围绕Southern杂交的

系列分子生物学实验训练报告

作者：梅金娟 指导老师：潘君风

摘 要：在潘军风老师的指导下，生命科学学院生物工程134班开展了分子生物学实验技能学习。整个实验围绕“地高辛标记的Southern杂交”为中心，包括要求较高的实验（如RT-PCR扩增目的基因cDNA和Southern杂交）和基础的分子生物学实验。基础实验包括：质粒DNA的提取，琼脂糖凝胶电泳，多聚酶链式反应，植物RNA的提取及电泳，小麦基因组DNA提取、酶切、电泳分析，感受态细胞的制备及转化等。 大部分实验进展顺利，只是提取出的RNA和DNA质量不是很好。另外，RT-PCR的产物电泳结果显示只有引物，没有目的基因。最终分析失败原因可能为材料冻存时间过长。

关键词：southern杂交；分子生物学实验；核酸提取；多聚酶链式反应；电泳

第二篇：分子生物学实验技术

SDS碱裂解法提取质粒

具体方法：

(1) 取菌液1.5 mL至离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清。

(2) 加入100 ul溶液1，充分悬浮菌液；

(3) 加入200 ul溶液2，上下颠倒5次，冰上3 min；

(4) 加入150 ul溶液3，轻晃10 s，冰上3~5 min

(5) 12000 g离心10min，将上清移至新试管；

(6) 加2倍体积异丙醇混匀，室温静置10 min；

(7) 12000 g离心5 min，去掉上清；

(8) 自然干燥沉淀，加30 ul TE buffer，取3-5 ul 酶切电泳鉴定，剩余-20?C保存。 改进之处：

不使用酚/氯仿，时间变短

注意事项：

无

自己的实验感想：

与采用分子克隆中的方法所得结果没有区别。

大肠杆菌感受态细胞制备

具体方法：

1.挑一单菌落接种与20mlLB，过夜

2.按1%（v/v）接种于新鲜培养基，210rpm，约2.5h，至OD.600=0.4。冰浴10min

3.分装于1.5ml预冷EP管，室温离心12，000g，20sec。无菌操作，去上清。

4.每管用1ml预冷0.1M CaCl2(含10%甘油)重悬；冰浴5min；室温离心12，000g，20sec。无菌操作，去上清。

5.每管用100ul预冷0.1M CaCl2(含10%甘油)重悬；-70度保存备用。

改进之处：

无须低温离心；适合与没有冷冻离心机的实验室。

注意事项：尽量减少在室温放置的时间有利于提高感受效率。

自己的实验感想：

由于实验室没有大型冷冻离心机，改进后可以不用跑到公共实验室了：）感受态效率不错，不低于常规方法制作的感受态效率。

质粒DNA的提取纯化（碱法）

1、取1.5ml 培养液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 离心30 秒。

2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。

3、菌体沉淀重悬浮于100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10 分钟。

4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万 不要振荡),冰浴5 分钟。

5、加入150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10 分钟,4℃下12000g 离心5-10 分钟。

6、上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心5 分钟。

7、将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20 分钟，然后4℃下12000g 离心10 分钟。

8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下 12000g 离心5-10 分钟。

9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10 分钟或室温干燥。

10、将沉淀溶于20μl TE 缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。

[注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。

2. 提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋 白尽量除干净需多次抽提。

3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用 异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。

重组子鉴定（菌落PCR）

具体方法：

1.PCR mixture的制备

Taq buffer(10*) 20ul

dNTP(2.5mM) 5ul

Primer upward(50nM) 10ul

Primer downstream(50nM) 10ul

ddH2O 147ul

Taq(2U/ul) 8ul

--------------------------------------------

total 200ul

将上述溶液混匀，10ul每管分装与200ulPCR管中。

2.常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB-Agar平板上轻点，做一copy；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR mixture的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。

3.将混有菌体的PCR mixture置PCR仪按常规条件扩增。电泳检测是否得到目的片断。如有则为阳性克隆。

4.将已经接种有菌落的平板置37度培养箱培养过夜，使菌落扩增；次日挑选阳性克隆做进一步筛选或培养。步骤2也可以不点板，直接接种摇菌，如果使早上做PCR的话，下午就可以提质粒，得到重组载体。 改进之处：节省了常规酶切鉴定耗时费力的缺点。同时加快了试验进程。本人曾经用三天时间完成了一个克隆的构建并表达：第一天早上PCR扩增目的基因，同时抽提载体的质粒；中午酶切，下午连接转化；第二天早上鉴定摇菌，下午抽提质粒转化（转到BL21(DE3)中）；第三天诱导表达。

注意事项：设计引物很关键。一般如果是定向克隆，用载体上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如单酶切或平末端连接），一条引物用载体，一条引物用目的基因上的，这样就可以比较方便的鉴定了，而且错误概率很低：）不过要注意PCR条件的选择，接近最佳犹佳。同时挑取的菌体不宜太多，否则会有非特异性扩增。

自己的实验感想：试验就像游戏，多尝试就会有新发现：）

大肠杆菌质粒提取

1. 过夜培养的菌液倒入1.5ml离心管中，离心，13000rpm，30sec；

2. 倒去管中上清液，在沉淀中加入100μl SolutionⅠ，振荡至彻底悬浮，（以使沉淀与SolutionⅠ充分混合），室温静置10min；

3. 加入200μl SolutionⅡ，立即温和颠倒离心管5-10次以混匀，冰上静置5min；

4. 加入150μl SolutionⅢ，立即温和颠倒离心管5-10次以混匀，冰上静置10min；

5. 13000rpm离心5min，把上清液小心移入另一新的离心管中；

6. 加入400μl苯酚，混匀，室温静置5min；

7. 13000rpm离心3min，将上清液吸至另一新的离心管中；

8. 加入400μl氯仿，混匀，13000rpm离心30sec，取出下相，弃之；

9. 重复上一步骤；

10. 在上清液中加入上清液1/20体积的5M NaCl和上清液2倍体积预冷的无水乙醇，13000rpm离心10min；

11. 此时在离心管底部出现白色的沉淀，小心地倒出上清液，用1ml 70%乙醇清洗沉淀；

12. 13000rpm再次离心5min，倒掉上清液，用真空机使沉淀干燥；

13. 加入TE（pH=7.4，含20μg /ml RNaseA）缓冲液，使质粒溶解于其中，37℃水浴30min后可直接用于酶切，或贮存于-20℃中。

注：SolutionⅠ：0.9克葡萄糖、2.5ml Tris(1.0M, pH=7.5)、2.0ml EDTA(0.5M, pH=8.0)三者用无菌水定容至100ml，高压后使用。使用前加入溶菌酶，使其浓度为5mg/ml。

SolutionⅡ：200μl ,10M NaOH、1ml 10%SDS与8.9ml无菌水混合。现配现用，贮存时间不超过一周。

SolutionⅢ：26.5克醋酸钾用冰乙醇调至pH=4.8，再用无菌水定容至100ml.

时间可能是久了点，但是蛋白质去的很干净，而且也基本上看不到RNA，效果很好，切出来的带很漂亮

质粒转化

具体方法：

1 用1ml过夜生长的细菌培养物接种于500ml型容量瓶中的100mlLB肉汤。在37℃强烈振荡，使细胞生长达到5×10的7次方细胞/ml（OD等于0,6通常需要2－4小时。作每次转化试验需要3ml细胞悬液。 2 把培养物放在冰上冷却10分钟，以4℃以4000转/分钟离心细胞悬液5分钟。

3 弃上清。把细胞重悬于原初始体积一半的冰冷灭菌的50mM氯化钙和10mMTrisHCL（ph80)溶液中。 4 将细胞悬液放在冰裕中15分钟，然后4℃ 4000转/分钟离心5分钟

5 弃上清。把细胞重悬于1/5原初体积（加约3.5ml）的冰冷灭菌的50mM氯化钙和10mM TrisHCL中（加10％甘油）。按0.2ml/份分装在预冷的小管中。4℃储存12－24小时。

6 加入溶于连接缓冲溶液或TE中的DNA，混合并在冰上置30分钟。每次转化反应可以使用到40ug DNA溶解到100ul连接缓冲液或TE中。加入较多的DNA或较大体积的缓冲溶液将影响转化效率。

7 转移到预热的水浴中（42℃）2分钟。

8 每小管加入1mlLB肉汤，37℃保温30分钟至1小时，振荡培养。在此期间能使细菌恢复，并开始表达对抗生素的抗性，

9 利用涂布法或上层琼脂法把适量的细胞涂布在选择培养基上。

10 把平板置于37℃培养，12－16小时应发现菌落