无创产前染色体非整倍体检测
1,服务简介
染色体非整倍体疾病是危害严重的出生缺陷,常见的21-三体综合征(唐氏综合征)的发病率高达1/600-1/800;对染色体非整倍体疾病进行常规筛查,是降低发病率,提高人口素质的重要手段。无创产前染色体非整倍体检测是一项应用于临床的非整倍体筛查新技术,通过采集孕期母体的外周血(5ml),提取游离DNA(含有胎儿来源的DNA),采用第二代测序平台进行高通量测序,结合生物信息分析,得出胎儿患染色体非整倍体疾病的风险率。 2,技术优势
目前广泛使用的血清学非整倍体筛查有较高的假阳性率,假阳性结果使孕妇接受不必要的介入性产前诊断,如羊水穿刺、脐静脉穿刺或绒毛膜活检,而介入性产前诊断可导致0.5-1%的流产风险,给孕妇造成极大的心理负担;同时,血清学筛查还存在着较高的漏诊率;相较于传统非整倍体检测方法,无创产前染色体非整倍体检测具有如下优势:
1) 无创:抽取孕妇5ml外周血即可完成检测,不增加流产风险;
2) 取样简单:无需复杂的操作和特殊的医疗条件即可完成样本的收集;
3) 极高的检出率及准确性;
3,适用范围
针对染色体非整倍体疾病的产前检测;
作为核型分析结果的参考;
作为核型分析细胞培养失败的补救检测途径;
向不接受或错过有创产前诊断的孕妇提供检测新途径。
4,适用人群
孕早、中期血清筛查高危的孕妇;
有不明原因自然流产史、畸胎史、死胎或死产史的孕妇;
有异常胎儿超声波检查结果( NT、鼻梁高度)的孕妇;
曾生育过染色体非整倍体患儿的孕妇;
希望排除胎儿染色体非整倍体疾病的孕妇;
夫妇一方有致畸物质接触史;
5,服务流程
第二篇:唐氏综合征无创性产前诊断新进展
唐氏综合征无创性产前诊断新进展
2008-01-02
陈华云
(中山大学达安基因股份有限公司, 广州 510665)
【摘要】 唐氏综合征是胎儿最常见的染色体病,为了能够对其快速准确早期诊断,人们一直努力发展新的无创性产前诊断的方法。母血浆中胎儿游离核酸的发现为无创性产前诊断提供了新的可能。随着新的检测技术方法的出现和表观遗传学的发展,许多新的遗传基因表达标记物被发现并将在未来的产前诊断实践中产生巨大的影响。
【关键词】 唐氏综合征;无创性产前诊断;胎儿游离DNA;表观遗传学
Recent developments in noninvasive prenatal diagnosis of Down syndrome CHEN Huayun. DaAn Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University,guangzhou 510665,China
【Abstract】 Down syndrome is the most common chromosomal disease in the fetal. Much effort has been made on developing new non-invasive prenatal diagnostic methods for treatment it in the early stage quickly and accurately. The discovery of circulating cell-free nucleic acid in maternal plasma has opened up new possibilities for noninvasive prenatal diagnosis. With the appearance of new detection methods and the development of epigenetic research, many novel gene-expression and epigenetic markers are found and expected to have a fundamental impact on the future practice of prenatal diagnosis.
【Key words】 Down syndrome;noninvasive prenatal diagnosis;cell-free fetal DNA;epigenetics
唐氏综合征(21-三体综合征)是胎儿最常见的染色体病,在新生儿中的发病率约为1/800,占小儿染色体病的70%~80%,发病率随着母亲年龄的增高而增高。目前我国大约有100万以上的患者,平均20分钟就有1例唐氏综合征患儿出生,全国每年出生的唐氏综合征患儿可多达27万例左右。唐氏综合征患者由于多了1条第21号染色体,主要表现为智力低下,发育迟缓和特殊面容。由于唐氏综合征给父母、家庭和社会带来了无可挽回的痛苦和沉重的精神负担,因此对高龄孕妇等高危人群进行产前诊断尤为重要和必要。当前在进行产前诊断时,必须采取创伤性的手段获取胎儿细胞样本如羊水或者绒毛组织,尽管这些创伤性的手段相对比较安全,但是对胎儿和母亲仍然存在一些风险,因此临床上只对可能怀有遗传异常胎儿的高风险孕妇进行产前诊断。为了避免潜在的风险,在过去几十年中,人们一直广泛应用的一个方法是从母血中分离胎儿有核红细
胞,但是由于胎儿有核红细胞在母血中含量稀少,需要进行细胞富集等种种操作程序从而限制了该方法的发展和实际应用[1]。因此,为满足国家―出生缺陷干预工程‖的需要,临床医学工作者迫切期望建立更安全有效的方法进行无创性产前诊断。
1 游离胎儿RNA在无创性产前诊断中的应用
19xx年,Lo等[2]发现在孕妇血浆和血清中存在游离的胎儿DNA,从孕早期4周左右开始,随着孕周数的增加胎儿DNA的浓度也增加,在胎儿分娩后被迅速清除。这个发现为无创性产前诊断开辟了一个令人兴奋的新途径。相对于胎儿有核红细胞,游离胎儿DNA在整个母血浆DNA中所占比列高,在孕早期和孕晚期可分别达3.4%~6.2%;半衰期短(4-30min),可作为分子标记物对胎儿生理和病理情况进行实时监测;当前的PCR方法即可灵敏检测;母血浆中游离胎儿DNA容易获取。由于胎儿DNA的这些优点,目前已经在胎儿性别鉴定、Rh血型分型等方面得到了广泛应用。但由于血浆胎儿游离DNA毕竟只占母血浆游离DNA的一小部分,为了同母亲来源的游离DNA区分,目前选取胎儿游离DNA标记物主要来自Y染色体遗传位点,这限制了游离胎儿DNA的广泛应用,因此临床上需要找到同胎儿性别无关,但又同胎儿病理学改变密切相关的胎儿特有遗传物质进行无创性产前诊断,从而解决在游离胎儿DNA应用上的难题。
20xx年,Poon等[3]发现了母血浆中存在游离胎儿RNA,由于RNA不稳定,母血浆中游离RNA的存在不仅令人惊奇,而且也为应用游离胎儿RNA无创性产前检测胎儿RNA的表达开启了可能。目前研究发现母血浆胎儿RNA的稳定存在可能在于合体滋养层微颗粒的保护而避免了血浆中RNA酶的消化作用[4],同时研究也发现胎盘是游离胎儿RNA主要的来源并且来源于胎盘的RNA容易被检测到[5]。由于母血浆中游离胎儿RNA不仅具有同游离胎儿DNA类似的特征,而且一些来源于胎盘的游离RNA的同性别无关,且母亲自身无表达,因此母血浆中游离胎儿RNA一经发现就成为研究热点。当前,研究人员应用芯片等方法已经发现10多种妊娠特异的、并且在母血浆中可以检测到的mRNA片段[6]。
在染色体多倍体异常研究方面,Ng等用β-HCG mRNA作为标志分子检测了18-三体和21-三体患儿母血浆中的表达水平,结果发现18-三体患儿母血浆β-HCG mRNA表达水平降低,但是21-三体患儿母血浆中表达水平无差异[7]。由于游离胎儿RNA毕竟只占母血浆中核酸的一小部分,而且存在正常妊娠血浆胎儿核酸同病理妊娠核酸总体含量重叠的情况,应用非21号染色体特异表达的胎儿mRNA含量来说明21号染色体含量异常将非常困难。必须找到21号染色体特异表达的mRNA,而且还必须具有以下特征:该基因应该位于唐氏综合征的关键区域(DSCR);在妊娠的早期即有表达;在有21-三体胎儿的妊娠中有过表达;在妊娠早期的母血浆中能够检测到。
20xx年Oudejans等[8]首先发现了母血浆中存在21号染色体特异表达mRNA片段LOC90625,这为通过定量检测mRNA的表达异常来筛查唐氏综合征提供了可能。20xx年Lo等[9]也在母血浆中发现了位于21号染色体上胎盘特异表达的PLCA4基因片段。
为了通过mRNA来说明21号染色体含量上的差异,Lo等人选择了PLCA4编码区域一个SNP位点,由于在一个正常胎儿,人类染色体的二倍体性使得杂合性SNP其等位基因含量比例将会出现1︰1,而对于一个21-三体的患儿,其等位基因的含量比例将会为1︰2或者2︰1。对于基因编码区的SNP位点而言,每条染色体上特定基因携带的这些SNP位点必将随着转录而传递到mRNA上,成为―RNA-SNP‖,杂合性的RNA-SNP位点的基因含量比例也必定符合基因组DNA杂合性SNP含量的比例情况,因此可以用母血浆中胎盘表达的mRNA来无创性的评估胎盘细胞染色体含量的异常与否,也就可以评估胎儿染色体数目异常与否。Lo等[9]应用介质辅助雷射脱附游离/飞行时间质谱(MALTI-TOF)的方法检测一个―RNA-SNP‖位点,对香港地区66例病例检测后分析发现特异度可达90%,灵敏度可达96%。但由于SNP存在纯合的情况,且Lo等选用的SNP位点其杂合率仅仅45%,当对大样本进行检测时,实际检出率将会降低,因此为了提高诊断的特异度和灵敏度,必须选用杂合度高,多态性信息含量高的多个中国人群PLCA4基因编码区所含有的SNP位点进行分析。另外,应用质谱方法仪器昂贵,操作复杂,且不能对多个SNP位点进行同时分析,因此,如果能够发展新的检测方法,应用当前比较常见的仪器平台,同时进行复合检测,无疑对临床实际应用有重要的价值。
2 游离胎儿DNA表观遗传学标记在无创性产前诊断中的应用
在游离胎儿DNA研究方面,虽然由于母亲血液中也存在大量的母源性的游离DNA背景,大大限制了游离胎儿DNA在唐氏综合征中无创性产前诊断应用,但随着当前表观遗传学的发展,应用DNA甲基化进行无创性产前诊断开始变为可能。表观遗传学研究的是影响基因表达的分子机制,但是不涉及到DNA序列的改变[10]。Poon 等[11]首先对胎儿IGF2-H19区域的DNA甲基化进行研究发现,来源于父系的等位基因为甲基化状态,而来源于母系的等位基因为去甲基化状态,应用甲基化特异性PCR方法即可对此进行区分,由此也就可以在强大的母系游离DNA背景下区分来源于父系的胎儿DNA。尽管如此,由于缺乏另外一条染色体的信息,仍然不能进行染色体数目的分析,必须在母血浆中找到一个游离胎儿DNA的通用标记。
20xx年Chim等[12]研究证实,maspin基因在胎盘细胞中处于低甲基化,而在母血细胞中处于高甲基化。研究已经表明胎盘是母血浆中胎儿核酸的重要来源[13],在此基础上,maspin基因在胎盘和母血细胞中不同DNA甲基化模式,为应用低甲基化的maspin基因作为母血浆中游离胎儿DNA的标记奠定了基础,同时研究发现在血浆中检测到的低甲基化的maspin序列中存在胎儿SNP基因型。这些数据表明表观遗传学的方法能够用来发展所有孕期通用的胎儿DNA标记,而且不受胎儿性别和胎儿与母亲之间遗传多态性的影响。在此研究思路下,20xx年Chan等[14]发现了在胎盘细胞中处于高甲基化而在母血细胞中处于低甲基化的RASSF1A基因,可以直接应用甲基化敏感的限制性内切酶消化的方法来检测母血浆胎盘来源的高甲基化RASSF1A基因,是又一个胎儿DNA通用标记并在母血浆中容易实现检测。类似于应用RNA-SNP的策略,染色体剂量的信息可以通过SNP等位基因比例分析来得到,通过对染色体上的含有胎儿特异性表观遗传学标签位点的分析也可以在强大的母血来源的DNA背景下把胎儿DNA区分开,从
而最终达到确认胎儿染色体数目是否存在异常的目的,这些新发现的表观遗传标记为这种策略的实现提供了可能。
20xx年Tong等[15]通过对母血浆中maspin基因进行表观遗传学检测并对低甲基化的maspin基因序列上的等位基因进行了分析,由于maspin基因位于18号染色体,即可对18-三体的存在进行确认。鉴于这项成果的开创性意义,因此有学者认为应用母血浆中表观遗传学等位基因比率进行检测将会是无创性产前诊断胎儿染色体异常一个非常有前景的方法[16]。在唐氏综合征的研究方面,为了寻找来源于21号染色体可用于诊断的表观遗传标记物,20xx年Old等[17]采取了3种策略筛选差异甲基化的DNA序列:①在母血细胞和胎儿中高度差异表达基因的启动子序列;②选择随机的启动子区域;③选择随机的非启动子区域。用甲基化特异性限制性酶分析的方法筛选了超过200个候选DNA序列,结果在21号染色体上发现了3个差异甲基化序列:AIRE、SIM2和ERG基因,位于21q22.3。对AIRE基因甲基化状态的确认分析表明,AIRE启动子区域的CpG位点是高度差异甲基化的,同时也发现胎儿绒毛标本甲基化状态同胎盘细胞的甲基化状态符合,这也表明胎儿AIRE基因在妊娠早期和晚期其甲基化状态没有发生改变,对于无创性产前诊断唐氏综合征而言是一个重要的候选表观遗传标记。截至目前为止,尚没有21号染色体特异的游离胎儿DNA表观遗传标记用于临床实际产前诊断的研究报道,但这必将成为21-三体无创性产前诊断研究的热点领域。
总之,随着当前生物技术的发展和人们对表观遗传学等多个生物学科的不断深入研究,人们对母血浆中游离胎儿核酸的检测水平也在不断提高,同时对游离胎儿核酸自身携带的遗传标记也有不断新的发现和认识。在此基础上发展起来的一系列检测方法和手段,必将为未来包括唐氏综合征在内的染色体数目异常遗传病的无创性产前诊断开辟新的道路。
参考文献:
[1] Bianchi DW,Simpson JL, Jackson LG, et al. Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal Cell Isolation Study. Prenat Diagn,2002,22:609–615.
[2] Lo YMD,Corbetta N,Chamberlain PF,et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet,1997,350:485–487.
[3] Poon LLM,Leung TN,Lau TK,et al. Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clin Chem,2000,46:1832–1834.
[4] Hasselmann DO,Rappl G,Tilgen W, et al. Extracellular tyrosinase mRNA within apoptotic bodies is protected from degradation in human serum. Clin Chem,2001,47:1488–1489.
[5] Ng EKO,Tsui NBY,Lau TK, et al. mRNA of placental origin is readily detectable in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:4748–4753.
[6] Lo YMD,Rossa W K. Chiu.Prenatal diagnosis: progress through plasma nucleic acids. Nature Review: genetics,2007,8:71-77.
[7] Ng EKO,El-Sheikhah A,Chiu RWK, et al. Evaluation of Human Chorionic Gonadotropin β-Subunit mRNA Concentrations in Maternal Serum in Aneuploid Pregnancies: A Feasibility Study,Clin Chem,2004,50:1055–1057.
[8] Oudejans CB, Go AT,Visser A,et al. Detection of chromosome 21-encoded mRNA of placental origin in maternal plasma. Clin Chem,2003,49:1445–1449.
[9] Lo YMD, Tsui NB, Chiu RW, et al. Plasma placental RNA allelic ratio permits noninvasive prenatal chromosomal aneuploidy detection. Nat Med.,2007,13(2):218-223.
[10] Jiang YH,Bressler J,Beaudet AL. Epigenetics and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet,2004,5:479–510.
[11] Poon L L,Leung T N,Lau T K,et al. Differential DNA methylation between fetus and mother as a strategy for detecting fetal DNA in maternal plasma. Clin Chem,2002,48:35-41.
[12] Chim SSC,Tong YK,Chiu RWK, et al. Detection of the placental epigenetic signature of the maspin gene in maternal plasma. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:14753–14758.
[13] Bianchi DW. Circulating fetal DNA: its origin and diagnostic potential — a review. Placenta,2004,25(Suppl A):S93–S101.
[14] Chan KC,Ding C,Gerovassili A,et al. Hypermethylated RASSF1A in maternal plasma:
A universal fetal DNA marker that improves the reliability of noninvasive prenatal diagnosis. Clin Chem,2006,52(12):2211-2218.
[15] Tong YK,Ding C,Chiu RW,et al. Noninvasive prenatal detection of fetal trisomy 18 by epigenetic allelic ratio analysis in maternal plasma: Theoretical and empirical considerations. Clin Chem,2006,52(12):2194-2202.
[16] Bianchi DW. Will epigenetic allelic ratio analysis turn prenatal diagnosis of trisomy 18 on its EAR. Clin Chem,2006,52(12):2182-2183.
[17] Old RW,Crea F,Puszyk W,et al. Candidate epigenetic biomarkers for non-invasive prenatal diagnosis of Down syndrome. Reprod Biomed Online.,2007,15(2):227-235.