免疫组化综述

时间:2024.3.19

综述

摘要 在临床病理诊断中,免疫组化技术是一项应用广泛的技术,可鉴定多方面的指标,通过免疫组化可以判断肿瘤和疾病的多方面指标。

关键词 病理诊断 免疫组化技术

前言

免疫组化,是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应,即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学技术。在临床病理研究中免疫组化技术的应用很广泛,随着技术的发展免疫组化不仅在肿瘤的研究中具有重要意义,而且在疾病的确定等方面也表现出了良好的应用价值。

1 免疫组化技术

观察组织切片中抗原的数量及其在组织中的分布情况,对抗原进行定位、定性及定量的研究,称为免疫组织化学。由于抗原与抗体特异性结合,因此通过免疫组化使标记抗体的显色剂( 酶、荧光素、同位素、金属离子等等) 显色来确定组织细胞内抗原( 多肽和蛋白质) 。IHC 所用标本主要为两大类: 组织标本和细胞标本,其中制作组织标本最常用、最基本的方法是石蜡切片。

2 免疫组化技术在临床诊断中的应用

2.1 肿瘤良恶性的判断

对于反应性增生还是肿瘤性增生,可用免疫球蛋白( Ig) 的轻链抗体检测B 淋巴细胞增生的单克隆或多克隆性来区别。在滤泡反应性增生时,滤泡反应中心的细胞不表达细胞凋亡蛋白( bcl-2) ,bcl-2 阴性; 而在滤泡性淋巴瘤中,由于90% 以上肿瘤性滤泡细胞有bcl-2 的高表达,bcl-2 阳性。而增殖细胞核抗原( PCNA) ,周期素( Cycling),核抗原( Ki-67) 通过对肿瘤细胞增生的程度作出评价,从而提示增生细胞的良恶性。

2. 2 确定肿瘤分期

肿瘤分期是判断预后的一个指标,与是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭密切相关,而通过免疫组化方法可以判断肿瘤是否浸润、有无淋巴管或血管侵袭。

2. 3 细胞属性的判定

通过特定抗体标记出细胞内相应的抗原成分,来判定细胞的属性,确定肿瘤的来源。如细胞角蛋白( CK) 是上皮性标记,CK 阳性提示肿瘤为上皮源性肿瘤; 降钙素抗体是甲状腺髓样癌特有的标记; 甲状腺球蛋白( Tg) 阳性提示是甲状腺滤泡性癌; 前列腺特异性抗原( PAS) 仅见于前列腺上皮; 胶质纤维酸性蛋白( GFAP) 阳性则提示胶质肿瘤; CD20 和CD79a 阳性则提示B 细胞淋巴瘤; 平滑肌肌动蛋白( Actin) 阳性提示肿瘤为平滑肌源性; 胃肠道间质瘤中原癌基因蛋白产物CD117 阳性; 血管源性肿瘤中内皮细胞标记物CD34 阳性等等。

2. 4 确定来源不明的转移瘤的原发部位

对于来源不明的转移瘤,用免疫组化技术有助于确定恶性肿瘤的组织学来源[5],进一步确定原发部位。

2. 5 对“未分化”恶性肿瘤的分类

未分化恶性肿瘤包括癌或肉瘤,在HE 切片上由于肿瘤的“未分化”而缺少肿瘤细胞的起源特征不能分类,初步区分组织学类型用非特异性抗体,在其基础上再选用特异性抗体做进一步鉴定。

2. 6 进一步分类不同器官与组织交界处肿瘤

由于重叠的特征,在一些组织器官交界处的肿瘤,仅凭组织学基础对肿瘤进行分类很困难。如胃肠道梭形细胞肉瘤是肌肉起源的平滑肌肉瘤,是间质起源的胃肠道间质瘤( GIST) ,还是神经起源的神经鞘瘤; 同样发生于组织交界处的肿瘤有睾丸胚胎癌与精原细胞癌,两者较难区别,且治疗与预后显著不同,但用免疫组化检测角蛋白就较易于区别: 角蛋白阴性则为精原细胞癌,而角蛋白阳性则为胚胎癌。

2. 7 及时准确的发现微小转移灶

采用常规病理方法难以检出的实体瘤转移称为微小转移灶。在常规组织切片中,辨别单个或几个转移性肿瘤细胞很难,淋巴结内窦性组织细胞增生与某些癌的早期转移有时也不易区别,而采用免疫组化方法,有助于及时准确的发现微小( 癌) 转移灶。对乳腺癌而言主要是腋窝淋巴结的检测,淋巴结微转移患者预后差,这对进一步治疗和预后判断十分有意义。

2. 8 与治疗和预后有关的免疫组化标记物

与治疗及预后有关的标记物主要分以下为三类: ( 1) 肿瘤基因标记物, 2) 细胞增殖性标记物, ( 3) 类固醇激素受体.

2. 9 对感染性疾病诊断

应用抗病毒、细菌、真菌和寄生虫抗原的特异性抗体进行免疫组化染色,可以检测和诊断许多感染性疾病病原微生物,如乙型肝炎病毒( HBV) 、巨细胞病毒( CMV) 、人乳头状瘤病毒( HPV) 、疱疹病毒( HSV) 、丙型肝炎病毒( HVC) 、细小病毒B19、人禽流行性感冒病毒( AIV) 、严重急性呼吸综合征冠状病毒( SARS) 等等,由于免疫组化在感染性疾病诊断中具有及时性、低风险性、高敏感性、特异性、有效性等特点,可以用于( 1) 用于人类新病原微生物的识别;( 2) 提供快速的形态学诊断,使严重感染性疾病得以早期治疗; ( 3) 在无法取得新鲜组织或尚无培养方法的情况下,提供诊断并对发病机制进行研究和认识。

2. 10 药物靶点免疫组化

免疫组化及分子病理学方法在疾病诊断中仅仅起辅助治疗的作用,而药物病理学是用病理学的方法确定药物 治疗的靶点、评价药物治疗的疗效、预测药物治疗的反应,因此药物靶点免疫组化属“独立诊断”。

3 免疫组化中应注意的问题

3.1 假阳性

由于免疫组化的步骤繁多,对每一步的操作要求规范准确,很多失误可能造成假阳性的结果,可能的原因有:(1)一抗的浓度及一抗是否失效;(2)试剂未充分覆盖组织;(3)抗体孵育时间过长;(4)操作过程中组织变干,造成组织边缘收缩或损坏形成伪影;(5)DAB显色时间太长;(6)由于胞浆里含有较多的蛋白质;(7)非特异性抗体吸附常见于坏死组织中,

使坏死组织呈较高的背景染色,在免疫组化中应避免选择坏死组织较多的蜡块。

3.2 假阴性

导致假阴性结果的原因有: ( 1) 抗原修复方法选择不当,根据不同的抗原特点采用不同的修复方法,大多数抗体要求热修复,热修复又包括高压修复、微波修复及煮沸热修复; 而对某些细胞内抗原和细胞间质抗原需要用酶消化,如表皮生长因子( EGFR) 要求胃蛋白酶( Pepsin) 消化,而Vimentin 则不用修复; ( 2) 一抗本身的问题: 一抗效价降低或失效。在免疫组化中染色结果的假阴性会导致错诊或漏诊,进而影响临床诊断及延误治疗。解决这一问题的可通过设立阳性对照,比较两者染色结果。若阳性对照有表达,表明试剂和染色体系及实验步骤均无问题; 若阳性对照无表达,则检测过程中某一试剂或某个步骤存在问题,应逐一查找原因。

4 总结

随着免疫组化技术的发展,在临床病理诊断研究中,免疫组化的作用显得越来越重要,但是免疫组化技术也有自身的缺陷和不足,免疫组化的步骤比较繁琐,而且每一步的操作要求比较精确,还需要有相应的对照,因此我们要恰当的运用免疫组化技术,要使免疫组化技术能在人类疾病的鉴定和治疗过程中起积极的作用。


第二篇:免疫组化操作步骤


免疫组化操作步骤

第一节 免疫组化操作步骤及抗原修复(供参考)

第二节 免疫组化抗原热修复的技术要点(供参考)

(一)、仪器设备

1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.

2. 水浴锅

(二)、试 剂

1. PBS缓冲液(pH7.2―7.4)

2.0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液(CB,pH6.0,1000ml)

3. 3%甲醇―H2O2溶液:用30%H2O2和80%甲醇溶液配制

4. 风裱剂:a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液(pH9.0–9.5)等量混合 b 油和TBS(PBS)配制

5.TBS/PBS pH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;pH7.0-7.4适合光学纤维标本

(三)、操作流程

1、脱蜡和水化:脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟

b 无水乙醇中浸泡五分钟

c 95%乙醇中浸泡五分钟

d 75%乙醇中浸泡五分钟

2、抗原修复:用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片:

抗 原 修 复(免疫组化石蜡切片)

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片需要抗原修复

福尔马林固定的组织有可能破坏了原来组织的抗原结构,蛋白多肽发生交联,导致部分抗原表位封闭,结合位点减少,所以需要抗原修复,以暴露原来的抗原表位,达到充分显露抗原,以不出现明显脱片现象为佳。

抗原修复的几种常用方法(供参考)

1. 微波炉加热:在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至沸腾后将组织芯片放入,断电,间隔5-10分钟,反复1-2次。根据玻片情况可参考采用微波加热“3-5-3法”3分钟温火沸腾后静止5分钟,再温火沸腾3分钟即可。

适用的抗原:来源于人、大鼠、小鼠的组织标本;来源于其他动物种属的组织标本:

2. 沸热修复: 电炉或水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液(pH6.0)至95℃左右,放入组织芯片加热10-15分钟。

3. 高压热修复:在沸水中加入EDTA(pH8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0).盖上不锈钢锅盖,但不能锁定。将玻片置于金属染色架上,缓慢加压,使玻片在缓冲液中浸泡五分钟,然后将盖子锁定,小阀门将会升起来。10分钟后除去热源,置入凉水中,当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。(骨及软骨组织的标本最好选择较温和的微波加热修复)

4. 酶消化方法:

常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃,消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原:

包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.c-erB-2.LCA.LN.等

石蜡切片免疫组化染色步骤

1.三步法(以SP试剂盒为例)

●石蜡切片脱蜡至水。

●蒸馏水冲洗,PBS浸泡5分钟,如果采用抗原修复,可在此步后进行。

●3%H2O2室温孵育5~10分钟,以消除内源性过氧化物酶的活性,PBS冲洗,2分钟×3次。 ●5~10%正常山羊血清封闭,室温孵育10分钟。倾去血清,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液,37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

●PBS冲洗,2分钟×3次。

●滴加适当比例稀释的生物素标记二抗(1%BSA-PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或滴加第二代生物素标记二抗工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。

●PBS冲洗,2分钟×3次。

●滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释),37℃孵育10~30分钟;或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液,37℃或室温孵育10~20分钟。

●PBS冲洗,2分钟×3次。

●显色剂显色(DAB或AEC)。

●自来水充分冲洗,复染,脱水透明、封片。

●如果必要,可选用avdin封闭内源性生物素。

2.SABC法

(1) 脱蜡、水化

(2)PBS洗2次各5分钟

(3)用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2,室温封闭5-10分钟,用蒸馏水洗3次

(4)抗原修复

(5) PBS洗5分钟

(6)滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体

(7)滴加Ι抗50ul,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时

(8)PBS洗3次各2分钟

(9)滴加生物素化Ⅱ抗,20℃-37℃ 20分钟

(10)PBS洗3次各2分钟

(11)滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟

(12) PBS洗4次各5分钟

(13) DAB显色:试剂盒或自配显色剂显色

(14)脱水、透明、封片、镜检。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

●速冻组织

●冰冻切片4~8μm,冰冻切片后如不染色,必须吹干,储存低温冰箱内,或进行短暂预固定后储存于-20℃冰箱。

●室温放置30分钟后,入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其他的固定方式。 ●PBS冲洗,5分钟×3次。

●用3%过氧化氢孵育5~10分钟,消除内源性过氧化物酶的活性。

●PBS冲洗,5分钟×3次。

●下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤(滴加一抗开始)。

第二节 免疫组化抗原热修复的技术要点(供参考)

1、 抗原热修复温度和时间的关系

我们日常工作中所使用的组织固定液福尔马林会引起组织蛋白内或蛋白之间的亚甲基发生桥连,具体过程如下:

第一步基本反应福尔马林和氢反应形成新的化合物

第二步基本反应福尔马林和氢反应形成新的亚甲基桥

上述反应的结果导致许多抗原决定簇被封闭,而加热可以水解该桥连使抗原被激活。影响抗原热修复的两个最关键的因素是温度和时间,有人将这两种因素对抗原修复的影响总结为下面的公式:

抗原热修复的有效性=加热温度(T) × 加热时间(t)

也就是说当我们修复时的温度越低则需要修复的时间就越长;反过来当修复温度增高时修复的时间可以适当地缩短,才能使抗原决定簇完全暴露,这种反比的关系从MBI单克隆抗体的实验结果表1中也可以清楚地看出。

时间和温度对染色的影响

时间(分钟)

100℃ 80℃ 60℃

5×2 + + + ― ―

5×6 + + + + + + + ―

5×10 ― + + + + +

10小时 ― ― + +

如果修复强度不够,免疫组织化学染色所显示的只能是修复后暴露的部分抗原决定簇,而不是组织所含的全部抗原。这样的染色结果可能会非常弱,或出现假阴性,即使是阳性结果,充其量只能起到定性的作用,不能适应今后对免疫组化进行定量的需要。这就给我们诊断中定量指标的应用带来困难,例如用来测定耐药的指标。

2、组织固定时间和所需的抗原热修复的关系

大量的实验表明,固定时间越长的标本,它所形成的桥连就越紧密,抗原就越难以被激活,所需要的修复强度也就越强。有意思的是随着固定时间的延长,组织中蛋白对温度的耐受也相应增高(如图1所示),这可能就是我们对固定时间长的标本加大修复强度的理论基础。

固定时间和变性的关系

这就提醒我们在做回顾性的研究时一定要注意所使用的修复条件,它与新鲜标本的修复条件一定是有所区别的,同等条件下一定要加长修复的时间或提高修复所使用的温度,才可能得到比较满意的结果。

3、 不同PH值抗原修复液对染色结果的影响

抗原热修复中所使用的修复液PH值也会对染色结果产生相当大的影响。PH值对染色结果的影响大概可以分为以下四种情况。

A―稳定型,PH值对染色结果影响不大,如PCNA、AE1、EMA、CD20等。

B―V型,高PH值和低PH值染色较好,而PH值4-5染色结果较差,如ER、Ki-67等。

C―上升型,随着PH值的增加,染色结果逐渐增强,如HMB45等。

D―下降型,随着PH值的增加染色结果逐渐减弱,当然这种类型的抗体只是个别的现象,如MOC31。 一个有趣的现象值得注意,即在高PH值都有较好的染色结果,所以目前比较推崇的抗原修复液为高PH值得修复液,如1mMEDTA, PH8.0或PH9.0等。但是由于传统习惯,绝大多数医院和实验室都在使用PH6.0的枸橼酸缓冲液。综合以上各种抗体的染色状况,考虑到临床工作的实际情况,许多国外免疫组化专家建议,在常规的免疫组化工作中,全部选用高PH值得修复液来代替目前广为使用的PH6.0枸橼酸缓冲液。为此,本公司已经推出PH8.0和PH9.0的新型抗原修复液。经验证,绝大多数的抗体使用PH9.0得修复液效果都要优于PH6.0的枸橼酸,尤其是核阳性的抗体。所以,在常规的免疫组化工作中,使用高PH值的抗原修复液是今后的必然趋势。

4、抗原热修复的手段

微波炉修复和高压锅修复的比较

温度 压力 v时间 受热

微波炉 100℃ 1P 15~20分钟 不均匀

高压锅 120℃ 1.2P 喷气2分钟 均匀

目前抗原热修复所采用的方法主要有微波炉修复和高压锅修复两种,从表中可以看出,由于高压锅修复具有温度均一、节省时间、效果稳定等特点,已经越来越受到人们的青睐。

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