，将蜡带放在水面上，微加热，蜡带即慢慢展平，待完全展平后，可吸去多余水份，在36℃恒温箱中再行烘干。
11、染色 染色前须经脱蜡，即用二甲苯彻底地溶去切片上的石蜡。一般经过2～3次二甲苯进行脱蜡，约需10～15min。蜡一定要脱干净，否则染色困难。
脱蜡之后，再经过各级不同浓度的酒精，即由浓度高的酒精渐至浓度低的酒精。这个步骤称为复水。在每级酒精中，各浸1～5min。
染色常采用番红—固绿法。
（1）脱蜡；
（2）复水至50%酒精；
（3）1%番红（50%酒精）染色2h左右；
（4）用50%酒精洗去多余的染液；
（5）脱水至95%酒精中；
（6）0.1%固绿（95%酒精）染色10～40s；
（7）95%酒精很快冲洗；
（8）纯酒精脱水；
（9）再透明，以便封固。
12、封固 把切片从二甲苯中取出，用布或纸把组织四周多余的二甲苯擦去。滴一滴树胶在组织上，加盖玻片。树胶浓度要合适，滴多少也要恰当。
加盖玻片时要倾斜地由左边开始盖在树胶和组织上，慢慢向下放平，这样才不会出现气泡。
最后，贴上标签，保存。
五、作业
以小麦叶片或蚕豆的根或其它组织为材料练习石蜡切片全过程并写出实验报告。
实验十 染色体数目变异的诱发及鉴定
一、实验目的
了解人工诱发植物多倍体的原理，掌握植物多倍体的诱导和鉴定方法。
二、实验原理
植物多倍体是指每个细胞中具有3组或更多组染色体的植物。人工诱导多倍体的方法很多，但最常用而且最有效的方法是利用秋水仙素来诱导。其诱发作用是由于秋水仙素抑制了分裂细胞纺锤丝的形成，使每个染色体纵裂为二后，不能分向两极，同时细胞也不能分裂成两个细胞，这样每个细胞内染色体数目增加了一倍，成为多倍体细胞。若药物浓度合适，多倍体细胞一定时期后可恢复常态，继续分裂，并在此基础上进一步发育成多倍体的器官或完整的多倍体植物。
三、实验材料用具药品
1、材料 洋葱或番茄根尖。
2、用具 显微镜、镊子、刀片、搪瓷盘、烧杯、广口瓶、量筒、载玻片、盖玻片、小滴瓶、指形管、铅笔、吸水纸等。
3、药品 O.1％秋水仙素、1M HCl、70％酒精，95％酒精、45％醋酸、改良苯酸品红、卡诺氏固定液等。
四、实验步骤
1、多倍体诱导 剪去洋葱老根，置于烧杯或广口瓶上，加水至刚与根部接触为止，室温下培养，让其长出新的不定根后（蚕豆置培养皿催芽至种子萌发后），再换成0.1％秋水仙素溶液继续培养，直至根尖膨大为止，然后取根尖固定，检查。
固定、解离、染色、压片方法见实验八。
2、镜检 低倍镜下寻找染色体分散的分裂相，换高倍镜分别观察二倍体和多倍体细胞的染色体数目。
五、作业
绘出所观察到的二倍体和多倍体细胞的染色体图，并注明染色体数目。
实验十一 显微摄影技术
一、实验目的
学习显微摄影的操作过程，拍摄和印放显微照片。
二、实验说明
显微摄影是利用显微照相装置，把显微镜下观察到的图象拍摄下来，印放成照片，以供进一步研究和分析。一张好的显微照片可省去许多文字描述，并可作为资料长期保存。
显微摄影的装置种类很多，有小型的显微摄影装置，也有全自动的专用显微摄影装置。显微摄影就是在显微镜上附加显微照相机。在观察目镜以上的延伸部分，光线分为两路，一路进入照相机成象，另一路进入照相调整目镜，供使用者拍照时对焦、取景及协调画面之用。这两路光线焦点同步，只要在照相时调整目镜中观察的图象使之清晰，照相机底片成象也将清晰。
三、实验材料用具药品
1、材料 各种临时或永久的染色体制片。
2、用具 附摄影装置的显微镜、放大机、135胶卷、暗室、暗袋、显影罐、显影盘、定影盘、上光机、3号和4号放大纸等。
3、药品 显影液（D-11、D-72、D-76等型号）、定影液冰醋酸等。
四、实验步骤
1、染色体玻片中图象的选择 供显微摄影用的染色体临时制片或永久制片应表面无伤，内无气泡，外无霉斑，以免由此引起光线乱反射、降低亮度及清晰度。载玻片厚度不易超过聚光镜的焦距，一般在2mm以内，盖玻片的标准厚度为0.17mm。从染色体制片中挑选出染色体分散清晰、数目完整、反差明显的典型图象，供显微摄影用。
2、物镜和目镜的选择 一般观察用的显微镜物镜和目镜不适于显微摄影，应采用复消色差物镜（镜头外壳刻有Apo字样），平象消色差物镜（刻有PL字样）或平象复消色差物镜（刻有PLApo字样），以消除色差和球面差。物镜按其前短透镜及标本介质不同，可分为干燥系和浸没系物镜。干燥系物镜指普通物镜，而浸没系物镜外壳前端常刻一黑环，便于识别。油浸物镜外壳刻有“oil”、“oel”或“Hl”字样；水浸物镜外壳刻有“W”、“water”字样；甘油浸物镜外壳刻有“Glyc”、“Glyz”字样。在焦距和数值孔径相同时，浸没系物镜的象差校正比干燥系物镜完善，成象质量好。由于浸没液折射率大于空气的折射率，从而提高了物镜的分辨率。采用浸没系物镜，可消除物镜前端透镜表面的杂乱反射光，增加图象反差。附有摄影装置的显微镜，备有摄影目镜，其外壳刻有“photo”或“FK”字样，专供摄影使用。为了提高影象质量，消除象差等色差，应注意调配物镜和目镜组合，如用平象复消色差物镜和摄影目镜或平象目镜组合使用时，应考虑有效放大率、分辨率、焦点深入和视野宽度等问题。一般物镜数值孔径大的，分辨率高，物象清晰；但焦点深度和视野宽度降低。选用物镜和目镜主要着眼于提高图象的分辨率和清晰度，即选用数值孔径大的平象复消色差的中、高倍油浸物镜，兼顾焦点深度和视野宽度，并选用相宜的低倍摄影目镜。焦深和视野不足时，适当调换物镜，降低数值孔径或放大倍数。
3、显微镜照明光源的调整 显微镜摄影采用中心亮视野透射照明法，照明光束中轴与显微镜的光轴需在同一直线上。当前，普遍采用的是科勒（Köehler）照明法，这是一种最佳的中心亮视野照明。科勒照明法是光源的灯丝在聚光器的孔径光阑上成束，即在物镜后焦面上成象。这样视野内照光均匀，不会烤焦被摄材料，并能极为有效地控制被照明的视场及其照明孔径。一般在不过多地降低分辨率的前提下，把孔径光阑调到所用物镜孔径的60%～70%。
4、滤色片的选择 为提高影象反差，应选用适当的滤色片。一般是选用与被摄物体吸收的色光相同的滤色镜。即选用被摄物体的补色滤色镜，可达到理想的影象对比，具体选用参见表11-1。
表11-1 常用的生物染料所采用的滤色片
┌──────┬─────┬──────┬┬──────┬─────┬─────
│ 染 料 │吸收光带nm│推荐的滤色片 染 料 │吸收光带nm│推荐的滤色片│
├──────┼─────┼──────┤├──────┼─────┼─────
│酸性品红 │ 530—560 │ 绿＋深黄 ││海登汉苏木精│ 560—600 │ 绿＋橙 │
│碱性品红 │ 520—550 │ 绿＋深黄 ││甲基紫 │ 560—600 │ 绿＋橙 │
│洋红 │ 500—570 │ 绿＋深黄 ││亮绿 │ 600—660 │ 纯 红 │
│结晶紫 │ 550—610 │ 绿＋深黄 ││甲基绿 │ 620—650 │ 纯 红 │
│埃利希苏木精│ 部分绿色 │ 绿＋深黄 ││番红O │ 480—540 │ 绿＋蓝 │
│苯胺蓝 │ 550—620 │ 绿＋橙 ││伊红Y │ 490—540 │ 绿＋蓝 │
└──────┴─────┴──────┴┴──────┴─────┴─────
5、拍摄
（1）胶片的选择 感光速度快的胶片银粒粗、反差小、灰雾大、保存性差；而感光速度慢的胶片银粒细、反差大、灰雾小、保存性好。所以显微摄影力求使用感光速度中等（17DIN）或慢速的胶片，以便获得银粒细腻、反差高、清晰度高的摄影效果。
（2）取景和聚焦 取景聚焦前，首先进行屈光度调节，使目镜取景器适用各种不同视力者，达到准确的聚焦。方法是调节测视目镜取景器的屈光度调节环，改变焦距，直到清晰地辨识出双十字线为止。取景时，要是被摄的物体影象中心位于长方形景框的对角线中心。取景完成后，转动显微镜的粗细调螺旋，使视野中物体影象的焦点聚于暗箱的焦平面上。注意在取景聚焦完毕时，应立即揿下快门按钮。因为聚焦后的微小颤动，也会引起聚焦的改变，使拍出的底片影象模糊不清。
（3）曝光时间的确定 曝光时间由物镜的数值孔径和倍数、目镜倍数、光源强度、光阑大小、胶片的感光度、标本的厚薄、颜色的深浅和滤色片等多方面因素所决定。合适的曝光时间需经试验取得，具体方法是固定以上条件，变换曝光时间，从中找出最佳曝光时间。先进的全自动显微摄影装置，一般无需进行曝光时间试验。
6、胶卷冲洗 冲洗胶卷有罐中显影、盘中显影等方法。采用何种显影液，应视拍摄的对像和对照片的要求而定。罐显的具体步骤如下：
（1）在暗室或暗袋中取出照好的胶卷，胶卷的药膜面应向里，与胶带一起卷于显影罐轴上，注意胶卷一定要入槽，不能相互粘贴，以免药液进不去，显影不均匀。上好胶卷，盖上显影罐盖，从暗袋中取出。
（2）往显影罐中注入自来水，转动数次，浸透胶片，以免药膜面上发生气泡或显影不均匀，然后再将水倒出。
（3）加入显影液（事先调到20℃）后，每隔1～2min转动显影罐轴心，使显影均匀。D—11显影液为5min，D—72显影液为7～8min，D—76显影液为13～14min。
（4）倒出显影液，再注入自来水迅速冲洗后倒出，加入定影液，常转动显影罐轴心，定影15～20min。
（5）倒出定影液，取出胶卷，用流水冲洗30min或更长些，以除去底片中残留的大苏打杂质和可溶性复性银盐。水洗后将胶卷挂在通风无灰尘的地方晾干。
冲洗后的底片，如发现底片太厚（曝光或显影过度引起）或太薄（曝光或显影不足引起），采用不同反差的相纸仍得不到良好的照片时，最好重新拍摄、冲洗。加入标本无法得到时，可采用底片的减薄法或加厚法做适当的补救。
7、印相和放大 印相是将相纸直接在底片上印出照片；放大则是利用投影使放大纸感光，放出更大照片。放大的具体操作过程如下：
（1）放大纸的选择 放大纸按放大性质分为1、2、3、4号。号数的大小是指纸性软硬程度。选择放大纸的一般原则是底片反差弱的，要选用硬性纸；反差强的要选用软性纸。染色体照片常采用3号或4号光面放大纸。
（2）放大的操作程序 ①安放底片药膜向下；②调整放大机机身的位置，直至影象大小符合所需放大尺寸；③调节镜头与底片间的距离，直到投影在放大板上的影象清晰为止。调焦完毕后，应将光阑收缩至适当程度，以控制曝光量和保证影纹清晰；④为决定曝光时间，放大前可用小块放大纸做分段曝光试验，找出合适曝光时间。⑤关闭放大机内光源（或加红绿色镜于镜头上，使投射出来的光为红色），取出裁好的放大纸，膜面朝上，平放在放大压板的框子内，即可进行曝光。
8、洗相
（1）显影 曝光后的相纸放入D—72显影液（1份原液加2份水，20℃）中显影1～2min。
（2）停显 显影合适后即移到停显液中，漂洗10～20s。
（3）定影 在定影液中最少15min。 （4）冲洗 流水冲洗60min以上。
（5）上光 在上光机上给放大的照片上光。
9、放大倍数的计算 方法一：在显微照相的同时，对镜台上测微尺进行拍摄，放大成所需照片一样大小，然后根据照片上的实际长度，计算放大倍数（表11—2）。方法二：在底片上刻出已知长度，或者用一薄的透明纸，刻度朝下放在底片的位置上，在以放大后的长度除以已知长度，即得放大倍数。
表11—2 放大倍数的计算
┌───────┬──────┬─────┐
│镜台测微尺 │放大后的长度│总放大倍数│
├───────┼──────┼─────┤
│1/100mm │1mm │ 100倍 │
│1/100mm │10mm │ 1000倍 │
│1/100mm │20mm │ 2000倍 │
└───────┴──────┴─────┘
五、作业
1、利用制作的临时片或永久片材料，拍摄和印放合格的染色体照片。
2、简要描述显微摄影过程中应注意的主要技术环节。
实验十二 植物染色体组型分析
一、实验目的
观察分析植物细胞有丝分裂中期染色体的长短、臂比和形态特征，学习染色体组型分析的方法。
二、实验说明
各种生物染色体的形态、结构和数目都是相对稳定的。每一生物细胞内特定的染色体组成，叫做染色体组型。染色体组型分析，也称核型分析，就是研究一个物种细胞核内染色体数目及各染色体的形态特征，如对染色体的长度、着丝点位置、臂比和随体有无等观测，从而描述和阐明该生物的染色体组成。为细胞遗传学、分类学和进化遗传学等研究提供实验依据。
在植物根尖等分生组织中的细胞有丝分裂中期，染色体具有较典型的特征，且易于记数，因而染色体组型分析大都以这一分裂时期进行观测。在染色体组型分析时，染色体制片要求分裂相多，染色体分散，互不重叠，能清楚显示着丝点位置。然后通过显微测量或显微摄影，测量放大照片上的每个染色体，根据染色体的长度和其它形态特征，依次配对排列、编号，并对各染色体的形态特征作出描述。
三、实验材料用具药品
1、材料 洋葱(Allium cepa,2n=16)、蚕豆(Vicia faba,2n=12)、黑麦(Secalecereale,2n=14)、大麦(Hordeum vulgare,2n=14)的根尖。
2、用具 显微镜（附摄影装置）、冰箱、恒温水浴锅、135胶卷、目镜测微尺、镜台测微尺、载玻片、盖玻片、烧杯、酒精灯、剪刀、镊子、解剖针、刀片及毫米尺等。
3、药品 无水酒精、70%酒精、冰醋酸、碱性品红、苯酚、甲醛、山梨醇、对二氯苯、α-溴萘、1M盐酸、0.05%秋水仙碱。
改良苯酚品红染色液的配制
A液：称3g碱性品红溶于100ml70%的酒精中（此液可长期保存）。
B液：量10mlA液，加入90ml5%苯酚水溶液中（此液限2周使用)。
量45mlB液，加入6ml冰醋酸和6ml福尔马林，即制成苯酚品红染色液。
量10ml苯酚品红染色液，加入90ml45%醋酸和1g山梨醇，即制成改良苯酚品红染色液，
（山梨醇稍多，会出现结晶，影响制片效果）。
对二氯苯饱和液和α-溴萘混合液 称取10g对二氯苯溶于100ml40℃蒸馏水中，振荡摇均冷却至室温，加入1滴α-溴萘静置过夜。
四、实验步骤
1、染色体标本玻片的制作
（1）种子萌发和取材 洋葱鳞茎幼根长至2cm左右时切取。蚕豆种子浸种发芽，待幼根长至3cm左右时切取主根尖，待其次生根长至1cm左右时可再切取。黑麦和大麦种子置于培养皿内的湿滤纸上，在25℃恒温箱中培养，待幼根长至1cm左右时切取。
（2）预处理 预处理的目的是改变细胞质的粘度，破坏或抑制纺锤体的形成，使染色体缩短并易于分散。预处理方法视不同材料而异，常用的方法有以下两种
药物处理 洋葱和蚕豆根尖在固定前，用0.05%秋水仙碱溶液处理2h或用对二氯苯饱和液和α-溴奈混合液在20～25℃下处理2h。
低温处理将黑麦和大麦刚切取的幼根放在蒸馏水中，置0℃～4℃冰箱内处理24h。此法对禾本科植物的处理效果较好。
（3）固定 经预处理的材料用新配制的卡诺氏固定液固定0.5～24h，然后换入70%酒精中，置冰箱内备用。
（4）解离 取已固定的根尖数条，经蒸馏水冲洗后，加1M盐酸在60℃恒温水浴锅中解离；洋葱根尖约需10min，蚕豆、黑麦和大麦根尖约需15min。
（5）染色和压片 解离后的幼根经蒸馏水冲洗后，置于洁净的载玻片上，用刀片切取根尖分生组织，用镊子或解剖针将根尖捣碎后，滴一滴改良苯酚品红染色液，染色后片刻即盖上盖玻片，用手指按住盖玻片一角，再用铅笔或解剖针，垂直轻敲盖玻片，也可在酒精灯上略加热后再垂直轻敲，以利材料分散。用改良苯酚品红染色后，染色体呈紫红色，而细胞质不染色。
（6）镜检和摄影 经镜检，对各条染色体处于同一平面、分散均匀、数目完整、随体和着丝点处不断裂的细胞，进行显微摄影。
2、染色体照片的测量分析 经显微摄影、冲洗放大（参见实验十一）的染色体照片按下列程序进行分析。
（1）测量 依次测量染色体长度，长臂和短臂的长度（分别量到着丝点中部），计算臂比时，长臂长度为分子，短臂长度为分母（随体计入臂长须注明）。染色体长度的表示方法有两种：
绝对长度 即用测微尺直接在显微镜下测量得到的实际长度（μm），或经显微摄影后在放大照片上的换算长度。
相对长度 指单个染色体的长度占单套染色体组（性染色体除外）总长度的百分数。
单个染色体长度
染色体相对长度＝────────×100%
单套染色体组全长
（2）配对 将放大照片上剪下的同源染色体进行配对。配对的根据是随体的有无及大小，臂比是否相等，染色体长度是否相等。
（3）排列 将配对好的同源染色体按下列原则进行排列，并正式编上序号，即染色体长的在前；具随体染色体、性染色体排在最后；若有二对以上具随体染色体，则大随体染色体在前，小随体染色体在后。异源的染色体组（如小麦的A、B、D组）要分别排列。
（4）剪贴 把上述已经排列的同源染色体按先后顺序粘贴在绘图纸上。粘贴时，应使着丝点处于同一水平线上，并一律短臂在上，长臂在下。
（5）分类 臂比是反映着丝点在染色体上的位置。据此可确定染色体所属的形态类型（表12-1）。
表12-1 染色体的形态类型
───────────┬────────┬─────
染色体类型 │臂比(长臂/短臂) │ 符号
───────────┼────────┼─────
中间着丝点染色体 │ ＜1.7 │ M
近中间着丝点染色体 │ 1.7～3 │ SM
近顶端着丝点染色体 │ 3～7 │ ST
顶端着丝点染色体 │ ＞7 │ T
───────────┴────────┴──────
（6）填表 将上述结果整理成“染色体形态测量数据”表。表中包含下列各项：染色体序号、绝对长度（μm）、相对长度（%）、长臂长度（μm）、短臂长度（μm）、臂比和染色体形态类型。表头注明单倍体染色体组的染色体实际总长（μm）。
（7）综合描述 说明供试材料的染色体总数；染色体组型的公式，如蚕豆的染色体组型公式为2n=2M(SAT)＋10T；染色体的大小；染色体组型的分类。
染色体大小的确定：规定1μm以下的为极小染色体；1～4μm的为小染色体；4～12μm的为中染色体；长于12μm以上的为大染色体。
染色体组型的分类：即核型的分类。同一核型中染色体相对大小不一，一般可根据核型中染色体臂比及其比值大小，以及它们所具有的数目比例而划分，由M型染色体组成的，称为对称性组型；大多数由M型染色体组成的，称为基本对称组型；大多数由SM型和ST型组成的称为基本不对称组型；由ST型组成的，称为不对称组型。
（8）翻拍绘图 将剪贴排列好的染色体组型图进行翻拍，用座标纸或绘图纸绘制成染色体模式图。
五、作业
1、对已拍摄放大的染色体图片制作染色体组型图，并绘制染色体模式图。
2、染色体组型图上所测量的数据分别填入表12-2，写出染色体形态类型。
表12-2 染色体形态测量的数据 总长度（μm）
┏━━━━━┯━━━━━━━┯━━━━━━━┯━━━━━━━┯━━━━━━━┯━━━━━━━━┯━━━━━┓
┃染色体序号│绝对长度(μm) │相对长度(μm) │长臂长度(μm) │短臂长度(μm) │臂比(长臂/短臂) │染色体类型┃
┃ │ │ │ │ │ │ ┃
┠─────┼───────┼───────┼───────┼───────┼────────┼─────┨
┃ │ │ │ │ │ │ ┃
┃ │ │ │ │ │ │ ┃
┃ │ │ │ │ │ │ ┃
┃ │ │ │ │ │ │ ┃
┗━━━━━┷━━━━━━━┷━━━━━━━┷━━━━━━━┷━━━━━━━┷━━━━━━━━┷━━━━━┛
3、简要描述实验观测到的染色体组型结果。
实验十三 细胞核内DNA的鉴定
一、实验目的
学习和掌握鉴定植物组织细胞中DNA分布的孚尔根（Fenlgen）反应染色法。
二、实验说明
孚尔根染色法是鉴别细胞中DNA的组织化学方法。细胞中的DNA在1M HCl，60℃水解作用下，其嘌呤碱与脱氧核糖之间的糖苷键被破坏，嘌呤碱脱掉，使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基获得自由状态。水解后，组织经水洗，移入希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂与露出来的醛基发生反应，使试剂中无色的亚硫酸品红分子转变成紫红色的品红碱。因此，根据紫红色出现的部位，即可鉴定DNA的存在。这一反应是1924年由Feulgen和Rossenbeck所发现和确定的，是DNA的一个特异性检查法。
三、实验材料用具药品
1、材料 水稻、小麦、玉米、蚕豆、洋葱等的根尖。
2、用具 显微镜、恒温水浴锅、试管、载玻片、盖玻片、镊子、刀片、吸水纸。
3、药品配制
（1）1M HCl 量取比重为1.18的浓HCl 82.5ml，加蒸馏水917.5ml即可。
（2）希夫试剂 将0.5g 碱性品红徐徐加入煮沸的100ml蒸馏水中，用玻璃棒搅拌，使之充分溶解，待溶液冷却至58℃左右，过滤于棕色瓶中。当滤液冷却至25℃左右时，再加入10ml1M HCl和0.5g亚硫酸氢钠，摇动，溶解后密封于棕色瓶中，置于黑暗低温处。次日检查溶液颜色，须呈无色透明或淡茶色才可使用。若稍呈红色可加入0.5g活性炭连续摇动，在4℃下静置过夜，然后过滤脱色。
（3）漂洗液 将5ml1M HCl和5ml10%亚硫酸氢钠溶液分别倒入容量瓶中，再用蒸馏水定
容至100ml。注意，此液必须随用随配。
四、实验步骤
1、取材 植物根尖的取材参见实验八《有丝分裂》。
2、水解 试管1：取洋葱根尖数条，放入试管，加入数滴1M HCl浸没根尖，在60℃下水解10min，然后用蒸馏水换洗2次。试管2（对照）：另取洋葱根尖数条，投入试管，加蒸馏水浸没根尖，在60℃下处理10min，然后把蒸馏水倒去。以下各步骤两试管相同。
水解是本实验成败的关键之一，重要的是时间和温度。因为核酸的水解有两种方式:
①嘌呤碱被很快除掉，脱氧核糖中的醛基显露出来，②组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。在短时间作用后，第1种方式占优势，这时用希夫试剂染色，染色体的染色作用强。如果温度过高或时间过长，造成水解过度，糖与醛基之间的键被破坏，醛基流失到水解液中，使水解液中的希夫反应增强，而染色体中希夫反应减弱。反之，则不能出现显露的醛基，不能呈现颜色反应。
3、染色 两试管中均滴加希夫试剂，浸没根尖，立即置于阴暗处处理0.5～1h，然后用漂洗液换洗3次，每次2min，再用蒸馏水换洗2次，每次2min。
4、压片镜检 分别取上述两试管中的根尖，置于载玻片上，滴一滴45%醋酸，然后压片镜检。
五、作业
1、分别制作经孚尔根染色和对照处理的临时片2张，并根据镜检结果绘图。
2、比较根尖经盐酸水解处理与否所获得的结果，并作出解释。
实验十四 高等植物核DNA的简易快速提取
一、实验目的
学习高等植物核DNA的简易提取方法和纯度检测技术，为外源DNA的花粉管道导入提供DNA。
二、实验说明
植物核DNA是双链高分子，在根尖、顶芽、黄化苗等幼嫩的组织或器官中含量丰富，它易溶于水，而不溶于有机溶剂。因植物组织内含有内源核糖核酸酶（DNase），当植物组织破坏时，植物核DNA易被降解为短链小分子。可以通过低温操作，调节pH值，降低DNase的活性，并在抽提液中加入金属螯合剂（乙二胺四乙酸二钠盐，简称EDTA）除去酶活性所需的辅助因子Ca++和Mg++，可使DNase基本失活。植物核DNA与蛋白质、RNA共同存在，在提取过程中，需要通过蛋白质变性剂（氯仿）和RNA酶的处理，使植物核DNA纯化。
三、实验材料用具药品
1、材料 避光培养的小麦、玉米、高粱或水稻等幼苗。
2、用具 冰箱、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、酸度计、天平、剪子、研钵、烧杯、量筒、三角瓶、试管、玻璃棒、移液管。
3、药品 氯化钠、柠檬酸三钠盐、EDTA、十二烷基硫酸钠（SDS）、氯仿、异戊醇、高氯酸钠、95%乙醇、RNA酶（RNase）。
4、试剂配制
①10×SSC 1.5M氯化钠＋0.15M柠檬酸三钠盐
②研磨缓冲液 0.45M氯化钠＋0.045M柠檬酸三钠盐＋0.1M EDTA＋1% SDS
③0.1×SSC 0.015M氯化钠＋0.0015M柠檬酸三钠盐
四、实验方法
1、植物核DNA的提取
（1）称取去根的黄化幼苗（10—30g）洗净剪碎，放入研钵内在冰箱内冷冻半小时。加入等量（W/V）的研磨缓冲液，在冰浴下迅速（5min）研磨成匀浆。
（2）将匀浆倒入三角瓶内，加入等体积的氯仿—异戊醇（24：1 V/V）混合液，充分摇荡半分钟，以脱去组织蛋白质。然后离心（4000rpm）5min，用细口滴管细心地吸出最上层含核酸的水溶液留用，弃去中、下层细胞碎片、变性蛋白质、氯仿等残物。
（3）将收集的上清液倒入一个在72℃水浴中予热的三角瓶内，并在72℃下继续保温3～4min（不得超过4min），以灭去组织中的DNase。然后取出迅速放入冰浴中冷却，随后加入上清液四分之一体积的5M高氯酸钠溶液，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1M。
（4）再加入等体积的氯仿—异戊醇混合液，振荡半分钟成乳状液。然后离心（4000rpm）5min，用滴管吸出上层含核酸的水溶液，移入烧杯内。
（5）以滴管沿烧杯液面缓缓加入2倍体积预冷的95%乙醇，然后用玻璃棒轻轻搅动，将出现的纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上（缠绕不成功时，通过离心收集）。
（6）将上述沉淀溶解在适量的0.1×SSC溶液中，搅拌到完全溶解后，加入此溶液十分之一体积的10×SSC溶液，使溶液最终浓度为1×SSC。可按步骤（5）、（6）重复一次。
（7）加入RNase溶液，使其最终浓度为50～70μg/ml，在37℃下保温30min，以除去RNA，加入此溶液四分之一体积的5M高氯酸钠溶液，然后加入等体积的氯仿—异戊醇混合液，振荡半分钟，离心（4000rpm）5min。收集上层水溶液，再次除去残留的蛋白质和所加的RNase。
（8）按步骤（5）的程序加入乙醇后，将DNA沉淀挑出，再按步骤（6）的程序将DNA最后溶解于1×SSC溶液中，即得到纯化的DNA溶液。
2、DNA 纯度及浓度测定
（1）纯度测定 取少许样品，用1×SSC缓冲液依次稀释5倍、25倍、100倍。测定波长为230nm、260nm和280nm处的光吸收值。计算比值，如A230/260≥A260/280≥1.8，即表明RNA已除干净，蛋白质含量不超过0.3%，DNA纯度符合质量要求。
（2）浓度测定 从260nm处的光吸收值读数可以计算样品中的DNA浓度，1 O.D.值相当于50μg/ml双链DNA。
DNA浓度（μg/ml）＝50×O.D.260×稀释倍数
五、作业
4人一个小组，称取10g黄化苗进行DNA的提取，测定其纯度和浓度，并写出实验报告。
实验十五 外源DNA的花粉管道导入技术
一、实验目的
学习并练习外源DNA的花粉管导入技术。
二、实验说明
授粉后外源DNA导入技术的原理是利用植物开花授粉后天然形成的花粉管通道，将含有目的基因的外源DNA导入到胚囊卵细胞位置，使外源DNA（基因）转化卵细胞、合子、或早期胚细胞。直接获得外源基因转化的种子或变异的后代。
以植物整体拿到种胚细胞为受体的外源DNA导入技术，比以离体细胞或原生质体为受体的倒入技术简单实用。可以直接利用生产上栽培植物进行遗传操纵，避免体细胞变异，在保留原来优良性状的基础上加以基因改良，育种时间比常规缩短一半，我国在棉花与水稻的分子育种实践已得到证明。
三、实验材料用具药品
1、材料 高粱或水稻核DNA（浓度为300μg/ml）；若干小麦品种。
2、用具 剪子、镊子、铅笔、别针、羊皮纸袋、滴管、微量注射器等。
四、实验方法
1、小麦去雄授粉（方法见实验十八《小麦有性杂交技术》）。
2、授粉1～2h后，用剪刀剪去柱头。用滴管或微量注射器滴1～2滴DNA溶液，滴后套袋。
3、1h后重复滴DNA溶液一次，滴后套袋。
五、作业
4人一组做两穗，10天后观察记录结实情况，写出实验报告。
实验十六 大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞的制备和转化
一、实验目的
1、了解转化的概念及其在分子生物学中的意义；
2、学习氯化钙法制备E.coli感受态细胞；
3、学习将外源DNA转化受体细胞及筛选转化子的方法。
二、实验说明
转化（Transformation）是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传，基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（R-、M-），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法、CaCl2、RbCl、KCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制和表达实现遗传信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的细胞）。
本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使受体菌处于感受状态。RbCl（KCl）法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-20℃或-70℃保存1～6个月。
本实验用的外源DNA是pBS质粒，它带有氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和lacZ基因，可通过Amp抗性和α互补两种特征来筛选转化子。转化子扩增后，可将转化的质粒提出，进行电泳，酶切等进一步鉴定。
为了提高转化效率，实验中要注意以下几个重要因素：
1、细胞生长状态和密度 不要用已经过多次转接或于4℃储存的培养菌，最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液，细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的O.D600来控制。DH5α菌株的O.D600为0.5时（培养约2～3h），细胞密度在5×107个/ml左右（不同的菌株情况有所不同）比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。
2、质粒的质量和浓度 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的DNA（cccDNA）。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50μl的感受态细胞达到饱和。
3、试剂的质量 所有的试剂如CaCl2等均需最高纯度的（GR.或AR.），并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4、防止杂菌和杂DNA的污染 整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、Tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理；所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂，DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选，鉴定带来不必要的麻烦。
三、实验材料用具
1、材料
（1）E.coli DH5α菌株R-，M-，Amp-
（2）pBS质粒DNA：购买或实验室自制。
2、用具
（1）恒温摇床； （5）微量离心机；
（2）无菌工作台；（6）4℃，-20℃，-70℃冰箱；
（3）恒温水浴锅；（7）恒温培养箱；
（4）制冰机； （8）分光光度计。
3、试剂
（1）LB固体和液体培养基：蛋白胨（tryptone）10g，酵母提取物5g，NaCl10g，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1L，高压下蒸汽灭菌20min。固体培养基加琼脂粉12g/L，高压灭菌。
（2）氨苄青霉素（Amp）母液：100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。
（3）含Amp的LB固体培养基：含氨苄青霉素50μg/ml。
（4）含X-gal和IPTG的筛选培养基：
X-gal储液：20mgX-gal溶于1ml二甲基甲酰胺，配制成20mg/ml储液，外包黑纸，储存于-20℃。
IPTG储液：200mgIPTG溶于1ml的重蒸水中，配成200mg/ml储液，0.22μm微孔滤膜过滤灭菌，置-20℃储存。
在LB平板上加40μlX-gal储液和4μlIPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂均，于37℃放置4～7h，使液体完全被吸收。
注：1、此培养基可用麦康凯琼脂（MaConkey Agar）制成的平板代替，在含有适当抗生素的这种平板上，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子则为白色菌落，该产品筛选效果同蓝白色斑筛选，且价格低廉。
2、X-gal全称为5-溴-4氯-3吲哚-β-D-乳糖苷酶（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside），它经半乳糖苷酶（β-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物而显蓝色。
IPIG是异丙基硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside），为非生理的诱导物，它可以诱导LacZ的表达。
泭 （5）0.1M/L CaCl2溶液：称取1.1gCaCl2（无水、分析纯），溶于50ml重蒸水中，定容至100mL，高压灭菌。
四、实验步骤
1、受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37℃下振荡培养12h左右，取1ml培养液转入100mlLB中，37℃振荡培养2～3h至对数生长期，即O.D600=0.5左右。
2、感受态细胞的制备（CaCl2法）将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，3000g离心10min，倒尽上清；用预冷的0.1M/L的CaCl2溶液50ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min，于4℃下，3000g离心10min，弃去上清；加入10ml预冷的0.1M/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。
将以上感受态细胞分装成200μl小份，放于冰上，新鲜的感受态细胞在24h之内可直接用于转化，也可加入总体积15%左右的无菌甘油，混均后置于-70℃可保存半年。
3、转化 取200μl摇均后的感受态细胞悬液（如果是冰冻保存的则需化冻后进行下述的操作），加入pBS质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl），轻轻摇均，冰上放置30min后，于42℃水浴中热击90s或37℃水浴5min，迅速置于冰上冷却3～5min，然后向管中加入1ml的LB液体培养基，混均，1h转至恒温摇床上，37℃振荡培养1h，使细胞恢复正常生长状态，所得转化子具有抗药性（Ampr）。
将上述菌液摇匀后取100μl涂布于筛选板上，正面向上放置0.5h，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16～24h，对需显色反应的筛选培养基还需将平板放于4℃冰箱3～4h，使显色反应充分，蓝色菌落明显。
对照组1：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与转化组相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，但涂板时只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上。
4、计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数。
转化组在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积
转化频率（转化子数/每mg质粒DNA）＝转化子总数/质粒DNA加入量（mg）
感受态细胞总数＝对照组2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积
感受态细胞转化效率＝转化子总数/感受态细胞总数
注：本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率并不一定一样。
有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板；而有的转化效率低涂板时必须将菌液
浓缩，才能较准确地计算转化率。
五、作业
详细记录实验过程并写出实验报告。