20##分子生物学
基础实验报告
实验一 质粒DNA的小量制备
实验二 DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定
实验三 感受态细胞的制备及转化
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指导教师：
实验一 质粒DNA的小量制备
一、实验原理
要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。
所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤:培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（SDS）可使细胞壁解，经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在清液中。用乙醇沉淀、洗涤，可得到质粒DNA。
质粒DNA的相对分子量一般在106－107范围内，如质粒pBR322的相对分子质量为2.8×106，质粒pUC19的相对分子质量为1.7×106。在细胞内，共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，简称cccDNA）常以超螺旋形式存在。如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，这种松弛型的分子叫做开环DNA（open circular DNA，简称ocDNA）。在电泳时，同一质粒如以cccDNA形式存在，它比其开环和线状DNA的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒DNA在电泳凝胶中呈现3条区带。
二、实验目的
1．掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法。
2．了解制备原理及各种试剂的作用。
三、实验材料和试剂
材料：大肠杆菌E.coli，分别含pET28a质粒和pEGFP-N3质粒，携带卡那霉素抗性基因。
试剂：
1. LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，用NaOH调pH至7.3左右。如固体培养基则添加15g/L琼脂。
2. 溶液Ⅰ（pH8.0G.E.T缓冲液）。
3. 溶液Ⅱ（0.2mol/LNaOH(内含1％SDS)）。
4. 溶液Ⅲ（pH4.8乙酸钾溶液）。
5. 酚/氯仿液(V/v＝1/1)。
6. 无水乙醇
7. 70％乙醇
8. pH8.0 TE缓冲液。
仪器：
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、台式高速离心机、台式小型振荡器、EP管(1.5mL微量离心管)、加样器(20uL～lmL)、吸头。
四、操作步骤
1．取1.4mL菌液置于1.5mL Ep管中，10000rpm离心3min。
2．弃上清，加入150μL GET缓冲液，在涡旋混合器上充分混匀，在室温下放置10min。
3．加入200μL新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖，颠倒（不要振荡）2～3次，使之混匀，冰上放置4min，最多不能超过5min。
4．加入150μL冰冷的乙酸钾溶液。加盖后，颠倒数次使之混匀，冰上放置15min。
5．4℃，10000rpm离心5min，上清液吸至另一干净的1.5mL Ep中，如上清液浑浊则需重新离心一次。
6．于上清液中加等体积酚/氯仿液，振荡混匀，4℃，12000rpm离心2min，小心吸取上清液，转移至另一1.5mL Ep管中，注意勿将两液相中间的白色蛋白薄层吸出。
7．向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，室温放置３min。用离心机于12000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
8．用0.5mL 70％乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm离心3min，除尽乙醇，室温自然干燥(将离心管倒置于一张纸巾上)，备用。
9．用30uL含无DNA酶的胰RNase(20 ug／mL)的TE重新溶解DNA，置于4℃保存。
五、注意事项（以下注意事项的原理及详细说明将在“思考题”中阐述）
1．收集菌体提质粒前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮，所以加GET后要充分混匀。
2．在添加溶液Ⅱ与溶液Ⅲ后溶液的混合一定要柔和，采用上下颠倒的方法，千万不能在旋转器上剧烈振荡。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变成澄清，并有黏性；加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。
3．苯酚具有腐蚀性，能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意。如不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。
4．苯酚可以用于抽提纯化DNA，由于苯酚的氧化产物可以使核酸链发生断裂。所使用的苯酚在使用前必须经过重蒸，且都必须用0.1mol/LTris-HCl (pH7.6)进行平衡。所以取酚/氯仿/异戊醇时应取下层溶液（关键步骤），因为上层是Tris-HCl液隔绝空气层。
5．酚/氯仿/异戊醇抽提时，应充分混匀。经酚/氯仿/异戊醇抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入（宁可留多一点），其中含有蛋白质等杂质。
6．实验中，涉及酚/氯仿溶液的操作要格外小心，而且与之接触的吸头、Ep管，全部弃用，不回收。
六、思考题
1．裂解细菌时需注意的事项有哪些？
答： 操作第三步之后应注意不可剧烈震荡，以免细菌DNA断裂混进质粒中，导致提取质粒DNA不纯；严格注意在冰上操作，防止DNA变性；打开或者关上离心管盖注意拇指不要碰到管口，防止染菌。
2．质粒的基本性质有哪些？
答：质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿，例如对药物和重金属离子的抗性。在基因工程中用作将目的基因导入受体细胞的载体。
3．碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用是什么？
答：溶液Ⅰ 低浓度的葡萄糖溶液增稠，使细胞处于低渗状态而膨胀，悬浮后不会快速沉积到管子的底部， 同时减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏DNA；
EDTA 抑制DNA酶的活性。
溶液Ⅱ 0.2M NaOH / 1% SDS，去污剂，除掉膜脂。
溶液Ⅲ 由KAc与HAc组成，是ph值为5.5的高盐溶液，能中和溶液Ⅱ的碱性，使DNA复性。K 离子会与SDS 形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而除去；
同时溶液中的DNA 也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子的质粒DNA分离。
4．抽提质粒DNA的方法包括哪几个步骤？
答：破碎细胞，得到内容物；沉淀蛋白质和染色体DNA；质粒的沉淀及收集。
5．如何提高质粒DNA的产量？
答：首先是操作者的问题；其次如果细菌的生长状况十分好也可以提高质粒的产量；另外细菌在正常情况下是无需表达质粒基因的，所以在含有抗生素的培养基中培养将诱导细菌大量复制此质粒。
6．为什么质粒DNA不能反复在4℃、-20℃、室温中放置？为达到这一目的，需要注意些什么？
答：将质粒DNA反复在4℃、-20℃、室温中放置会导致环状的DNA断裂成线性的分子，不能得到环状的DNA分子，也就是质粒的产量会下降。为了避免这一问题，对于提取的DNA因根据使用的时间不同而作相应地处理：对于近段时间就要用的质粒DNA应置于4℃冰箱中放置；而对于长时间不用的质粒DNA，则应保存在-20℃的冰箱中，因为在相对低的温度下质粒可以保存较长的时间。
实验二 DNA的含量、纯度与分子量的电泳法测定
一、 实验原理
琼脂糖凝胶电泳法
根据DNA分子量不同，采用外加电场使其分开，用EB嵌入DNA分子后在紫外下显荧光。而荧光强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品表2－1作为电泳对照，就可以估计出待测样品的浓度。电泳后的琼脂凝胶糖直接在紫外灯下拍照，只需要5－10ngDNA，就可以从照片上比较鉴别。
由于电泳时所用的样品量非常少，只要将浓度控制在几十纳克即可，所以在基因工程中经常被用做检测DNA样品。
表2－1 λDNA/ Hind Ⅲ中DNA片断
二、实验目的
1．从以上实验中提取到的质粒DNA，为了能作下一步的酶切，连接及转化实验，必须测定DNA的纯度、含量以及分子量大小。
2．本实验旨在学习水平式琼脂糖凝胶电泳，学习检测DNA、含量与相对分子质量大小。
三、实验材料和试剂
材料：自制的质粒DNA、Hind Ⅲ、。
试剂：
1．标准DNA marker(Hind Ⅲ)
2．限制性内切酶HindⅢ和10X缓冲液
3．酶反应中止液：0.2 5％溴酚蓝(含40％蔗糖)，已配好。
4．溴化乙锭染液（EB）：使用前稀释1000倍，母液已配好。注意：EB是一种诱变剂，配制和使用时应戴好手套，并且不能将该染液洒在桌面或地面上！使用后立即用大量的水冲洗干净。
5．0.5×TBE缓冲液
6．0.7％琼脂糖
仪器：
37℃水浴锅、微波炉、稳压电泳仪、凝胶成像系统、电泳槽、Eppendorf架、恒温摇床、台式小型振荡器、Ep管(1.5mL)、加样器(20uL～lmL)、吸头。
四、实验操作
（一）质粒DNA的酶解
1．新提的质粒，在10uL的体系中用单一酶（如EcoRⅠ）进行处理，即：
质粒DNA 4μL 对照 质粒DNA 4μL
10×缓冲液 1μL 10×缓冲液 1μL
EcoRⅠ 1μL EcoRⅠ 0μL
ddH2O 4μL ddH2O 5μL
2．37℃，保温4h。
3．加入1/10体积的酶反应终止液，混匀以停止酶解反应。各酶解样品于冰箱中贮存备用。
（二）琼脂糖凝胶板的制备
1．琼脂糖凝胶的制备
称取0.28g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入40mL 0.5×TBE缓冲液，于微波炉中加热，注意：防止溢出，由于琼脂糖较难溶解，如果水分损失较大，则补充一定量的蒸馏水，使其终浓度为1％。
2．胶板的制备
将有机玻璃内槽洗净、晾干。取胶带纸将有机玻璃内槽的两端边缘封好，形成一个边脚模子。注意：将橡皮膏紧贴在有机玻璃内槽两端边上，不能留空隙。将有机玻璃内槽置于水平位置，放好样品槽模板(一般称之为梳子)，将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶，小心地倒在内槽上，控制灌胶速度，使胶液缓慢地展开，直到整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置，待凝固完全后，轻轻拔出样品槽模板，撕去胶带纸，胶板上即形成相互隔开的样品槽。
将有机玻璃内槽放入电泳槽中，加入0.5×TBE电泳缓冲液，以盖过胶板为宜。
胶板内的样品小槽
3．加样
用微量加样器将上述样品分别加入胶板的样品小槽内，每次加完一个样品为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，以免造成限制酶被污染。加样时，吸头不要插入胶板内，防止碰坏样品槽周围的凝胶面，每个样品槽的加样量不宜过多，本实验加样为10uL左右。(每块胶板需点一个Marker，这里即为Hind Ⅲ)
4．电泳
这里电泳样品为提取的质粒和酶解的质粒两种，所以要电泳两次。加完样品后应立即通电，进行恒压电泳。在低压条件下，线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系，为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝染料（蓝色）移动到距离胶板下沿约1～2cm处，停止电泳。
5．染色
将电泳后的凝胶浸入EB染液中，进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的DNA带。染色20min后，用大量水冲洗。
6．观察
在波长为254nm的紫外灯下，观察染色后的电泳凝胶。DNA存在处显示出红色荧光条带。
用凝胶自动成像仪处理代替。
五、注意事项
1．基因工程是微量操作技术，DNA样品与限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的正确性，且使用微量移液器时要将枪头没入液面以下并吹打，确认样品确实被加入反应体系。
2．酶应在－20℃冰箱中保存，取酶的操作必须严格在冰浴条件下进行，用完后立即放回－20℃冰箱，不要将酶在冰浴中放置过久，或放在高于0℃以上的环境中，以防止酶失活。
3．酶切加样次序为水、缓冲液和DNA，然后混匀。酶永远是最后加入的，如将酶直接加入浓缩的缓冲液中会引起严重的失水。酶切反应体系的溶液加完后，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底，不要用振荡器。此步操作是整个实验成败的关键，注意防止错加、漏加。
4．为了避免交叉污染，各样品用不同的吸头，且每次取酶时务必换吸头，以免造成限制酶被污染。
5．溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，用后用水彻底冲洗干净。
六、实验结果
1. 酶解反应的样品放入电泳槽中电泳时出现了问题，表现为电压一定时电流出奇的大，那么电泳液就会出现过度发热的状况，最后胶块出现了融化的现象，重复一次后一样，实验失败。
2. 提取质粒的电泳图如下：
第3泳道为marker，5~11为样品。其中5、6、8、10、11号泳道为pET28a质粒（5369bp），7、9号泳道为pEGFP-N3质粒（4.7bp）。可以看到条带有明显的拖尾现象（包括marker！），除了样品的问题，即质粒有超螺旋、线型、开环3种构型之外（在实验一的实验原理中有详细介绍），marker也拖尾那就说明电泳系统本身也有问题，比如缓冲液、胶的配制等。但这并不影响后面的转化实验，因为质粒的受体和供体都是大肠杆菌，先提取再转化，质粒不纯也不会影响转化细胞的生理特性，比如菌液PCR，扩充的目的片段中肯定会有其他基因的混杂，但转化实验不会受到影响。
七、思考题
1．简述EB显色的原理。
答：EB这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对的碱基之间，在紫外线激发下，未与核酸结合的溴化乙锭可被激发出橙红色萤光。在与DNA或双股RNA结合时，萤光强度会增强20倍，使得核酸电泳后的胶片可以辨识核酸的相对位置。在核酸分子中，EB分子插入到两层碱基对之间，发出红色荧光。在胶中加入终浓度为0.5μg/ml的EB，可以在电泳过程中随时观察核酸的迁移情况，这种方法使用于一般性的核酸检测。
2．使用溴化乙锭时应注意什么？
答：既然可以和DNA很好地结合，那就一定会对人体造成巨大伤害，所以使用过程要十分小心，简单来说就是要戴手套，EB试剂就放在实验区，不能随便拿走。实验中安全是最重要的。
3．说明不同电压对电泳结果的影响是什么？
答：在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小，也会产生拖尾现象，这对于鉴定DNA的纯度或是胶回收的步骤都是不能接受的。但电压过低，DNA移动速度会很慢，电泳时间较长。所以实际做电泳实验时应根据不同DNA片段和实验要求选择合适的电压。通常使用的电泳电压为90~120V，此时的电流会在40mA左右（可能不同的电泳仪有些差别）。
4．如何判断DNA的纯度？
答： DNA纯度可以A260/A280的比值表示：纯的DNA样品比值应大于1.8，纯的RNA样品比值应大于2.0。核酸样品中若含有蛋白质或苯酚等杂质，此比值则显著降低。可在分光计中直接读出A260/A280的比值。
实验三 感受态细胞的制备及转化
一、实验原理
感受态就是细菌吸收转化因子的生理状态，只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子。转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段。转化的基本原理是细胞处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸混合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在选择性培养基平板上培养，可选出所需的转化子。
二、实验目的
1．学习和理解影响细胞感受态的因素，掌握感受态细胞的制备方法。
2．掌握质粒的转化方法。把体外DNA引入受体细胞，使受体菌具有新遗传性，并从中选择出转化子。
三、实验材料和用具
材料：自制的质粒DNA、大肠杆菌(E.coli)菌种(DH5α菌株)。
试剂：
LB液体培养基120mL(无卡那霉素)，倒8个Kan—平板；
LB液体培养基120mL(有卡那霉素)，倒8个 Kan＋平板；
LB液体培养基20mL(不含卡那霉素)X2，用于液体培养；
LB液体培养基10mL(不含卡那霉素)X3，用于培养原液的配制；
0.1mol/LCaCl2溶液(灭菌备用)。
仪器：
恒温培养箱、恒温摇床、接种环、涂布器、冷冻离心机、离心管、超净工作台、高压蒸汽灭菌锅。
四、操作步骤
(一)大肠杆菌感受态细胞的制备
1．将对数生长期的E.coliDH5α菌悬液以1：50接种于20mL LB液体培养基中，37℃快速振荡培养4h。
2．取1.4mL培养液放入离心管中，取两管，在冰上放置10min，于4℃5000rpm离心10min。
3．将上层液体除尽，用0.6mL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30min。两管合为一管。
4．于4℃，5000rpm离心10min。
5．弃上清，加入200μL预冷的0.1mol/LCaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻，即制成了感受态细胞悬液。
(二)细胞转化
取200μL摇匀后的感受态细胞悬液，进行下一步的转化，转化如下（单位：μL）：
样品组即为我们的转化组：100μL感受态细胞＋2μL质粒DNA
对照1为受体菌对照组：100μL感受态细胞＋2μL无菌水
对照2为质粒DNA对照组：100μL0.1mol/LCaCl2＋2μL质粒DNA
将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却3～5min。上述各管中分别加入400μL LB液体培养基，使总体积为500μL，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养60min，使受体细胞恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性。
(三)平板培养
取各样品培养液100μL分别接种于不含卡那霉素和含卡那霉素的LB平板培养基上（分别记为Kan—和Kan＋），涂匀。37℃培养14h，待菌落生长良好且未相互重叠时停止培养。
(四)检出转化体
五、注意事项
1．这一个实验中的所有操作均要为无菌操作，在超净工作台内进行。
2．细胞转化中，42℃水浴90s要准确操作。
3．制备感受态细胞过程中，需要在冰上放置的一定不要在室温中放置。
六.实验结果
试验组 对照组一 对照组二
总的来说，这次转化实验是比较成功的。
从图中可以清晰的看出来
对照组2中的两个培养基均无菌落产生，说明无菌操作是比较到位的。
对照组1中加了抗生素的培养基中午菌落产生，未加入抗生素的培养基中形成了菌苔。说明该抗生素可以后效抑制该菌种的野生型的生命活动。
在转化组中我们看到未加入抗生素的培养基中形成了菌苔，加入了抗生素的培养基中有一个一个的单菌落，说明有一部分细菌成功的接受了外源基因并表达。之所以未形成菌苔是应为并非所有的菌都接受了外源基因，只有很少的一部分成功接受并表达了。所以看到的是一个一个的单菌落而非一片菌苔。
七、思考题
1．感受态细胞制备好后，为什么在转化前还要在冰上放置？
答：细菌处于0℃，CaCl2 的低渗溶液中，Ca2+的作用主要是破坏细胞膜上的脂质，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入，从低温突然提高到42℃短时间热刺激，应激反应下可产生大量cAMP，而cAMP可改变细胞膜通透性，促使细胞吸收 DNA复合物，从而大大提高转化率。
2．思考转化后平板培养应有的结果、分析自己培养的情况。
答： 自己的实验结果和应有的结果相比较，大部分比较符合。该有大量菌落长出的和有菌落长出的数量对比也很明显。只有对照组2中不应长菌的培养皿中长出了杂菌，说明在操作过程中没有严格的按照无菌操作的要求来进行。
参考文献：
1. 分子生物学教学实验中质粒提取原理与电泳图谱的探讨，张海涛等，生物学杂志，2008
2. 明理、细察、分析——浅谈质粒提取实验的几个教学关键点，韦明肯等，长江大学学报( 自然科学版)，2011
3. 一种高效、快速的大肠杆菌感受态细胞制备及质粒转化方法，李明才等，汕头大学医学院学报，2005
4. 细菌自然转化的分子机制研究进展，孙东昌等，微生物学报，2012
5. Molecular Biology of the Gene，Waston.etc，Person Education，2012