09级生科一班 张健
200900140167
细菌的简单染色法与革兰氏染色法
一、目的要求
1.学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的简单染色方法。
2.初步认识细菌的形态特征。
3.巩固显微镜（油镜）的使用方法和无菌操作技术。
4.了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法
二、基本原理
1.简单染色法
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
2．革兰氏染色法
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的．实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色．革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色．
三、实验器材
1.菌种 枯草芽孢杆菌,金黄色葡萄球菌,大肠杆菌
2.染色剂 草酸铵结晶紫染液，齐氏石炭酸复红染液，革兰氏染色液，卢戈式碘液，95%乙醇，番红复染液等
3.仪器或其他用具 显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶（内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，生理盐水等。
四、操作步骤
（一）.简单染色法
1.涂片
取两块载玻片，各滴一小滴（或用接种环挑取1~2环）生理盐水（或蒸馏水）于玻片中央、用接种环以无菌操作（图Ⅳ-1，具体操作参照实验一）分别从枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌球菌、大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液（或液体培养物）涂片，可用接种环挑取2~3环直接涂于载玻片上。
载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多；涂片要涂均匀，不宜过厚。
2.干燥 ：室温自然干燥。
3.固定
涂面朝上，通过火焰2~3次。
此操作过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。 热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜），否则会改变甚至破坏细胞形态。
4.染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖涂片薄膜为宜）。 吕氏碱性美蓝染色1~2min；石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min。
5.水洗
倒去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。 水洗时，不要直接冲洗涂面，而应使水从载玻片的一端流下。水流不宣过急，过丸以免涂片薄膜脱落。
6.干燥
自然干燥，或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
7.镜检
涂片干后镜检。 涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
（二） 革兰氏染色法
1.涂片将培养14—16小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰1—2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。
2.染色
（1）初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。
（2）媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。
（3）脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约20—30秒钟，立即用水冲净酒精。
（4）复染 用番红液染1—2分钟，水洗。
（5）镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
（6）同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
五．观察结果
金黄色葡萄球菌 枯草杆菌
大肠杆菌 自选未知菌
六．思考题
1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环节?
答：加热固定，染色时间
2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
答：因为用油镜观察时,镜头离玻片会很近.如果未完全干燥,载玻片上的液体会污染油镜镜头.镜头非常精密,被污染后不利于下次观察.正常情况下,观察前要用擦镜纸擦拭干净.
另外,一般作细菌装片不用盖盖玻片,所以待干燥后才能观察.如果盖上盖玻片后就不用考虑需要干燥的问题.
3.如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?
未经加热，水分蒸发太慢，制片时间过长；加热温度过高或时间过长会导致菌体变形或形态破坏。
4.微生物实验制片是否都需要染色？
不是，有的微生物细胞内含有色素，不用染色也可以看得很清楚。
5.革兰氏染色是否成功,有哪些问题要注意，为什么?
涂片的厚薄和脱色时间的掌握，是革兰染色成败的关键。
6.为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？
若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使细胞壁的成分和通透性均发生了改变，使结晶紫染液容易在脱色中被洗脱下来，易出现假阴性。
7.兰氏染色法中哪个步骤可以省略?
复染这一步可省略，因为脱色后G 是紫色的二G-就已经没有颜色了，这时，其实已经可以区分了，但是如果不经复染的话，镜检时看不清G-的细胞形态，而且如果没有和G 一起混染的话，基本看不清什么，但是如果只做区分的话，足够了
第二篇：细菌的简单染色法和革兰氏染色法
实验一 细菌的简单染色法和革兰氏染色法
一、目的要求
1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，并掌握革兰氏染色的方法。
2. 初步认识细菌的形态特征，掌握无菌操作技术。
3. 了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。
二、基本原理
1. 简单染色法：
用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。
2. 革兰氏染色法
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医生Gram创立的。革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态特征而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏染色阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫－碘复合物被保留在细胞内而不易着色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫－碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液(counterstain) 。碱性染料的作用象在细菌的简单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫(crystal violet)。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精(ethanol)。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。
三、器材
大肠杆菌(Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，蜡样芽孢杆菌(B. cereus)12～20h斜面培养物；革兰氏染液，载玻片，显微镜等。
四、操作步骤
1. 涂片 取两块载玻片，各滴一小滴蒸馏水于玻片中央，用接种环以无菌操作分别从培养14～16h的枯草芽孢杆菌和培养24h的大肠杆菌的斜面上挑取少量菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。
载玻片要洁净无油迹；滴蒸馏水和取菌不宜过多；涂片要均匀，不宜过厚。
2. 干燥 室温自然干燥。
3.固定 固定时通过火焰2～3次即可。此过程称热固定，其目的是使细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。
热固定温度不易过高，以载玻片背面不烫手为宜，否则会改变甚至破坏细胞形态。
4. 染色
（1）简单染色法：
① 染色滴加染液于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min；石炭酸复红或草酸铵结晶紫染色约1min。
② 水洗 倾去染液，用自来水冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
水洗时，不要直接冲洗液面，而应使水从载玻片的一段流下，水流不易过急过大，以免涂片薄膜脱落。
③干燥 自然干燥或用电吹风吹干，也可用吸水纸吸干。
④ 镜检 涂片干燥后镜检。
（2）革兰氏染色法：
① 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约1～2min，水洗。
② 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min，水洗。
③ 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现蓝色时为止，约20～30s，立即用水冲净酒精。
④ 复染 用番红液染1～2min，水洗。
⑤ 镜检 干燥后，置油镜下观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。
(3) 混合涂片法：
按上述方法，在同一玻片上，以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌或金黄色葡萄球菌混合涂片、染色、镜检进行比较。
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。
实验二细菌的芽孢和荚膜染色法
一、实验目的
1. 学习并掌握芽孢和荚膜染色法
2. 初步了解芽孢和荚膜的形态。
二、基本原理
芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。
荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。
三、器材
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），腊样芽孢杆菌（B. cereus），球形芽孢杆菌(B. sphaericus)，生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）；圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）或胶质芽孢杆菌(B. mucilaginosus)约2d无氮培养基琼脂斜面培养物；孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液。
荚膜染色液：绘图墨水，1％甲基紫水溶液，1％结晶紫水溶液，6％葡萄糖水溶液，20％硫酸铜水溶液，纯甲醇等。
四、操作步骤
（一）荚膜染色技术
方法一：
（1）将培养24h左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。
（2）滴加3～5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。
（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4~5min。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液染10min。
（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。
（5）用番红水溶液复染1min，水洗。
（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。
方法二：
（1）取两支洁净的小试管，分别加入0.2mL无菌水，再往一管中加入2~3接种环的腊样芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入2~3接种环的生孢梭菌的菌苔，两管中各自充分混合成浓厚的菌悬液。
（2）在菌悬液中分别加入0.2mL苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热3~5min。
（3）用接种环分别取上述混合液2~3环于两载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95％乙醇冲洗至无红色液流出。
（4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。
（5）取1~2接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然风干后，油镜观察，在淡紫色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。
（二）荚膜染色技术
1. 湿墨水法
（1）制备菌和墨水混合液 加一滴水于洁净的载玻片上，然后挑取少量菌体与其混合均匀。
（2）加盖玻片 将一洁净的盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。
（3）镜检 用低倍镜和高倍镜观察，若用相差显微镜观察，效果更好。
背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。
2. 干墨水法
（1）在载玻片一端滴一滴6％葡萄糖水溶液，取少许培养了72h的圆褐固氮菌在水滴中制成菌悬液，充分混匀。
（2）取一滴新配好的黑色素溶液（也可用绘图墨水）与菌悬液混合，另取一块载玻片作为推片，将推片一端平整的边缘与菌悬液以30°角接触后，顺势将菌悬液推向前方，使其成匀薄的一层，风干。
（3）用纯甲醇固定1min。
（4）加番红液数滴于涂片上，冲去残余的甲醇，并染30s，以细水流适当冲洗，吸干后油镜检查，背景黑色，荚膜无色，细胞红色。
3. Anthony法
（1）涂片 按常规取菌涂片。
（2）固定 空气中自然干燥。不可加热干燥固定。
（3）染色 用1％结晶紫水溶液染色2min。
（4）脱色 以20％硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。
（5）镜检 干后用油镜观察
菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。
实验三 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察
一、目的要求
1. 学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特征。
2. 学习用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。
二、基本原理
鞭毛是细菌的运动“器官”，细菌是否具有鞭毛，以及鞭毛着生的位置和数目是细菌的一项这要形态特征。细菌的鞭毛很纤细，其直径通常为0.01～0.02μm，所以，除了很少数能形成鞭毛束(由许多根鞭毛构成)的细菌可以用相差显微镜直接观察到鞭毛束的存在外，一般细菌的鞭毛均不能用光学显微镜直接观察到，而只能用电子显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用鞭毛染色法。
鞭毛染色的基本原理，是在染色前先用媒染剂处理，使它沉积在鞭毛上，使鞭毛直径加粗，然后再进行染色。鞭毛染色方法很多，本实验介绍硝酸银染色法和改良的Leifson氏染色法，前一种方法更容易掌握，但染色剂配制后保存期较短。
在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。细菌运动性的观察可用压滴法和悬滴法。观察时，要适当减弱光强度以增强反差，若光线太强，细菌和周围的液体难以区分。
三、器材
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiengsis)，假单胞菌(Pseudomonas sp.)，金黄色葡萄球菌；硝酸银鞭毛染色液，Leifson氏染色液，0.01％美蓝水溶液；载玻片，盖玻片，凹载玻片，无菌水，凡士林，显微镜等。
四、操作步骤
（一）鞭毛染色技术
1. 硝酸银染色法
（1）菌种的准备 要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种1~2次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a.取新配制的营养琼脂斜面(表面较湿润、基部有冷凝水)接种，28~32℃培养18~30h，让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔(不要取菌落中央的菌苔)作染色观察的菌种材料。
良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料，因为老龄细菌鞭毛容易脱落。
（2）载玻片的准备 将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮约20min，取出用清水充分洗净，沥干后置95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。
玻片要求光滑、洁净，尤其忌用带油迹的玻片（将水滴在玻片上，无油迹玻片水能均匀散开）
（3）菌液的制备 取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1~2mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。
挑菌时，尽可能不带培养基。
（4）制片 取一滴菌液于载玻片上的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或37℃）自然干燥。
干后应尽快染色，不宜放置时间过长。
（5）染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3-5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。
配制合格的染色剂（尤其是B液）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是鞭毛染色成败的重要环节。
（6）镜检 干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛。
菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。
2. 改良的Leifson氏染色法
（1）载玻片的准备、菌种材料的准备用硝酸银染色法。
（2）制片 用记号笔在载玻片反面将玻片分成3-4个等分区，在每一小区的一端放一小滴菌液。将玻片倾斜，让菌液流到小区的另一端，用滤纸吸去多余的菌液。室温或37℃自然干燥。
（3）染色 加Leifson氏染色液覆盖第一区的涂面，隔数min后，加染液于第二涂面，如此继续染第三、四区。间隔时间自行议定，其目的是为了确定最佳染色时间。在染色过程中仔细观察，当整个玻片都出现铁锈色沉淀、染料表面现出金色膜时，即直接用水轻轻冲洗（不要先倾去染料再冲洗，否则背景不清）。染色时间大约10min。自然干燥。
（4）镜检 干后用油镜观察。
菌体和鞭毛均呈红色。
（二）运动性观察
玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法。
1. 压滴法
（1）制片 在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0.01％的美蓝水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净的盖玻片，使其一边与菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片时压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运动。
（2）镜检 先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚度不能超过0.17nm。观察时，要用略暗光线。
有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随水流运动区别。
2. 悬滴法
（1）涂凡士林 取洁净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林。
（2）加菌液 在盖玻片中央滴一小滴菌液。为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央。
（3）盖凹玻片 将凹玻片得凹槽对准盖玻片中心得菌液，并轻轻盖在盖玻片上。轻轻按压使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位于凹槽中央。
若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上面影响观察。
（4）镜检 先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜观察，盖玻片厚度不能超过0.17nm，并要十分细心，以免压碎盖玻片、损伤镜头。
观察过程要在略暗的光线下进行。
实验四酵母菌的形态观察及死、活细胞的鉴别
一、实验要求
1. 观察酵母菌的形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死、活细胞的染色方法。
2. 掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。
二、基本原理
酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，其大小通常比常见细菌大几倍甚至几十倍。繁殖方式也比较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色制成水浸片和水－碘水浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色，由于细胞中新陈代谢的作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色，而对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可以观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。但美蓝的浓度、作用时间等均有影响，应加注意。
三、器材
酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)或卡尔酵母（S. calsbergensis）；0.05%，0.1%吕氏碱性美蓝染液，革兰氏染色用的碘液；显微镜，载玻片，盖玻片等。
四、操作步骤
1. 美蓝浸片观察
（1）在载玻片中央滴加1滴0.1％吕氏碱性美蓝染液，液滴不可过多或过少，以免盖上盖玻片时，溢出或留有气泡。然后按无菌操作法取在豆芽汁琼脂斜面上培养48h的酿酒酵母少许，放在吕氏碱性美蓝染液中，使菌体与染液均匀混合。
（2）用镊子夹盖玻片一块，小心地盖在液滴上。盖片时应注意，不能将盖玻片平放上去，应先将盖玻片地一边与液滴接触，然后将整个盖玻片慢慢放下，这样可以避免产生气泡。
（3）将制好地水浸片放置3min后镜检。先用低倍镜观察，然后换用高倍镜观察酿酒酵母的形态和出芽情况，同时可以根据是否染上颜色来区别死、活细胞。
（4）染色0.5h后，再观察一下死细胞数目是否增加。
（5）用0.05％吕氏碱性美蓝染液重复上述的操作。
2. 水－碘浸片观察
在载玻片中央滴一滴革兰氏染色用的碘液，然后再在其上加三滴水，取酿酒酵母少许，放在水－碘液滴中，使菌体与溶液混匀，盖上盖玻片后镜检。
实验五 细菌、放线菌、酵母及其它真菌菌落的比较及微观形态观察
一、目的要求
1. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌落形态特征。
2. 观察细菌、放线菌、酵母、青霉和平菇菌丝等代表种类的菌体的微观特征。
3. 学习描述菌落特征的方法。
二、基本原理
菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。细菌、放线菌、酵母、霉菌和食用菌，每一种微生物在一定的培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产中常被应用。
微观特征是鉴定微生物种类的主要依据，通过显微观察可以了解四大类微生物的主要特征。
三、器材
圆褐固氮菌或大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，灰色链霉菌，酿酒酵母，青霉或其它霉菌，平菇或其它食用菌菌丝体。
载玻片，盖玻片，无菌水滴瓶，酒精灯，接种环、接种钩、显微镜等。
四、操作步骤
1. 菌落形态观察
观察比较圆褐固氮菌或大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、灰色链霉菌、酿酒酵母、青霉或其它霉菌、平菇或其它食用菌菌丝体在平板培养基上形成的菌落特征，按照下列菌落描述的方法记录结果。
（1）大小：大、中、小。或用十字交叉法测量菌落直径。
（2）形态：圆形、不规则形。
（3）干湿：干燥、湿润、粘稠。
（4）高度：扁平、隆起、凹下。
（5）透明度：透明、半透明、不透明。
（6）颜色：白色、乳白色、黄色、金黄色、绿色、红色、褐色等。中间与边缘有无区别。
（7）边缘：整齐、不整齐。
2. 菌落微观形态观察
（1）取细菌固定玻片，用油镜观察细菌的形态。
（2）取放线菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。
（3）取酵母菌固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察放线菌的形态。
（4）取青霉或黑曲霉固定玻片，用低倍镜和高倍镜观察其菌丝和分生孢子梗的形态。
（5）挑取少量平菇或其它食用菌的菌丝体，用低倍镜和高倍镜观察其形态，观察有无锁状联合。
边观察，边用铅笔绘图。左眼观察视野，右眼观察图纸。
实验六细菌和放线菌培养基的制备
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究目的不同，所以培养基种类很多。培养基可以为微生物生长、繁殖提供充足的水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子等，不同微生物对pH要求不同，酵母和霉菌一般的培养基一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基一般是偏碱性的，所以配制培养基时需要调整pH值。
根据培养基的成分不同，培养基可以分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基；根据培养基的物理状态可以分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基；根据培养基的用途可以分为基础培养基、加富培养基、鉴别培养基和选择培养基。本实验主要学习制备培养细菌和放线菌的2种培养基。
一、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）
（一）目的要求
1. 明确培养基的配制原理。
2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（二）基本原理
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普遍的细菌基础培养基，，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，培养基中的牛肉膏主要为微生物生长提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机盐，琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下（1.5%~2%）下96℃时溶化，在45℃时凝固，通常不被微生物分解利用。
由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。
牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：
牛肉膏 3.0g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
琼脂 20g
水 1000mL
pH 7.4～7.6
（三）器材
1、溶液或试剂：牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl。
2、仪器或其它用具：试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装装置，天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，报纸或牛皮纸，记号笔，线绳或尼龙绳，纱布等。
（四）操作步骤
1. 称量 按照培养基配方比例依次称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。注意牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或培养皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯；蛋白胨易吸潮，在称取时动作要迅速；严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净插干，再称取另一种药品。瓶盖也不要盖错。
2. 溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然好在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需总体积，将称好的琼脂加入后，再加热溶化。加热时要用玻棒不断搅拌，防止糊锅或溢出。最后补足所损失的水分。如果是制备三角瓶盛固体培养基时，可以先将一定量的液体培养基装入三角瓶，再按比例加入琼脂，不必加热溶化，而是加热和溶化同步进行，节省时间。
3. 调pH 先用精密试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达到7.6。反之，用1mol/LHCl进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物或实验，其pH的调节可以用酸度计进行。
4. 过滤 趁热用4层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般没有特殊要求的情况下，这一步可以省去（本实验不需过滤）。
5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基装入三角瓶或试管内。分装试管时，分装量为试管总长的1/5～1/4，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。注意分装速度要迅速，防止培养基凝固；不要将培养基溅到管（瓶）口，以免沾污棉塞而引起污染。
6. 加棉塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等）。棉塞要求松紧适度，既能阻止外界微生物进入而引起污染，又能够保证有良好的通气性能。
正确地棉塞要求形状、大小、松紧与试管口（或三角瓶口）完全适合，过紧则妨碍空气流通，操作也不便；过松则达不到滤菌的目的。加塞时，大头朝外，试管内塞入2/3，试管外留1/3。手提棉塞，试管不下落为不松，拔掉棉塞时不发出较大声响为不紧。棉塞制作过程如图2.1所示。
三角瓶封口可以用棉塞，也可以用8层纱布重叠而成。
7. 包扎 加塞后，取7支同样规格的试管，棉塞顶端用双层报纸或1层牛皮纸覆盖，再用线绳或尼龙绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期等。三角瓶加塞后直接覆盖双层报纸或1层牛皮纸，用同样的方法扎好。
8. 灭菌 将上述培养基在在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌20~30min。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。
9. 摆放斜面 灭菌结束后，应使压力自然降低至0时，打开锅盖，将锅盖错开一条10几cm的缝隙，利用锅体余热将报纸和棉塞烘干，然后去掉锅盖，当培养基温度降至50~60℃时取出，摆放斜面。将有棉塞的一端搁在玻棒或小木条上，斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
10. 无菌检查 随机抽取几把冷却凝固后的培养基，放在37℃的温箱中培养24~48h，以检查灭菌是否彻底。
二、高氏(Gause)1号培养基（培养放线菌用）
（一）目的要求
1. 明确培养基的配制原理。
2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。
（二）基本原理
高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基。这种培养基是由可溶性淀粉（作为碳源），KNO3（作为氮源）、NaCl、K2HPO4?3H2O、MgSO4?7H2O（作为无机盐，提供钠、钾、磷、镁、硫等离子）和FeSO4?7H2O(作为微量元素，提供铁离子)等组成。由于磷酸盐和镁盐相混合时产生沉淀，因此，在混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分。对于象FeSO4?7H2O这样的微量成分，则可预先配成高浓度的贮备液，在配制培养基时按需要加入一定的量。
高氏1号培养基配方如下：
可溶性淀粉 20 g
KNO3 1 g
NaCl 0.5 g
K2HPO4?3H2O 0.5 g
MgSO4?7H2O 0.5 g
FeSO4?7H2O 0.01 g
琼脂 20 g
水 1000mL
pH 7.4～7.6
（三）器材
可溶性淀粉，KNO3，NaCl，K2HPO4?3H2O，MgSO4?7H2O和FeSO4?7H2O，琼脂，1mol/LNaOH，1mol/LHCl。
试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装装置，天平，药匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5.5～9.0），棉花，报纸或牛皮纸，记号笔，线绳或尼龙绳，纱布等。
（四）操作步骤
1. 称量和溶化
按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。再称取其它各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO4?7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4?7H2O配成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加入1mL的0.01g/mL的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，则先加入琼脂溶化后再加其它物质。
2. pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同前。
实验七真菌分离和培养用培养基的制备
一、马丁氏（Martin）培养基（分离真菌用）
（一）目的要求
通过对分离真菌用的马丁氏（Martin）培养基配制，掌握对选择培养基的配制方法，并明确选择的原理。
（二）基本原理
马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4?7H2O、孟加拉红（玫瑰红，Rose Bengal）和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4?7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷、镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以达到优势生长，从而达到分离真菌的目的。
马丁氏培养基配方如下：
KH2PO4 1g
MgSO4?7H2O 0.5g
蛋白胨 5g
葡萄糖 10g
琼脂 15-20g
水 1000mL
pH 自然
此培养液1000mL加1%孟加拉红1%水溶液3.3mL。临用时每100mL培养基中加入1%链霉素液0.3mL。
（三）器材
KH2PO4、MgSO4?7H2O、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、孟加拉红、链霉素。
试管、玻棒、铝锅、量筒、培养基分装装置、天平、药匙、高压灭菌锅等。
（四）操作步骤
1、称量和溶化 按培养基配方，准确称取各成分，并将各成分依次溶化在少于所需要的水量中。待各成分完全溶化后，补足水分到所需体积。再将孟加拉红配成1%的水溶液，在1000mL培养液中加入1%的孟加拉红溶液303mL，混匀后加入琼脂加热溶化。
2、分装、包扎、灭菌及无菌检查同实验六。
3、链霉素加入 由于链霉素受热容易分解，所以临用时将培养基溶化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液，在100mL培养基中加1%链霉素液0.3mL，使每mL培养基中含链霉素30微g。
二、马铃薯葡萄糖培养基（简称PDA培养基，培养真菌用）
（一）目的要求
通过对培养真菌用的PDA培养基配制，掌握对半合成培养基的配制方法，并明确选择的原理。
（二）基本原理
马丁氏培养基是一种用来培养真菌的半合成培养基。此培养基是由马铃薯、葡萄糖、琼脂等组成。其中马铃薯煮汁可以提供碳源、氮源、无机盐和维生素等，葡萄糖主要作为碳源，琼脂为凝固剂。马铃薯的表皮中含有龙葵碱的化学成分，对菌丝生长有抑制作用，所以马铃薯在使用时要去皮。在PDA培养基上大多数真菌都可良好生长。在PDA 培养基基础上，可以添加一些其它物质，使培养基营养更为丰富和全面，真菌菌丝可以生长的更好。如综合PDA培养基就是在PDA基础上添加0.3%的KH2PO4和0.15%的MgSO4?7H2O以及微量的维生素B1而配制而成的。由于多数真菌喜欢偏酸性环境，而培养基灭菌过程中部分糖类会转变为酸，所以一般不需要调pH值。如果是培养对酸碱度有特殊要求的真菌，可以用稀盐酸或稀氢氧化钠调节。
PDA培养基配方如下：
马铃薯（去皮） 200g
葡萄糖 20g
琼脂 15-20g
水 1000mL
pH 自然
（三）器材
马铃薯、葡萄糖、琼脂等。
小刀，试管、玻棒、铝锅、量筒、培养基分装装置、天平、药匙、纱布、高压灭菌锅等。
（四）操作步骤
1. 马铃薯煮汁的制备
将马铃薯洗净去皮，称量200g，用小刀切成长、宽为2cm，厚度为3~5mm的土豆片，要求大小厚薄均匀。在1000mL水中煮沸15~20min，煮至无白心为止。用4~6层纱布过滤，补充水分至1000mL。
2. 葡萄糖和琼脂的称量与溶化
称取15~20g琼脂，加入土豆汁中，继续加热，并不断搅拌，当琼脂充分溶化后，加入葡萄糖，搅拌直至完全溶化。
3. 分装、加棉塞、捆把、灭菌及灭菌同前。
实验八微生物的液体培养
一、基本要求
1. 掌握微生物液体发酵培养基的制作方法。
2. 了解常见微生物液体培养的原理和方法
二、基本原理
固体发酵生产是将原料及菌体吸附在疏松的固体支持物上，通过微生物的代谢活动，使发酵原料转化成发酵产品。优点是设备简单，不需要结构复杂的发酵罐；方法简单，类似传统的制曲法；能耗低，不需要大量通气和搅拌；原料粗放，可用很多种其它发酵工艺无法利用的工农业副产品作原料；不易染菌，因霉菌能在水分较低的基质表面增殖而细菌不易生长；产物回收所消耗溶剂和所产生废水较少。其缺点是：设备占地面积多，劳动强度大，传质和传热困难，产率和收率低，副产物多，培养过程进行检测困难。
液体发酵生产是将发酵原料制成液体培养基，接种微生物， 通过其代谢活动，使发酵原料转化成发酵产品。液体发酵有表面发酵和深层发酵两种方式，其中深层发酵是发酵生产的主要方式。表面发酵是在缺乏通气装置的情况下，对一些生长快速的微生物进行好氧静置培养。这种发酵通常在表面形成菌膜层。表面发酵的优点是设备简单，能耗低，原料粗放；其缺点是占地面积多，劳动强度大，发酵时间长。
深层发酵是微生物的菌体或菌丝均匀分散在液体培养基中，通过向培养液强制通气或不通气进行产物合成的发酵。深层发酵的优点如下：占地面积小少，生产规模大；发酵速度快，生产效率高；生产机械化，易于自动控制，劳动生产率高；发酵设备密闭，传热传质好，生产便于管理；有利于产品提取，所得产品质量高。其缺点是设备条件要求较高。
摇瓶培养是一种在实验室进行制种、菌种筛选、性能鉴定、培养基优化时最常用到的一种试验方法。特别是在菌种的生产中，液体发酵菌种有着明显的优点，菌龄一致，延滞期短，便于接种等优点。
三、器材
黑曲霉、裂褶菌、大肠杆菌 ；PDA液体培养基、肉膏蛋白胨液体培养基；250mL三角瓶；无菌水；摇床；超净工作台；纱布等。
四、操作步骤
1. 菌种的活化：将斜面保存菌种活化1~2次，黑曲霉培养2~5d，使其产生孢子。
方法一：将裂褶菌斜面菌种活化2~3次，取培养4d的斜面菌种刮取菌苔，用无菌生理盐水进行稀释成菌悬液，备用。
方法二：将活化菌种接种子液体培养基培养3d，再转接到发酵液体培养基，培养6d。
2. 黑曲霉菌悬液的制备：用无菌水洗下黑曲霉的孢子制成菌悬液。然后吸取2mL如图2.2所示接入液体发酵培养基中。
3. 摇瓶发酵培养
各组实验均取250mL锥形瓶若干，编号后，分别加入上述摇瓶培养基80mL于0.8 kg/cm2灭菌20min，冷却后分别接种种子液5mL；培养温度24℃；静置培养1d后，振荡培养6~8d，摇床转速180rpm/min.
4. 观察与测定
（1）菌丝体干重的测定 收取的发酵醪以2500rpm离心或过滤获得菌丝球，70℃烘干至恒重，以每100mL发酵醪中菌丝体干重（g/100mL）计。
（2）菌丝和菌丝球的观察 观察菌丝球生长情况，大小、质地、颜色、内部情况。挑取菌丝，在显微镜下观察菌丝生长情况。
（3）染菌检测 观察发酵液的色泽、气味、固液相状况；培养液涂片，Loffler碱性美蓝单染色，镜检。同时，用牛肉膏蛋白胨培养基培养24－48h检查染菌菌落。
实验九 微生物的分离与纯化
一、实验目的
掌握倒平板的方法和几种分离纯化微生物的基本操作技术
二、基本原理
在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合倒平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。
土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
三、器材
高氏1号琼脂培养基，肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，盛9mL无菌水的试管，盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10％酚，无菌培养皿，链霉素，土样等。
四、操作步骤
1. 稀释涂布平板法
（1）倒平板 将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55~60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10％酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每mL培养基中含链霉素30μg。然后分别倒平板，每种培养基制三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。试管(瓶)口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板，最好是将平板放室温2~3d，或23℃培养24h，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
（2）制备土壤稀释液 称取土样10g，放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1mL无菌吸管从中吸取1mL土壤菌悬液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1mL无菌吸管从此试管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
（3）涂布 将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5、10-6三种稀释度，然后用三支1mL无菌吸管分别由10-4、10-5、10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2mL对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂布棒在培养基表面轻轻的涂布均匀，如图2.3所示。
图2.3 从土壤中分离微生物的操作过程示意图
（4）培养 将高氏1号培养基和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5d，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3d。
（5）挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃ 和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。整个分离过程见图
2. 稀释混合平板法
此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先分别吸取0.5mL10-4、10-5、10-6稀释度的土壤悬液对号放入平皿，然后再倒入溶化后冷却到45℃左右的培养基，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，待冷凝成平板后，分别倒置于28℃和37℃温室中培养后，再挑取单菌落，直至获得纯培养。
3. 平板划线分离法
（1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称。
（2）划线 在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列两种：
① 用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线的部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线的部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线的部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。
② 将挑取有样品的接种环再平板培养基上作连续划线。完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。
（3）挑菌 同稀释涂布平板法，一直到菌分纯为止。
实验十微生物大小测定及直接计数
一、基本要求
1. 掌握利用显微测微尺测量微生物大小的基本方法。
2. 掌握使用血球计数板进行微生物计数的基本方法。
二、基本原理
1. 大小测定的基本原理
微生物细胞大小，是微生物的基本形态特征之一。由于菌体很小，只能在显微镜下测量。用来测定微生物大小的工具有目镜测微尺和镜台测微尺（图2.4）。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片。一般将1mm等分为100格（或2mm等分为200格），每格长度等于0.01mm（即10μm）。是专用于校正目镜测微尺每格长度的。
目镜测微尺是一块可放在目镜内隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，有等分50小格或100小格两种，每5小格间有1长线相隔。由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同。因此，目镜测微尺不能直接用来测定微生物的大小，在使用前必须用静态测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测定微生物的大小。
2. 基本原理
用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常见的微生物计数方法。此法的优点是直观、快捷。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬浮液）放在血球计数板载玻片和盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的（0.1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板，通常是一块特制的载玻片，其上由4条槽构成3个平台。中间的平台又被一短横槽横隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网cm9个大方格，中间的大方格即为计数室。微生物的计数就在计数室中进行。血球计数板的构造见图2.5。
计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格，而每个中方格又分为25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，，而每个中方格又分为16个小方格，（图2.5CD）。但无论是哪种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格（见图2.5D）。
每一个大方格边长为1mm，则每个大方格的面积为1 mm2，盖上盖玻片后，载玻片和盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1 mm3。
在计数时，通常数5个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得到一个大方格的总菌数，然后再换算成1mL菌液中的总菌数。
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设5个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么1个大方格中的总菌数（即0.1 mm3中的总菌数为A/5×25×B。
因 1mL=1cm3=1000mm3，
故 1mL菌液中的总菌数=A/5×25×10×1000×B
=50000×A?B（个）
同理，如果是16个中方格的计数板，设5个中方格的总菌数为A’，则
1mL 菌液中总菌数=A’/5×16×10×1000×B’
=32000A’?B’(个)
三、器材
1. 大小测量：枯草芽胞杆菌染色玻片标本或酵母、霉菌的分生孢子、食用菌的担孢子，目镜测微尺，镜台测微尺，显微镜，擦镜纸，吸水纸，香柏油等。
2. 直接计数：酿酒酵母菌悬液或霉菌孢子悬浮液，血球计数板，显微镜，盖玻片，无菌毛细管。
四、操作步骤
（一）微生物大小的测定
1. 目镜测微尺的标定
（1）放置目镜测微尺 取出接目镜，旋开接目镜透镜，将目镜测微尺的刻度朝下放在接目镜筒内的隔板上，然后旋上接目透镜，最后将此接目镜插入镜筒内。
（2）放置镜台测微尺 将镜台测微尺置于显微镜的载物台上，使刻度面朝上。
（3）校正目镜测微尺 先用低倍镜观察，对准焦距，当看清镜台测微尺后，转动接目镜，使目镜测微尺的刻度与镜台测微尺的刻度平行，移动推进器，使目镜测微尺和镜台测微尺的某一区间的两对刻度线完全重合，然后计数出两对重合线之间各自所占的格数（图2.6）。根据计数得到的目镜测微尺和镜台测微尺重合线之间各自所占的格数，通过如下公式换算出目镜测微尺每小格所代表的实际长度。
目镜测微尺每小格长度（μm）=
两对重合线间镜台测微尺的格数×10/ 两对重合线间目镜测微尺格数。
同法校正在高倍镜和油镜下目镜测微尺每小格所代表的长度。
2. 菌体大小的测定
目镜测微尺校正后，移去镜台测微尺，换上枯草芽胞杆菌染色玻片标本（或酵母、霉菌的分生孢子、食用菌的担孢子），调整焦距使菌体清晰，转动目镜测微尺（或转动标本），测出枯草芽胞杆菌的长和宽各占几格，将测得的格数乘以目镜测微尺每小格所代表的长度，即可换算出此单个菌体的大小值。而且一般是用对数生长期的菌体来进行测量的。
3. 取出目镜测微尺，将接目镜放入镜筒，再将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭后，放入盒内保存。
（二）微生物的直接计数
1. 稀释 将酿酒酵母菌悬液（或孢子悬浮液）进行适当稀释，菌液如不浓，可不必稀释。
2. 镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需冲洗后才能进行计数。洗净后用手指捏住两侧甩干，切不可用纸擦拭。
3. 加样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴（不可过多），让菌液延缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。
4. 显微镜计数 静置5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前如发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有2-10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的军体进行计数。位于格线上的菌体只数上方和有线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。
5. 清洗血球计数板 使用完毕后，将血球计数板在水龙头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检观察每小格内是否有残留菌体，或其它沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。
实验十一水中细菌总数的测定
一、目的要求
1. 学习水样的采取方法和水样细菌总数测定的方法。
2. 了解水源的平板菌落计数的原则。
二、基本原理
本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差别很大，不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通肉膏蛋白胨琼脂培养基。
三、器材
肉膏蛋白胨琼脂培养基，无菌水；灭菌三角瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。
四、操作步骤
1. 水样的采取
（1）自来水 先将自来水龙头用火焰灼烧3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角瓶接取水样，以待分析。
（2）池水、河水或湖水 应取距水面10~15cm的深层水样，先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。
2. 细菌总数测定
（1）自来水
① 用灭菌吸管吸取1mL水样，注入灭菌培养基中。共做两个平皿。
② 分别倾注约15mL已溶化并冷却到45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，并立即在桌面上作平面旋摇，使水样与培养基充分混匀。
③ 另取一空的灭菌培养皿，倾注肉膏蛋白胨琼脂培养基15mL，作空白对照。
④ 培养基凝固后，倒置于37℃温箱中，培养24h，进行菌落计数。两个平板的平均菌落数即为1mL水样的细菌总数。
（2）池水、河水或湖水等
① 稀释水样 取3个灭菌空试管，分别加入9mL灭菌水。取1mL水样注入第一管9mL灭菌水内，摇匀，再自第一管取1mL至下一管灭菌水内，如此稀释到第三管，稀释度分别为10-1、10-2、10-3。稀释倍数看水样污浊程度而定，以培养后平板的菌落数在30~300个之间的稀释度最为合适，若三个稀释度的菌数均多到无法计数或少到无法计数，则需继续稀释或减小稀释倍数。一般中等污秽水样，取10-1、10-2、10-3三个连续稀释度，污秽严重的取10-2、10-3、10-4三个连续稀释度。
② 自最后三个稀释度的试管中各取1mL稀释水加入空的灭菌培养皿中，每一稀释度做两个培养皿。
③ 各倾注15mL已溶化并冷却至45℃左右的肉膏蛋白胨琼脂培养基，立即放在桌上摇匀。
④ 凝固后倒置于37℃培养箱中培养24h。
3. 菌落计数方法
（1）先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个培养皿有较大片菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的培养皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到培养皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落水乘2以代表全培养皿的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
（2）首先选取平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该水样的细菌总数。
（3）若有两个稀释度的平均菌落数均在30~300之间，则按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2，应采取两者的平均数；若大于2，则取其中较小的菌落总数。
（4）若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数。
（5）若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数。
（6）若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数。
计算菌落总数方法举例（如表2.1）
表2.1菌落总数计算方法例表
