1 实验概述
1.1 实验目的
实验过程中，主要通过碱裂解法提取质粒DNA、对质粒进行双酶切、并连接构建成重组DNA分子、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备、感受态细胞的转化以及目的蛋白质gfp的正常表达，来完成一系列分子生物学基础实验。
通过本实验，学习并掌握碱裂解法、双酶切、氯化钙法制备感受态细胞的制备及采用α互补现象进行重组DNA鉴定的原理和方法。
1.2 实验原理
质粒是细菌内共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞特定的表型，经过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极广泛的用途。
本次实验中，分子克隆质粒载体T所携带的外源基因是gfp绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将gfp基因插入表达载体P中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。
为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过HandⅢ和NCOⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段gfp和表达载体-P质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断gfp基因工程菌的构建效果。
2 实验流程
2.1 实验安排表
2.2 实验流程图
① 质粒DNA的提取与纯化 碱液裂解法；乙醇洗涤纯化
（T-gfp质粒作为克隆载体、P32作为表达载体）
② 通过观察电泳图片，来鉴定T、P两种质粒DNA的提取结果 琼脂糖凝胶电泳的方法
③ 对成功提取的T、P两种质粒DNA进行双酶切 限制性内切酶HandⅢ、NcoⅠ
④ T-gfp、P两种质粒的DNA片段的回收 割胶（试剂盒快速回收）
用刀片把凝胶上的目的DNA条带割取下来
⑤ 连接T-gfp、P两种质粒的目的DNA T4噬菌体DNA连接酶
（重组DNA分子的构建）
⑥ 大肠杆菌感受态细胞的制备 氯化钙法
⑦ 将连接后的重组DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞 感受态细胞的转化
⑧ 重组子的筛选 含有AMPr的重组子才能在AMP平板上生长
⑨ 将含有gfp、AMPr两种目的基因的重组子进行诱导表达 重组DNA分子的鉴定在平板
上加入底物IPTG
⑩ gfp基因只有在诱导物IPTG和底物X-gal的存在时，才能正常表达，在平板上生成绿色的菌落
构建出含有gfp绿色荧光蛋白基因的工程菌
图2.1 gfp基因工程菌的构建与表达
3 实验操作方法
3.1 质粒DNA的提取
3.1.1 实验概述
1、分子克隆载体
载体是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。
重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。它们的受体细胞都是大肠杆菌。这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。
在本次实验中，我们所选择的克隆载体是大肠杆菌T-gfp质粒。
细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1 kb至200 kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
目前，质粒已成为最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。有许多方法可用于质粒DNA的提取，本次实验采用碱裂解法来提取T质粒的DNA。
2、表达载体
将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E.coli表达信号的控制之下。这样基因
可以转录和表达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体。
大肠杆菌表达载体都是质粒载体。作为表达载体首先必须满足克隆载体的基本要求，即能将外源基因运载到大肠杆菌细胞中
在本次实验中，我们所选择的表达载体是大肠杆菌PBR322质粒。
3、绿色荧光蛋白（GFP）
green fluorescent protein，简称GFP，这种蛋白质最早在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca2+)可产生交互作用。
在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。
GFP荧光极其稳定,在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450～490nm蓝光波长下更稳定。
由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白，其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。
3.1.2 实验目的
1、通过用LB培养液培养含有T-gfp质粒和PBR322质粒的大肠杆菌。
2、利用“碱裂解法”从大肠杆菌中提取出T质粒和P质粒的DNA，然后用乙醇洗涤沉淀，达到纯化质粒DNA的目的。
3.1.3 实验原理
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法，通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，可经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤来纯化质粒DNA，故在分子生物学实验室中常用。
所以，在本次实验中，我们采用了“乙醇沉淀法”来洗涤DNA沉淀物，去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求。
3.1.4 实验仪器、材料及试剂
1、仪器
微量移液枪、微量离心管、台式高速离心机、干燥机、高压蒸汽灭菌锅、常用玻璃器皿等。
2、材料
含有T-gfp质粒和PBR322质粒的大肠杆菌DH5?。T质粒和P质粒的图示如下：
（1）T-gfp质粒（扩增载体）
图3.1 T-gfp质粒载体
（2）PBR322质粒（表达载体）
应用的最广泛的质粒载体是PBR322，它属松弛型质粒，有抗氨苄青霉素和抗四环素两个抗性基因可作为标记基因，有许多种常用的限制酶的切点。其基本结构如图所示：
图3.2 PBR322质粒载体
3、试剂
（1）用于碱法提取质粒DNA的三种溶液
表3.1 碱法提取质粒DNA的三种溶液
（2）缓冲液
TE缓冲液：10 mmol/L Tri-HCl，1 mmol/L EDTA（pH=8.0），其中含有RNase 20 μg/L。
（3）其他试剂
氨苄青霉素(AMP)，异丙醇，70﹪乙醇溶液，RNase液。
3.1.5 操作步骤
1、培养大肠杆菌使质粒扩增
（1）配制LB液体培养基
将下列组分溶解到0.9 L水中，让后再将水补足至1 L：
表3.2 LB液体培养基配方
1 L的LB培养液配制好之后，分别分装到4个三角瓶中，250 mL/个。然后放置到高压蒸汽灭菌锅中灭菌1.5～2 h。灭菌后取出移至超净工作台，冷却到47 ℃左右，每瓶培养液分别加入5 μL的氨苄青霉素（AMP）。
（2）培养大肠杆菌
将带有质粒T-gfp和PBR322的大肠杆菌单菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基2～5 mL中，然后放置在恒温37 ℃的摇床中培养8～16 h。
加入AMP的目的：AMP可以抑制宿主的蛋白质合成，从而阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可以继续复制，若干小时后，拷贝数持续递增。
2、收集和裂解大肠杆菌
（1）取含有质粒T、P的大肠杆菌液体培养液1.5 mL分别装于微型离心管中，转速10 000转/min离心1 min，去掉上清液，加入1 μL溶液Ⅰ，充分混匀后室温下放置5 min。
溶液Ⅰ的作用：所含有的EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制DNase的活性和抑制微生物生长，加入EDTA可以把大肠杆菌细胞中所有的二价金属离子都螯合掉。
（2）加入200 μL新配制的溶液Ⅱ，颠倒2～3次使之混匀，冰上放置5 min。
溶液Ⅱ的作用：十二烷基酸钠（SDS）可以使细胞壁破裂。经SDS处理后，在碱性条件下细菌染色体DNA和质粒DNA都会发生变性。
注意：一是操作时间不能过长，因为在此碱性条件下染色体DNA片段会慢慢断裂；二是操作时动作要温和，振荡激烈也使染色体DNA片段断裂。
（3）加入150 μL冰冷的溶液Ⅲ，轻轻颠倒数次使之缠绕均匀，冰上放置5 min。
实验现象及溶液Ⅲ的作用：溶液Ⅲ加入后，我们可以观察到离心管内出现白色沉淀。KAc中的K离子把SDS中的Na离子置换出来从而形成了不溶性的PDS，由于K离子置换所产生的大量沉淀将绝大部分蛋白质也沉淀下来，同时大肠杆菌的染色体DNA也一起被共沉淀了。醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，一旦发生断裂，染色体DNA就不可能被共沉淀了。
此时，质粒DNA很快可以复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中，用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可以得到质粒DNA。
3、分离和纯化质粒DNA
（1）用台式高速离心机，转速10 000转/min离心5 min，将上清液移入另一干净的离心管中，并加入等体积的异丙醇混匀，室温放置5 min，转速12 000转/min离心5～8 min，弃去上清液。
（2）沉淀用70﹪乙醇清洗一次，离心管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。
加入异丙醇和乙醇的作用：因为有部分蛋白质还未被沉淀出来，所以要用异丙醇进行抽提，然后进行乙醇沉淀才能得到质量稳定的质粒DNA，不然时间一长就会因为掺入DNase而发生降解。加入异丙醇后，溶液界面的分层就会更清晰，便于沉淀的回收。
回收后的沉淀因为可能含有一定的盐类，因此要加入乙醇洗涤沉淀，将盐去除。
（3）每支离心管加入3 μL RNase和30 μL无菌水，然后室温放置10 min，使质粒DNA充分溶解。
加入RNase的作用：使样品中残留的、未降解的RNA降解，避免干扰电泳鉴定的结果。
3.1.6 实验结果
得到分别含有T-gfp质粒和P质粒的样品溶液，各装于两支干净离心管中，待进行电泳检测。
3.2琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的提取效果
3.2.1 实验概述
琼脂糖是从海藻中提取出来的一种杂聚多糖，是由D型和L型半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键相连形成的线状高聚物。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔径范围从50 nm到大于200 nm的凝胶。
琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一，这种方法简便易行。而且琼脂糖可以灌制成各种形状、大小和孔径，在不同的装置中进行电泳，如果有必要，还能够从凝胶中回收DNA谱带。
3.2.2 实验目的
1、采用琼脂糖凝胶电泳的方法，对样品进行检测，目的主要是为了观察染色后的凝胶上有否出现清晰的条带。
2、观察结果，如果出现清晰的条带，则证明了T-gfp质粒和P质粒被成功提取出来，而且含量足够；如果条带不清晰，则说明了样品中提取的质粒含量较少，不利于后续操作。
3.2.3 实验原理
DNA带负电，如果样品中含有质粒DNA，那么，在电场作用下，DNA可以在琼脂糖凝胶板上向阳极移动。不同长度的DNA片段会表现出不同的迁移率，因而可根据DNA分子的大小来使之分离。经过EB染色后，在紫外灯照射下可以观察到琼脂糖凝胶板上有否出现清晰的条带，来判断质粒DNA的提取结果。
3.2.4 实验仪器、材料及试剂
1、仪器
电泳仪、灌胶模具及梳齿、电泳槽和紫外投射仪。
2、材料
待检测的质粒DNA样品、琼脂糖。
3、试剂及上样液
（1）TBE缓冲液（10×）
称取Tri 108 g，硼酸55 g，0.5 mol/L EDTA（pH=8.0）40 mL，用H2O定容到1000 mL，高压灭菌作为10×贮液；稀释10倍后作为工作溶液使用。
（2）上样液
0.25％溴酚蓝，质量浓度为40％的蔗糖水溶液。
（3）溴化乙啶染色液（10 mg/mL）
在20 mL H2O中溶解0.2 g溴化乙啶，混匀后于4 ℃避光保存。
3.2.5 操作步骤
1、1％琼脂糖凝胶的制备
取250 mL三角瓶，加入100 mL TBE缓冲液，称取1 g琼脂糖加入缓冲液中，用包装纸封好瓶口，然后将该三角瓶置于微波炉加热至琼脂溶解。
2、胶板的制备
将有机玻璃内槽洗净、晾干，放入制胶模具中，并在固定位置插上梳子。将冷却至65 ℃的琼脂糖凝胶液轻轻摇匀，小心地倒在内槽上，使胶液慢慢地展开直到整个玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置15 min左右，凝固完全后，轻轻拔出梳子，将铺好胶的玻璃内槽放入装有电泳缓冲液TBE的电泳槽中。
3、加样
使用微量移液枪将3 μL溴酚蓝上样液与15 μL质粒DNA样液混合均匀，然后用移液枪将总共18 μL的样品加入到胶板的样品孔内。每加完一个样品，要换一个枪头。加样时要避免将样品滴出到样品孔外。
4、电泳
加样后的凝胶板可以通电进行电泳。采用在150 V的电压下进行室温电泳。因为DNA是带负电的，通电时，我们可以观察到样品向阳极移动。电场强度不应高于5 V/cm，当溴酚蓝移至距离胶板下沿约1 cm时，停止电泳。
5、染色和观察
从电泳槽中小心地取出凝胶，并将凝胶置于EB染色剂中染色8 min左右，然后用清水冲洗凝胶。最后将凝胶置于紫外灯下观察。DNA存在处会显示出红色的荧光条带。
EB染色原理：EB能插入DNA分子的碱基对之间，完成与DNA结合，DNA所吸收的260 nm的紫外线传递给EB，或者结合的EB本身在300 nm和360 nm吸收的射线均可在可见光谱的红橙区，以590 nm波长发射出来。
注意：①EB是一种强诱变剂，取用含有这一染料的样品时必须戴手套；②紫外线对人体、眼睛有危害性，在紫外灯下观察时，应带上防护眼罩或面罩，避免受紫外线损伤。
3.2.6 结果分析
1、在紫外灯下，可以观察到样品分别含T质粒和P质粒的情况，如下图所示：
图3.3 样品中T质粒和P质粒电泳鉴定结果
我们可以从图4中看到电泳道2、4、10和18中有明显的、亮度较好的质粒DNA条带，电泳道1、16中虽然也可以看到条带，但是条带区分不清晰，可能是因为样品中还残留蛋白质，影响分析结果。如果没有看到荧光条带，则说明样品中不含有质粒DNA。
2、鉴定原理
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带。
图3.4 质粒DNA的琼脂凝胶电泳示意图
在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。同一质粒的电泳速度因DNA的构型不同而异，其次序为：cccDNA﹥直线DNA﹥ocDNA。
因此在本次实验中，我们可以看到琼脂糖凝胶电泳道上出现的是3条清晰的DNA荧光条带。
3、琼脂糖凝胶电泳的影响因素
在琼脂糖凝胶中的迁移率受多种因素影响，例如：DNA分子的大小；琼脂糖的浓度；所加电压等等。DNA片段越长，泳动速度越慢，而且泳动速度与电场强度成正比。一个给定大小的线性DNA片段，在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移率不同，DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。用低浓度的荧光染料，如溴化乙啶染色后，凝胶中的DNA可以直接被检测出来。紫外灯下可以直接检测到20 pg的双链DNA。
3.3 T-gfp质粒、P质粒的双酶切及电泳分离目的片段
3.3.1 实验目的
利用步骤1所得到的含有T质粒和P质粒的样液，分别同时加入HandⅢ和NCOⅠ两种限制酶进行双酶切，然后对酶切后的样品进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶板上分离出目的片段。
3.3.2 实验原理
能识别双链DNA分子中的某一特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构产生粘性末端或平端的酶，称为限制性核酸内切酶，主要是从原核生物中分离纯化出来的。
本次实验，我们采用了HandⅢ和NCOⅠ这两种常用的限制酶，其识别序列和切口是：
HandⅢ： NcoⅠ:
G AATT C C CATG G
C TTAA G G GTAC C
如图所示GAATTC和CCATGG核苷酸序列表示酶识别位点，线条表示酶切口。限制酶对特定环状质粒DNA有多少酶切位点，就能产生多个酶切片段，酶切后的片段可以用琼脂糖凝胶电泳来分离鉴定。
3.3.3 双酶切的作用
因为DNA片断有两个端点，所以切割时出现两种可能：一种是单酶切，另一种是双酶切，这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。
1、对于单酶切来说，载体与供体的末端都相同，连接可以在任何末端之间进行，这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底，可对载体进行5’除磷酸处理，原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端，所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时，由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。
2、对于双酶切来说，无论载体与供体同一片段上都有不同的末端，这样就避免了载体与供体的自环，能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。
3.3.4 实验器材、材料及试剂
微量移液枪、电泳仪、恒温水浴锅、紫外投射仪、HandⅢ及10×酶切缓冲液、NCOⅠ及10×酶切缓冲液、无菌水、溴酚蓝上样液、TBE电泳缓冲液、琼脂糖凝胶板、EB染色剂。
3.3.5 操作步骤
1、双酶切（酶切体系）
表3.3 酶切反应体系加样表
（1）取出两支分别装有T质粒和P质粒样品的离心管，然后微量移液枪向两支离心管中分别加入12 μL相应的两种酶切缓冲液，虽然有L、M、K型三种缓冲液选择，但是选择M型缓冲液可以使HandⅢ的酶切效率达到100％，而NCOⅠ达到80％。
（2）然后再用无菌水补足溶液体积至100 μL。
（3）用微量移液枪向两支管内分别同时加入HandⅢ和NCOⅠ两种酶液2 μL，用手指轻弹管壁使溶液混匀。
（4）将离心管置于37 ℃水浴中酶切10 h使酶切反应完全，放置于冰上对限制酶进行灭活，并待进行电泳分离。
2、琼脂糖凝胶电泳分离目的片段
（1）酶切完成后，取分别含有T、P两种质粒DNA的样液15 μL，然后分别与3 μL溴酚蓝上样液混合均匀，用微量移液枪将样品加入到凝胶样品孔内。加样后的凝胶板可以通电进行电泳。
（2）将电泳完成后的凝胶进行EB染色8 min、自来水冲洗干净，然后置于紫外灯下观察。
3.3.6 结果分析
在紫外灯下可以观察到酶切后琼脂糖凝胶板上条带的情况，如下图所示：
图3.5 质粒DNA酶切鉴定结果
从图6可以看出，样品进行双酶切后，有些电泳道上呈现出清晰的条带，有些则因为酶切效果不好而没有出现荧光条带。电泳道1、9上所呈现出的荧光条带是相对清晰的，说明其酶切效果较好，成功分离出目的片段。
3.3.7 DNA酶切过程的影响因素
1、要注意控制好酶切的时间，酶切时间达到后要立刻移至冰中，将酶切效应解除，避免破坏质粒DNA的结构。
2、盛装限制酶的离心管不能暴露在空气当中，因为环境中存在多种能破坏限制酶三维结构的物质，使其酶切活性降低，直接影响结果，所以要将盛装限制酶的离心管盖盖好。
3、与DNA的构象有关（SC、L、OC）；同时也与DNA的纯度有关（蛋白、氯仿、SDS、EDTA、甘油等）。
3.4 目的酶切DNA片段的回收
3.4.1 实验目的
DNA酶切样品经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外投射仪下确定所需回收的DNA片段（gfp基因和P质粒载体）的位置，用刀片将其切下，称重，放入两支灭菌的Eppendorf管中，以0.1 g相当于100 μL折算。
3.4.2 实验原理
经内切酶消化的DNA片段，在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率比不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，再利用“DNA快速纯化/回收试剂盒”来回收目的DNA片段。
本次实验所用的试剂盒可以从溶液或者琼脂糖凝胶中回收DNA片段，不含盐、蛋白质、RNA等杂质，纯度与CsCl密度梯度离心相仿。500 bP以上片段，回收率80％以上，200 bP～500 bP回收率达60％以上，100 bP～200 bP回收率达60％，可以回收单链、双链DNA片段及环状质粒DNA。
此方法原理：本试剂盒带有Resin质子化以后，具有在高盐、低PH值情况下吸附DNA，低盐、高PH值情况下释放DNA的性质。
3.4.3 实验仪器、材料及试剂
1、灭菌的刀片、台式高速离心机、微量移液枪。
2、DNA快速纯化/回收试剂盒，其组成如下：
3.4.4 操作步骤
1、DNA酶切样品经过1％琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外投射仪下确定所需回收的DNA片段（gfp基因和P质粒载体）的位置，用刀片将其切下，称重，放入两支灭菌的Eppendorf管中，以0.1 g相当于100 μL折算。
T-gfp质粒 P质粒
6k
4k
2k
1k
500bp
200bp
100bp
2、切取含DNA片段的琼脂糖（100 mg－300 mg），尽量切得小一点，用吸头捣碎按重量比1:3（切重量：溶液A的体积比）加入溶液A。
3、50 ℃水溶10 min，胶完全溶化即可，其间可振荡助溶2-3次，待后置室温加入15 μL溶液B，充分混匀。
4、将溶液置于离心柱中，静置2min，≥8000 rpm离心30 s，若一次加不完，可分两次离心。
5、倒掉液体，加入500 μL溶液C于离心柱中8000rpm离心30 s，弃液体。重复步骤4。
6、12000rpm再次离心1 min，甩干剩余液体以除去残余酒精。
7、将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5-10 min，使乙醇挥发殆尽。加入20-30 μL溶液D（50 ℃水浴），静置2 min。
8、12000 rpm离心2 min，管底溶液即为所需DNA，将DNA贮存于-20 ℃可长期保存。
3.4.5 影响回收率和回收质量的因素
1、影响回收率和回收质量的最主要因素是PH值和切胶薄厚。溶液A为橙黄色，有利于观察琼脂糖凝胶是否完全溶解，也是PH指示剂。当回收时样液总体积大于500 μL可适量多加溶液B，切胶越薄越好。
2、水浴温度范围为50～65 ℃，溶液D的用量视实验对DNA浓度要求而定。
3、回收质量可用OD 260/280比值来判断，本次实验所采用的试剂盒所得DNA比值大于1.4，比值偏低主要是一些无级离子的存在吗不影响其他分子生物学操作。
3.5 质粒DNA连接（重组DNA分子的构建）
3.5.1 实验概述
DNA重组，就是把外源目的基因“装进”载体的这一过程，即DNA的重新组合。这种重新组合的DNA分子是由两种不同来源的DNA组合而成，所以称作重组体或嵌合DNA。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2 、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。
3.5.2 实验目的
在T4噬菌体DNA连接酶作用下，被HandⅢ和NCOⅠ双酶切所形成的粘性末端DNA分子可以连接上，形成可能含有目的基因gfp的重组质粒DNA分子。
3.5.3 实验原理
DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。
T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3步：①T4 DNA连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物；②酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；③产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。
3.5.4 实验仪器、材料及试剂
1、仪器
微量移液枪、恒温水浴锅、电泳仪
2、材料及试剂
已经回收的gfp基因片断和P质粒DNA片断溶解液、T4噬菌体DNA连接酶及缓冲液（10×）。
表3.4 连接反应加样表
3.5.5 操作步骤
1、互补粘性末端连接：将回收后的两种DNA片段溶解液混合于一管中，其中gfp基因片段溶解液为30 μL，P质粒DNA溶解液为10 μL（按照载体DNA与外源DNA的摩尔数比约为1:3来加入）。
2、往混合液中加入5 μL T4 DNA连接酶缓冲液和12 μL T4 DNA连接酶，小心混匀，于14 ℃水浴中保温14～16 h。
3、电泳检测：取2 μL连接后的样液作电泳检测，鉴定连接反应的产物。若连接产物符合预期结果，则可以迅速作转化实验。
3.5.6 连接反应改进措施
连接反应的温度在37 ℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度，即12-16 ℃，连接12-16 h（过夜），这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.6.1 实验概述
连接反应中形成的重组子及其它质粒分子的混合群体必须通过转入宿主细胞将它们相互分离，进而进行自主复制。
但是，在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
人们发现，用含Ca2+的溶液处理的大肠杆菌细胞将会易于吸收外源DNA，这一过程称为转化。
3.6.2 实验原理
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2，KCl)等化学试剂法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源DNA分子的受体细胞。
本次实验所采用的制备感受态细胞的方法是氯化钙法，CaCl2法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70 ℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
3.6.3 实验目的
通过采用氯化钙法，使大肠杆菌DH5?的细胞的通透性发生改变，从而制备出能容许含有外源DNA gfp荧光蛋白基因的质粒载体通过的感受态细胞。
3.6.4 实验仪器、材料及试剂
1、仪器
恒温摇床、电热恒温水浴、分光光度计、超净工作台、微量移液枪、高速冷冻离心机、无菌微量离心管、10 mL离心管、常用玻璃器具。
2、材料及试剂
E.coli DH5?作为受体细胞、LB培养液、0.1 mol/L CaCl2（含20％甘油）、冰块、无菌水。
3.6.5 操作步骤（氯化钙法）
1、将单个菌落接种于含LB培养液的试管中，37 ℃振荡（250 转/min）培养过夜。
2、向装有100 mL LB培养液的500 mL三角瓶中各加入1 μL（接种量为1％）过夜培养细胞，37 ℃振荡培养至光密度（OD600）值为0.4～0.6（需2 h）。
3、将装有培养液的三角瓶一并移至超净工作台，然后用移液枪将培养物分别移入10 mL的离心管中，并置于冰上保持20 min。于4 ℃离心3 min，弃去上清液。
4、使用移液枪再往离心管中加入培养液，于4 ℃离心3 min，弃去上清液，这时，我们可以观察到离心管底部积聚着菌体。
5、往离心管中加入无菌水并再离心6 min，弃去上清液（用于去除溶液中残留的盐）。
6、向离心管中加入10 mL CaCl2溶液，小心混合均匀，并于4 ℃离心3 min，弃去上清液。
7、再往离心管中加入冰冻的含有20％甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液，并使沉淀悬浮于溶液中，再于4 ℃离心3 min，小心地将官底沉淀刮离管壁，并使之混匀。
甘油的作用：保护细胞免受冰晶形成的伤害。
8、将所得溶液分装于20个微量离心管中，100 μL/个，并置于4 ℃冰箱中贮存备用。
3.6.6 提高细胞感受态效率的方法
1、培养基的装量：培养基的装量关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长。厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。建议装量不要高于此值为：培养基体积/三角瓶容量=100 mL/500 mL，50 mL/250 mL。
2、培养基的pH值：这里讲的pH值还包括整个摇瓶结束后的pH值。一般来说，接种前的pH值在6.8-7.2，等菌株振荡培养好后，pH值不要低于6.0，最好在6.5以上。这表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好，有利于保持感受态效率。
3、培养基中的各种离子：经实验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。在制备普通感受时，使用MgCl2作为培养基的添加物，在感受态收获之前20-30分钟加入，会收到很好的效果。
4、在保存感受态时，DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
5、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。
3.7 重组质粒DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞（转化）
3.7.1 实验目的
将连接后、带有gfp基因的P质粒载体分子导入到大肠杆菌感受态细胞中，从而制备出转化子。
3.7.2 实验原理
转化，是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
在一定条件下，将带有外源DNA载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞表现出新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以筛选出转化体，即带有外援DNA分子的受体细胞。
3.7.3 实验仪器、材料及试剂
1、仪器
恒温水浴锅、恒温摇床、微量移液枪。
2、材料及试剂
连接后的产物、待用的大肠杆菌感受态细胞、冰块。
3.7.4 操作步骤
1、用移液枪将连接后的产物（即重组DNA分子）100 μL分装于4支干净离心管中，25 μL/支。
2、从冰箱中取出制备好的大肠杆菌感受态细胞，并放在冰上待其溶化后，取100 μL加入每支离心管中，混匀并在冰上静置20 min。
3、将离心管放入42 ℃水浴中2 min对细胞进行热处理。
目的：热处理会诱导涉及DNA修复的酶以及其他细胞成分的生成，这样可以导致细胞从转化过程的不正常状态恢复过来，提高了转化效率。
4、向上述试管中，加入1 mL预热（37 ℃）的LB培养液，于37 ℃下，振荡培养(250 转/min)1 h。
3.7.5 提高转化率要考虑的因素
1、细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于4 ℃的培养菌，最好从－70 ℃或-20 ℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD 600来控制。
DH5α菌株的OD 600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右(不同的菌株情况有所不同)，这时比较合适，密度过高或不足均会影响转化效率。
2、质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。
3、试剂的质量: 所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的(GR.或AR.)，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。
4、防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管、tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。
3.8 重组质粒DNA分子的平板筛选
3.8.1 实验目的
将转化后的大肠杆菌培养液接种于含有氨苄青霉素（Amp）的LB培养基中，培养后观察培养基上菌落的生长情况，从而判断受体细胞有无成功转入含有目的基因gfp的重组质粒分子。
3.8.2 实验原理
由于本实验所采用的T、P两种质粒上都携带有抗生素（氨苄青霉素）抗性基因Ampr，我们可以通过Amp抗性来筛选转化子。若将转化的细胞涂布于含有氨苄青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒（即带有Ampr的转化子）的大肠杆菌细胞才能够在平板上生长繁殖。
如果受体细胞没有转入P质粒，那么则不能在含有Amp的培养基上生长。而能够在含有Amp的培养基上生长的受体细胞（转化子）就可以确定是已经成功导入了P质粒。
3.8.3 实验原理
1、仪器
超净工作台、微量移液枪、37 ℃恒温培养箱、常用玻璃仪器。
2、材料及试剂
转化培养液、LB培养液、氨苄青霉素。
3.8.4 操作步骤
1、制备含有氨苄青霉素Amp的LB固体培养基
（1）在超净工作台中，用微量移液枪将Amp加入到装有LB培养液的三角瓶中（每1 mL培养液加入1 μL的Amp），并轻摇混匀。
（2）将培养液倒入培养皿中，以制备LB平板（10 个）。
2、接种
（1）取10 μL转化培养液平铺于各个含有Amp的LB培养基上，平板静置10 min待培养液被吸收。
（2）将平板倒置并置于37 ℃恒温培养箱中培养12～16 h，观察菌落的生长状况。
3.8.5 结果分析
我们可以观察到10 个含有Amp的LB平板中，每个平板上都均匀地生长着零星的大肠杆菌菌落，菌落带有淡绿色。这说明转化反应中，成功导入含有Ampr的P质粒的受体细胞能够在抗氨苄的LB培养基上生长，这些受体细胞正是我们要获取的转化子。
但是，由于琼脂平板中缺乏诱导底物IPTG，所以重组子所含有的gfp绿色荧光蛋白基因不能大量表达，所以我们在自然条件下所看到的菌落只是带有轻微的淡绿色。
3.9 IPTG存在时，gfp荧光蛋白在大肠杆菌种的诱导表达
3.9.1 实验目的
用?互补现象进行重组DNA的鉴定，即将经过氨苄青霉素抗性平板筛选的菌落接种到加入了诱导底物IPTG的含有Amp的平板上，且同时作一组对照（即接种到不含有IPTG的Amp平板上），观察菌落的生长情况，包括菌落大小、菌落密度、菌落颜色等特征。
3.9.2 实验原理
基因表达是指基因转录成mRNA后再翻译成蛋白质的过程，生物在生长发育过程中，遗传信息的展现可以按照一定的时间程序发生改变，而且随着内外环境条件的变化而加以调整，这就是时序调节和适应调节。
乳糖操纵子就是适应调节的一种，所谓操纵子即基因表达的协调单位，它们有共同的控制区和调节系统，操纵子由功能上彼此相关的结构基因、操纵基因和调节基因所组成。
乳糖操纵子及其诱导表达的模型如下：
启动子 调节基因 终止子 启动子 操纵基因 结构基因
mRNA
图3.6 乳糖操纵子诱导表达模型-1
当没有诱导物（乳糖或IPTG）存在时，调节基因lacI转录的mRNA翻译产生的阻遏蛋白与操纵基因lacO结合，阻止了结合在旁边启动子上的RNA聚合酶向前移动，使结构基因（?-半乳糖糖苷酶基因被插入gfp荧光蛋白基因）不能转录mRNA，也就不能
3.9.5 操作示意图
150 μL菌液
取100 μL菌液
150 μL菌液
图3.8 gfp绿色荧光蛋白诱导表达操作示意图
4 实验结果分析
4.1 结果观察
4.1.1 只含有Amp的LB平板
在自然光照条件下，看到不同菌液浓度的琼脂平板上长有密度、大小不同的淡绿色菌落，原浓度（即没有稀释）的琼脂平板上长有的菌落较多，而且菌落要较大；而接种了稀释10倍、20倍的琼脂平板上生长的菌落也较细小、密度稀疏。
4.1.2 含有Amp和IPTG的LB平板
在自然光照条件下，平板上菌落的颜色（指绿色）要明显于只含有Amp琼脂平板上生长的菌落，容易辨认。同时，不同菌液浓度的LB平板上生长的菌落的数量、大小也存在差异。菌液浓度最高的LB平板上的菌落也最为密集，随着接种菌液的浓度降低，平板上生长的菌落也会减少（稀疏）。
4.1.3 紫外透射仪观察
由于大肠杆菌受体细胞已经被成功导入了gfp荧光蛋白基因，所以，在紫外线照射下，我们可以清晰地看到菌落是呈现荧光绿色的，效果较在自然光照条件下明显。
荧光程度强弱的比较：我们可以观察到，生长在同时含有Amp和IPTG的琼脂平板上的菌落的荧光程度较强，
如下，左图为只含有Amp的LB平板，右图为含有Amp和IPTG的LB平板：
图4.1 Amp平板 图4.2 Amp+ IPTG平板
4.1.4 在显微镜下观察Amp + IPTG平板
用接种环取一环生长在含有Amp和IPTG的琼脂平板上的大肠杆菌菌落，至于载玻片上制备成观察样品，用显微镜观察菌落的形态结构，如下图所示：
① ②
图4.3 显微镜下观察含有gfp基因的大肠杆菌
显微镜下，大肠杆菌呈杆状形态，菌落生长状态良好，颜色为荧光绿色，证明了gfp基因已经成功导入到大肠杆菌细胞内。
4.2 结果分析
在本次实验中，我们目的是将外源基因-gfp绿色荧光蛋白基因导入到大肠杆菌受体细胞中让其正常地表达，所生长的菌落呈现淡绿色或浅绿色，即在大肠杆菌中表达的蛋白有很强的荧光。
我们可以观察到每一个接种的琼脂平板上都长有绿色的大肠杆菌菌落，说明了gfp基因已经成功转入到受体细胞中并正常表达，只是基因表达的强度与有否加入诱导物IPTG有直接关系。
由于我们的目的gfp蛋白基因适合表达载体PT32进行质粒重组，目的蛋白基因的表达强弱与载体PT32上的启动子和翻译起始序列等有关，PT32载体上还含有乳糖操纵子调控序列，在诱导物IPTG（异丙硫代D-半乳糖苷）的诱导下，外源基因表达可增强105倍，诱导表达时也会受温度和诱导物浓度的影响。
5 讨论
5.1 碱裂解法
碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的差异而达到分离的目的。它是一种常用的、简便快速的质粒DNA提取方法。
可是，碱裂解法也存在以下一些缺点降低了质粒DNA的提取效率。
5.1.1 容易导致不可逆的变性
碱裂解法是很剧烈的方法，质粒在碱性条件下会变性，时间一长，这种变性就成为不可逆的了。所以，要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
在碱性条件下，质粒的两条链从一点或者几个点开始分开，随着时间的延长，直到完全分开。理论上讲，完全分开的两条链要很快地配对复性，成功率肯定不可能是100%的，而没有完全分开的两条链却完全可能100%配对复性。
5.1.2 不适合于大质粒的抽提
不适合于大质粒的抽提。原因也是因为该方法太剧烈了，使得超螺旋DNA比例较低。大质粒的拷贝数本来就低，如果抽提方法得率在不提高，抽提起来就会很费力，我们在抽提大质粒时应该使用温和的抽提方法。
5.2 碱裂解法提取质粒过程中的注意事项
在实验过程中，我们会发现能否从培养细菌中成功提取合适量的质粒DNA是基因克隆过程中的一个重要关键，如果提取质粒不成功或提取质粒的含量太少，都是不利于后续实验操作的进行。所以，我们在利用“碱裂解法”进行提取质粒时，要注意以下事项：
5.2.1 摇菌时间
过夜培养适合用于大部分情况，可以使菌体生长繁殖能力增强，提高稳定性。
5.2.2 菌体的彻底悬浮
在进行质粒提取时，如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块则在溶液Ⅱ加入后，变成一个外围几乎彻底裂解而往里不完全裂解的团块，这个团块在溶液Ⅲ的加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源
5.2.3 使用相对过量的试剂
试剂相对过量的好处是：稳定性好，纯度高，操作更简单。如果认为这样不经济，就少用一点菌体。
5.2.4 裂解时间
加入溶液II后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液III中和。
5.2.5 中和的操作
在离心管中加入溶液III后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀，效果非常好。
5.2.6 中和后离心去除杂蛋白
一定要将蛋白质彻底离心下去。如果发现离心后仍然有蛋白质漂浮在液面，继续离心的效果并不好；而将上清倒入另外一个离心管中，再离心，效果要好许多。
5.3 导致gfp基因不正常表达的影响因素
5.3.1 菌体过量
起始菌体过量时导致抽提失败的最主要因素，菌体过量将导致菌体内的RNA与质粒DNA竞争吸附，使得率降低。另一方面，菌体过量容易使溶液非常粘稠，为混匀溶液所需要的外力很容易破坏质粒DNA的超螺旋结构。所以，如果从1.5 mL菌液中抽提出来的质粒足够实验所需，就不适用3.0 mL的起始菌液。
5.3.2 RNase被污染
在使用移液枪头过程中，枪头的污染会使得RNase被降解，从而不能在规定时间内降解所有的RNA。
5.3.3 菌体缺乏营养
菌体缺乏营养：如果所配制的LB培养液营养元素含量不足或者培养时间不足够，容易导致菌体乃稳定性降低，繁殖力降低，质粒含量减少。我们可以在培养液中加入微量抗生素（氯霉素）刺激菌体细胞生长。
5.3.4 选择压力
由于本次实验所采用的大肠杆菌质粒中含有抗性基因Ampr，所以在LB培养液中加入Amp，有利于使大肠杆菌繁殖过程中的选择压力增大，刺激其生长，同时可以防止杂菌污染。
5.3.5 DNA变性
在碱法裂解质粒DNA过程中，加入SDS（破裂细胞）后，如果时间过长还不加入溶液Ⅲ，染色体DNA片段会慢慢断裂，同时要注意操作时动作要温和避免振荡激烈使DNA片段断裂。
5.3.6 掺入杂蛋白
在加入溶液Ⅲ后，离心管底部会出现白色沉淀，在吸取上清液的时候，要注意溶液表面漂浮着一层白色的膜（杂蛋白），若不加留意，用移液枪吸取清夜的时候就会把膜层也一并吸入，从而掺入了杂蛋白。
5.3.7 限制性内切酶失活
限制性内切酶失活：在碱法提取质粒过程中，所残留的SDS、乙醇都是有机溶剂，容易使内切酶失活，可能导致目的基因gfp和P载体DNA的片段没有酶切成功，使回收片段的得率降低。
5.4 提高得率的方法
5.4.1 降低RNA残留
RNA的去除，首先是使用RNase消化。在溶液I中加入高浓度的RNase A (100 ug/ml)，或者用含25 ug RNase A/ml TE 溶解抽提好的质粒，都可以降低RNA残留，但都不能彻底去除。如果想彻底去除RNA残留，可以用试剂盒，或者使用对4个碱基都起作用的RNase。
5.4.2 降低gDNA残留
gDNA的残留问题，必须在抽提过程中解决，否则，就只能用胶回收方法处理了。gDNA越大，越难于复性，也就越容易被去除；所以，一定要尽可能不打断gDNA。裂解体系越粘稠，gDNA越容易被扯断；操作手法越重，gDNA也越容易被打断。温和操作，使用相对过剩的试剂，是降低gDNA残留的最好方法。
5.4.3 降低蛋白质残留
蛋白质的去除，主要是靠不溶解的K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于4 ℃一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。
只要加入溶液I后的悬浮，加入溶液II后的裂解及加入溶液III后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。
5.4.4 降低质粒Nick
细菌收获时间、菌株的选择及抽提操作的剧烈程度是影响Nick的三个主要因素。细菌收获过早，质粒还在复制过程中，Nick的比例较高；过晚，细菌开始死亡，杂质会比较多。如果使用胞内酶含量很高的宿主菌，会出现较高比例的Nick。加入溶液II及加入溶液III的混匀操作，也可以导致一些Nick的产生，但影响不会比前两者大。
5.4.5 降低变性超螺旋
在用碱裂解法提取质粒过程中，变形超螺旋的出现是不可避免的，而它的含量往往又是很少的，在电泳观察时不一定被察觉到（变性超螺旋电泳比正常超螺旋跑胶跑得快）。抽提质粒时使用相对过剩的溶液，在加入溶液II后，体系能在1分钟内变澄清，再快速加入溶液III，这样基本上能将变性超螺旋的出现控制在电泳看不见的水平。
5.4.6 加入抗生素
利用氨苄青霉素（Amp）抑制染色体的复制，而不抑制质粒的复制这一特点，在地拷贝质粒的培养过程中添加Amp可以大大提高得率。
5.4.7 延长反应时间
可以适当延长酶切时间或增加酶量的方式提高酶切效率，但内切酶用量不能超过总反应体积的10 ％，否则，酶活性将因为甘油过量受到影响。
5.4.8 提高DNA回收浓度
琼脂糖凝胶电泳分离酶切DNA片段时，电泳缓冲液用TAE，而不能用TBE，因为TBE中的硼酸溶液与琼脂糖的反式糖单体或多聚体形成复合物，这种复合物使胶难以溶解，将对连接反应有抑制作用。在胶上回收DNA时，要尽量减少洗脱体积，以便提高回收DNA的浓度。
5.4.9 防止污染
酶切与连接反应的整个过程中应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶的活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。
6 GFP在分子生物学上的应用
6.1 蛋白融合
6.1.1 GFP具有荧光特性
GFP最常使用的是在基因转录时或者是作为含目的蛋白的报告基因。在多数情况下，GFP基因在N或C末端与异源基因接合构成编码融合蛋白的嵌合基因，其表达产物既保持了外源蛋白的生物活性，又表现出与天然GFP相似的荧光特性。
6.1.2 荧光标记
GFP的这种特性为蛋白质提供了一种荧光标记，不仅可用来在活体内追踪某一特定蛋白的合成、运输和定位，还包括对细胞器的动态观察、有丝分裂的研究、细胞骨架的成分分析和细胞分泌过程等，甚至也可以对某些DNA序列在活细胞的动态变化进行研究分析。
GFP融合蛋白的应用得到了比传统抗体标记技术更高的灵敏度，并简化了细胞固定、渗透压调整、抗体培养等操作步骤。多数情况下可用荧光显微镜、FACS或荧光计直接进行活体观察。
6.2 细胞筛选
基于GFP能够吸收／发射光。并且荧光稳定以及检测方法快速、方便的特性，GFP在细胞筛选上应用广泛。
例如，应用流式细胞计数仪来筛选蛋白产量增强的细胞。Yuk等使用GFP作为标记能快速筛选出在生长抑制环境下，仍能保持重组蛋白大量表达的CHO细胞。
另外，研究发现通过GFP荧光的减少，可以测量出鼠和人细胞的凋亡。利用GFP融合蛋白作为细胞表面活体荧光标记。通过筛选已经获得GFP表达的E.coli、人体肾细胞和猿猴COS-1细胞等特殊类型。
6.3 定位标记
GFP的分子量很小。而且其发色基因性质稳定，在与其他蛋白质连接后仍能发射荧光，同时不影响它所连接的蛋白质的结构和功能。利用这一性质我们可以将GFP与细胞中某些特定的蛋白质结合，然后激发这些GFP，通过检测GFP的荧光来测定这些蛋白质的位置。
利用这一技术，可以测定某些细胞的分布和生长状况，尤其是一些透明的动物和植物组织内特定细胞、化合物的生长、分布情况。
也有人用此项技术进行病毒在植物体内的生长、扩散情况的研究，取得了不错的效果。如果我们有一系列具有不同吸收光谱和发射光谱的荧光蛋白，那么多种不同细胞和分子间的距离、相互作用情况将会形象生动地展现在我们面前。
6.4 基因表达调控
Clontech公司构建了一种叫启动子报告载体(Promoter reporter vector)即是一个没有启动子的GFP质粒，专门用来测试各种启动子对GFP表达的效率，以及某些增强子对GFP表达的调控效果。发现用玉米C4PPDK基因5’端的非翻译片段(5’VTR)与花椰菜花叶病毒的35S启动子连接，GFP在玉米原生质体中的表达效率比对照质粒(只有35S启动子)提高近15倍，因为5’VTR片段中含转录增强子。
在高等植物遗传转化的基因表达调控研究中。已有很多报告蛋白被应用，包括LacZ（β半乳糖苷酶），CAT（Chloramphenicol acethytransferase），Luc(荧光虫Luciferase)和Gus(β-glucuronidase)等。但这些报告蛋白都是酶，其表达产物的检测都需要进行细胞固定、组织切片或蛋白提取等破坏性处理，很难用于活体观察和检测。GFP作为一种活体报告蛋白，用于研究基因表达的调控，明显具有其它报告蛋白不可替代的优点。
6.5 计算细胞生长速度
在高水平组合型表达GFP的细胞品系中，在细胞生长的对数期，绿色荧光蛋白所发出的荧光信号与细胞的数量密切相关。测量到的任何荧光强度都可以相应地转变成细胞浓度。
尽管在细胞生长的后期，用荧光信号计算得到的细胞数目略低于培养物中的实际数目。但在常用的台盼蓝计数方法中，这个误差。
目 录
1 实验概述. 1
1.1 实验目的... 1
1.2 实验原理... 1
2 实验流程. 2
2.1 实验安排表... 2
2.2 实验流程图... 2
3 实验操作方法. 4
3.1 质粒DNA的提取... 4
3.1.1 实验概述... 4
3.1.2 实验目的... 5
3.1.3 实验原理... 5
3.1.4 实验仪器、材料及试剂... 6
3.1.5 操作步骤... 7
3.1.6 实验结果... 9
3.2琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA的提取效果... 9
3.2.1 实验概述... 9
3.2.2 实验目的... 9
3.2.3 实验原理... 9
3.2.4 实验仪器、材料及试剂... 10
3.2.5 操作步骤... 10
3.2.6 结果分析... 11
3.3 T-gfp质粒、P质粒的双酶切及电泳分离目的片段... 12
3.3.1 实验目的... 12
3.3.2 实验原理... 12
3.3.3 双酶切的作用... 13
3.3.4 实验器材、材料及试剂... 13
3.3.5 操作步骤... 13
3.3.6 结果分析... 14
3.3.7 DNA酶切过程的影响因素... 15
3.4 目的酶切DNA片段的回收... 15
3.4.1 实验目的... 15
3.4.2 实验原理... 15
3.4.3 实验仪器、材料及试剂... 16
3.4.4 操作步骤... 16
3.4.5 影响回收率和回收质量的因素... 17
3.5 质粒DNA连接（重组DNA分子的构建）... 17
3.5.1 实验概述... 17
3.5.2 实验目的... 17
3.5.3 实验原理... 18
3.5.4 实验仪器、材料及试剂... 18
3.5.5 操作步骤... 18
3.5.6 连接反应改进措施... 19
3.6 大肠杆菌感受态细胞的制备... 19
3.6.1 实验概述... 19
3.6.2 实验原理... 19
3.6.3 实验目的... 20
3.6.4 实验仪器、材料及试剂... 20
3.6.5 操作步骤（氯化钙法）... 20
3.6.6 提高细胞感受态效率的方法... 21
3.7 重组质粒DNA分子导入大肠杆菌感受态细胞（转化）... 21
3.7.1 实验目的... 21
3.7.2 实验原理... 21
3.7.3 实验仪器、材料及试剂... 22
3.7.4 操作步骤... 22
3.7.5 提高转化率要考虑的因素... 22
3.8 重组质粒DNA分子的平板筛选... 23
3.8.1 实验目的... 23
3.8.2 实验原理... 23
3.8.3 实验原理... 23
3.8.4 操作步骤... 23
3.8.5 结果分析... 24
3.9 IPTG存在时，gfp荧光蛋白在大肠杆菌种的诱导表达... 24
3.9.1 实验目的... 24
3.9.2 实验原理... 24
3.9.5 操作示意图... 25
4 实验结果分析. 26
4.1 结果观察... 26
4.1.1 只含有Amp的LB平板... 26
4.1.2 含有Amp和IPTG的LB平板... 26
4.1.3 紫外透射仪观察... 26
4.1.4 在显微镜下观察Amp + IPTG平板... 27
4.2 结果分析... 27
5 讨论. 28
5.1 碱裂解法... 28
5.1.1 容易导致不可逆的变性... 28
5.1.2 不适合于大质粒的抽提... 28
5.2 碱裂解法提取质粒过程中的注意事项... 28
5.2.1 摇菌时间... 28
5.2.2 菌体的彻底悬浮... 29
5.2.4 裂解时间... 29
5.2.5 中和的操作... 29
5.2.6 中和后离心去除杂蛋白... 29
5.3 导致gfp基因不正常表达的影响因素... 29
5.3.1 菌体过量... 29
5.3.2 RNase被污染... 30
5.3.3 菌体缺乏营养... 30
5.3.4 选择压力... 30
5.3.5 DNA变性... 30
5.3.6 掺入杂蛋白... 30
5.3.7 限制性内切酶失活... 30
5.4 提高得率的方法... 31
5.4.1 降低RNA残留... 31
5.4.2 降低gDNA残留... 31
5.4.3 降低蛋白质残留... 31
5.4.4 降低质粒Nick. 31
5.4.5 降低变性超螺旋... 32
5.4.6 加入抗生素... 32
5.4.7 延长反应时间... 32
5.4.8 提高DNA回收浓度... 32
5.4.9 防止污染... 32
6 GFP在分子生物学上的应用. 33
6.1 蛋白融合... 33
6.1.1 GFP具有荧光特性... 33
6.1.2 荧光标记... 33
6.2 细胞筛选... 33
6.3 定位标记... 34
6.4 基因表达调控... 34
6.5 计算细胞生长速度... 34