青年科学基金项目申请书填报说明

青年科学基金项目是国家自然科学基金人才项目系列的重要类型，支持青年科学技术人员在国家自然科学基金资助范围内自主选题，开展基础研究工作，培养青年科学技术人员独立主持科研项目、进行创新研究的能力，激励青年科学技术人员的创新思维，培育基础研究后继人才。

一、申请条件

青年科学基金项目申请人应当具备以下条件：

（1）具有从事基础研究的经历；

（2）具有高级专业技术职务（职称）或者具有博士学位，或者有2名与其研究领域相同、具有高级专业技术职务（职称）的科学技术人员推荐；

（3）申请当年1月1日男性未满35周岁，女性未满40周岁。 符合上述条件、在职攻读博士研究生学位的人员，经过导师同意可以通过其受聘单位申请，但在职攻读硕士生学位的人员不得申请。作为负责人正在承担或者承担过青年科学基金项目的（包括资助期限1年的小额探索项目以及被终止或撤销的项目），不得再次申请。

二、注意事项

青年科学基金项目申请、评审和管理机制与面上项目基本相同，重点评价申请人本人的创新潜力。申请人应当按照青年科学基金项目申请书撰写提纲撰写申请书。青年科学基金项目的合作研究单位不得超过2个，资助期限为3年。

申请书中不得出现任何违反法律及有关保密规定的内容，依托单位须认真审核。由于违反相关规定而导致的一切后果由申请人和依托单位负责。

青年科学基金项目申请书撰写提纲

青年科学基金项目申请书由信息表格、报告正文和附件三部分构成。

一、信息表格

包括基本信息、项目组主要参与者和经费申请表。须按操作提示在指定的位置选择或按要求输入正确信息；经费申请表须按照《国家自然科学基金项目资助经费管理办法》认真填写，应保证信息真实、准确。

二、报告正文：参照以下提纲撰写，要求内容翔实、清晰，层次分明，标题突出。

1. 申请人简历

按以下格式填写：

姓名

所在单位及职称

格式：机构名，院系，职称

例如：北京大学，医学院生物化学系，教授

受教育经历（从大学本科开始，按时间倒排序）

格式：开始年月-结束年月，机构名，院系，学历

例如：1991/09 – 1995/06，北京大学，医学院生物化学系，博士

研究工作经历（按时间倒排序）

格式：开始年月-结束年月，大学，院系，职称

例如：1991/09 – 1995/06，北京大学，医学院生物化学系，教授

2. 立项依据与研究内容

（1）项目的立项依据。（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）

（2）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）

（3）拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）

（4）本项目的特色与创新之处。

（5）年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）

3. 研究基础与工作条件

（1） 工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）

（2）工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门开放实验室等研究基地的计划与落实情况）

（3）承担科研项目情况（申请人正在承担或参加科研项目的情况，包括自然科学基金的项目。要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）

（4）完成自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）

4. 研究成果

主要论著（近3年来已发表的与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况，按以下格式填写）

1、期刊论文： 所有作者（通讯作者以“*”标出），论文标题，期刊名称，卷(期), pp起始页码，发表年份

例：郑丹、中国癌症地图解析, 决策与信息， 第2卷，第3期, 120-125页，2010

2、会议论文：所有作者（通讯作者以“*”标出），论文标题，

会议名称，会议时间，pp起始页码，会议地址，发表年份，说明

例：郑丹, 中国癌症地图析, 决策与信息国际会议论文集, 120-125页，北京，2010.04.12-15，大会报告

3、专著：所有作者，专著名称（章节标题），出版社, 总字数，出版年份

例：郑丹， 中国癌症地图解析, 科技出版社. 128万字，2010

4、奖励：所有获奖人，获奖项目名称，奖励机构，奖励类别，奖励等级，颁奖年份

例：郑丹，中国癌症地图，国家科技部， 国家科技进步奖，二等奖，2010

5、专利：发明人，专利名称，授权时间，授权国别，专利号 例：郑丹. 中国癌症地图，2010.9，中国，ddddddddddddd

5. 经费申请说明

购置单项经费5万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。

6. 其他需要说明的问题

三、附件

1．提供5篇以内代表性论著首页扫描文件；

2．如曾获科技奖励，提供国家级科技奖励（国家自然科学奖、国家发明奖、国家科学技术进步奖）、省部级奖励（二等以上）和国际学术性奖励证书扫描文件；

3．如获专利或其他公认突出的创造性成果或成绩，应提供证明材料的扫描文件；

4．在国际学术会议上作大会报告、特邀报告，应提供邀请信或通知的扫描文件；

5．在职攻读研究生学位的申请人的导师同意函、在站博士后申请人的依托单位承诺函、中级以下职称申请人的推荐函的扫描文件。

特别提示：上述附件第5项还需提供纸质原件，随纸质《申请书》一同报送。

第二篇：青年科学基金—填报说明与撰写提纲

报告正文：

1. 立项依据与研究内容

（1）项目的立项依据。（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）

肿瘤是全球致死率最高的疾病之一。据统计，全球新肿瘤患者每10万人中就有173人，在中国每10万人中有110人。通过对肿瘤的发生、生长及转移机制的等方面的研究对于寻找可靠的治疗靶点并指导临床治疗是非常重要的。靶向于血管内皮细胞生长因子A（VEGFA）信号通路的抗血管生成药物，例如贝伐单抗（bevacizumab）、舒尼替尼（sunitinib, sutent）、索拉非尼（sorafenib）都是被美国食品药品管理局批准的，然而由于抗药性的问题导致在临床上效果不稳定[1,2]。而限制这些抗血管生成药物药效的主要原因是肿瘤细胞遗传的多样性。它会分泌过量的血管生成因子，招募造血细胞和炎症细胞便于肿瘤细胞的转移。可以理解的是这些治疗过程刺激了多个血管生成因子，炎症通路，使得在治疗过程中肿瘤的转移进程加快了。所以，找到更加合理的治疗靶点对抗肿瘤药物的设计显得非常关键而迫切。与之相比，Angiopoietin (Ang)-Tie系统对于肿瘤的治疗是一个好的选择，由于它不仅对于血管的生成、血管内平衡的维持是非常关键的，而且它与血管形成、炎症信号通路的关系密切[3]。

Angiopoitein-1(Ang1)/Tie2信号通路在调节血管成熟和维持血管稳态过程中起着非常关键的作用。人Ang-Tie系统由两个1型酪氨酸激酶受体（Tie1和Tie2）和三个分泌型的配体（Ang1，Ang2和Ang4）组成。Ang1是Tie2的功能配体[4]，Ang2在正常的条件下是Ang1的竞争抑制剂[5]。而在体外一些条件下，例如缺乏Ang1或是Ang2浓度很高的情况下，Ang2是可作为Tie2的配体的。Ang3是小鼠中与人中Ang4同源的因子。尽管一些相关报道显示Ang3与Ang4与血管的形成相关，但其在肿瘤发生中的具体功能仍需进一步的探索。Tie2主要表达在内皮细胞，通过与配体Ang结合发挥功能，而Tie1并没有已知的配体，已有报道显示它可与Tie2结合并调控其活性[6,7,8]。Ang1与Tie2结合后，Tie2二聚或多聚体化，并且其碳端的酪氨酸残基磷酸化。内皮细胞中激活的Tie2结合

或激活一些因子，包括下游的酪氨酸激酶相关蛋白（tyrosine kinase-related protein, DOKR）、内皮NO合成酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）、含SH2 domain相关的磷酸化酶（SH2 domain-containing phosphatase）、生长因子受体结合蛋白（growth factor receptor-bound protein 2, GRB2）2、PI3K的p85亚基（the p85 subunit of PI3K, PI3K）、血管内皮酪氨酸磷酸化蛋白酶（vascular endothelial protein tyrosine phosphatase, VEPTP）等。Ang1诱导Tie2激活内皮细胞生存的相互作用、维持内皮屏障和静脉系统稳定，同时它可以抑制炎症信号通路的启动。相反，Ang2被认为是Ang1的拮抗剂，它能增强血管的渗透性，破坏静脉系统，启动内皮细胞生长以促进血管生成[9]。（如图1）

图1 Ang-Tie信号通路示意图（按Huang, H et al.,修改 [9] ）

Ang2优先在那些需要血管增生的组织或部位的内皮细胞中高量表达。它通过竞争性与Tie2结合而抑制Ang1的信号，打破血管稳态、促进血管增生的作用，在肿瘤的发生和转移过程中是非常关键的[10,11]；Ang1在许多成熟个体组织的壁细胞、纤维原细胞、正常血管细胞中表达，为组织、血管的稳态发挥着重要的作用。而目前对于Ang1在肿瘤血管的形成和转移相关研究非常有限。有

意思的是，本研究小组前期研究显示，Ang1通过腺病毒载体在小鼠中的过量表达启动了植入的肿瘤向肺中的转移[12]。这说明Ang1在肿瘤转移过程中是起重要的作用。也有报道显示Ang1在诸如结肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌细胞中高量表达而Ang2则在癌细胞中表达量非常低[13,14,15]。那么，肿瘤细胞自身合成大量的Ang1在肿瘤血管的形成过程中扮演的角色仍不清楚。

肿瘤依靠血管和淋巴管进行转移，而血小板是血液中一种比较独特的存在形式，在肿瘤转移过程中起非常重要的作用。在正常情况下，血小板在血液中独立的游动和循环。当血管损坏后，一些内皮下的基质蛋白包括胶原，或是可溶的激动剂激活了血小板。其中一个最主要的血小板激动剂是凝血酶，它通过两个受体PAR3和PAR4来调控血小板的聚集和分离，进而达到对血管的坏损进行修复的目的[16]。有研究显示，在血小板中积累了大量的Ang1[17,18]，那么在凝血过程中血小板破裂，释放的Ang1除了修复血管破损之外，肿瘤在转移过程中Ang1-Tie2的信号是如何发挥作用的呢？

本研究项目将利用CRISPR/Cas9技术构建Ang1特异敲除的肿瘤细胞系分析肿瘤中高量合成的Ang1对肿瘤生长和转移发挥的作用；结合Tie2条件性敲除模型（Tie2Flox/Flox），血管内皮细胞特异性（Apelin-CreERT2）、淋巴管内皮细胞特异性（Prox-1-CreERT2）和巨核细胞特异性（PF4-Cre）表达重组酶的小鼠获得Tie2条件性敲除模型，探究诱导破坏小鼠血管、淋巴管以及血小板中Ang1-Tie2信号通路对肿瘤血管、淋巴管形成及肿瘤生长、转移的影响，研究结果将有助于我们阐明Ang1/Tie2信号通路在肿瘤在生长和转移过程中的作用机理，为研发理想抗肿瘤药物寻找新的作用靶点提供理论依据。

参考文献

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anti-angiogenic cancer therapy. Drug Resist Updat 13: 16-28.

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3. Herbst RS, Hong D, Chap L, Kurzrock R, Jackson E, et al. (2009) Safety, pharmacokinetics, and

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5. Maisonpierre PC, Suri C, Jones PF, Bartunkova S, Wiegand S, et al. (1997) Angiopoietin-2, a natural

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7. Imanishi Y, Hu B, Xiao G, Yao X, Cheng SY (2011) Angiopoietin-2, an angiogenic regulator,

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9. Huang H, Bhat A, Woodnutt G, Lappe R (2010) Targeting the ANGPT-TIE2 pathway in malignancy.

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17. Nadar SK, Blann A, Beevers DG, Lip GY (2005) Abnormal angiopoietins 1&2, angiopoietin

receptor Tie-2 and vascular endothelial growth factor levels in hypertension: relationship to target organ damage [a sub-study of the Anglo-Scandinavian Cardiac Outcomes Trial (ASCOT)]. J Intern Med 258: 336-343.

18. Lukasz A, Hellpap J, Horn R, Kielstein JT, David S, et al. (2008) Circulating angiopoietin-1 and

angiopoietin-2 in critically ill patients: development and clinical application of two new immunoassays. Crit Care 12: R94.

（2）项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）

2.1研究内容：

响

a) Ang1敲除肿瘤细胞系的构建：利用CRISPR/Cas9技术，获得敲除Ang1基因的人肺癌肿瘤细胞LNM35/LUC；结合测序、RT-PCR和Western blot分别在基因组、mRNA水平和蛋白水平分析靶基因的敲除情况；分析细胞的生长状态、分裂速度等指标，评估Ang1的敲除对于细胞的生长、凋亡有无影响；

b) 分析Ang1敲除的肿瘤生长情况：将正常的肿瘤细胞与Ang1敲除的肿瘤细胞同时接种到正常小鼠中，测量不同时间的肿瘤体积和重量，制作肿瘤生长曲线；

c) 分析Ang1敲除的肿瘤在小鼠体内的转移：用两种接种方法，实验性转移和自发性转移，分析转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率；通过小动物发光活体成像技术，观察肿瘤的转移方式及转移速度（是通过血液系统还是淋巴转移）；

a) 血管内皮细胞敲除Tie2小鼠模型构建：通过LoxP-Cre重组酶系统进行条件性基因打靶，构建在血管内皮细胞中特异敲除Tie2（阻断Ang1-Tie2信号）的转基因敲除小鼠模型（Apelin-Cre ERT2; Tie2Flox/-）；利用他莫昔酚诱导敲除，然后利用PCR、Western blotting的方法分析敲除的效率； b) 接种肿瘤细胞：用他莫昔酚诱导敲除后接种原瘤，测量不同时间的肿瘤体积和重量，制作肿瘤生长曲线；分析转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率；通过小动物发光活体成像技术，观察肿瘤的转移速度及转移方式；

a) 淋巴细胞特异的Tie2敲除小鼠构建：通过LoxP-Cre ERT2重组酶系统进行条件性基因打靶，构建在淋巴管内皮细胞中特异敲除Tie2以阻断Ang1-Tie2信号的转基因敲除小鼠模型(Prox-1-Cre ERT2; Tie2Flox/-)；利用他

莫昔酚诱导敲除，然后利用免疫组化的方法分析小鼠视网膜、皮肤等组织淋巴管的形成；

b) 接种肿瘤细胞：利用他莫昔酚诱导敲除后接种原瘤，测量不同时间的肿瘤体积和重量，制作肿瘤生长曲线；原位肿瘤切除后，观察转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率；通过小动物发光活体成像技术，观察肿瘤的转移方式（是通过血液系统还是淋巴转移）；

a) 通过LoxP-Cre重组酶系统进行条件性基因打靶，构建巨核细胞特异敲除Tie2以阻断Ang1-Tie2信号的转基因敲除小鼠模型(PF4-Cre; Tie2Flox/-)；利用他莫昔酚诱导敲除，然后统计敲除组与正常组血小板的数量，用电镜观察血小板的形态；

b) 利用他莫昔酚诱导敲除后接种原瘤，测量不同时间的肿瘤体积和重量，制作肿瘤生长曲线；原位肿瘤切除后，观察转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率；通过小动物发光活体成像技术，观察肿瘤的转移速度和转移方式；

2.2研究目标：

1、分析肿瘤细胞自身表达大量的Ang1在肿瘤的生长和转移过程所起作用；

2、研究小鼠血管、淋巴管敲除Tie2对肿瘤的生长和转移的影响；

3、探究小鼠血小板敲除Tie2对血小板的生理状态、血小板生存以及肿瘤的

生长、转移是否起着特殊的作用；

2.3拟解决的关键问题：

本研究拟利用敲除Ang1的肿瘤模型与Cre重组酶介导的Tie2条件性基因敲除小鼠模型，分析Ang1/Tie2信号通路在肿瘤血管、淋巴管形成以及其对肿瘤生长和转移的作用机理。

（3）拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）

3.1研究方法、实验手段和关键技术

为了便于后续筛选，选择改造的可表达荧光素酶基因的人肺癌细胞系LNM35/LUC（本实验室保存）进行实验；利用CRISPR/Cas9技术，设计特异识别Ang1的guide RNA及转染载体，转染LNM35/LUC肿瘤细胞；

阳性细胞的筛选方法：在荧光显微镜下将转染成功的发荧光的细胞挑出，结合筛选抗生素G418进行多代培养和筛选，得到较纯的细胞系。然后利用测序的方法验证敲除的位点和效率；

血管内皮细胞特异的Tie2敲除小鼠模型构建：将已有的转基因小鼠Tie2+/-; Apelin-CreERT2小鼠与Tie2Flox/Flox交配，产生Apelin-Cre ERT2; Tie2Flox/-（用于实验组）与Apelin-CreERT2; Tie2Flox/+（用于对照组）两种小鼠；利用他莫昔酚诱导敲除，用定量PCR等方法分析敲除效率。然后利用免疫组化的方法分析小鼠视网膜、皮肤等组织血管的形成；

淋巴管内皮细胞特异的Tie2敲除小鼠模型构建：将已有的转基因小鼠Tie2+/-：Prox-1-Cre ERT2小鼠与Tie2Flox/Flox交配，产生Prox-1-Cre ERT2; Tie2Flox/-（用于实验组）与Prox-1-Cre ERT2; Tie2Flox/+（用于对照组）两种小鼠；利用他莫昔酚诱导敲除，然后利用免疫组化的方法分析淋巴管的形成；

巨核细胞敲除Tie2小鼠模型构建：将已有的转基因小鼠Tie2+/-：PF4-Cre ERT2小鼠与Tie2Flox/Flox交配，产生PF4-Cre; Tie2Flox/-（用于实验组）与PF4-Cre; Tie2Flox/+（用于对照组）两种小鼠，然后统计敲除组与正常组血小板的数量，用电镜观察血小板的形态；

3、肿瘤的接种与分析：

小鼠的选择：人肺癌肿瘤LNM35/Luc选择裸鼠接种，鼠源路易斯肺癌LLC/Luc选择基因敲除的黑鼠接种；

肿瘤通过两种接种方法：一种是分析实验性转移，将肿瘤细胞注入血管，观察和分析肿瘤通过血管的转移；另一种是分析自发性转移，通过腋下注射一定量的肿瘤细胞，待其形成固体肿瘤块后切除原瘤，观察转移后肿瘤的体积、重量、坏死情况以及小鼠存活率 。通过小动物活体成像技术，观察肿瘤的转移方式；

4、肿瘤血管、淋巴管的形成分析：

利用免疫组化的方法对肿瘤及相关的小鼠器官进行组织学分析，共聚焦显微镜观察实验结果；

3.2技术路线（如下图所示）

3.3可行性分析

研究证明在Ang1-Tie2信号通路中Ang1是作为血管、淋巴管结构稳定，内环境稳态的关键因子。而Ang2通过对Ang1的竞争性抑制，促进血管的新生及肿瘤的转移。但是20xx年本团队研究发现，Ang1在小鼠体内的过量表达会促进肿瘤血管的形成、肿瘤生长和转移。本课题组前期研究发现，血管内皮细胞特异敲除Tie2阻断Ang1-Tie2后，影响了肿瘤的转移。这都说明Ang1-Tie2信号通路对于肿瘤的转移是非常关键的。

有意思的是哺乳动物血小板中储存大量的Ang1，另外在肿瘤细胞中有高量的Ang1表达而Ang2几乎不表达，但这些事实并未被研究者重视。这暗示Ang1-Tie2信号通路在肿瘤刺激时，通过多方面的作用为肿瘤的转移营造条件的观点，理论上是可行的。

研究项目中所涉及的利用Cre重组技术的条件性基因敲除小鼠的构建，以及各种分析小鼠组织病变的技术均属本课题组擅长的实验技术；课题组已针对血管内皮细胞敲除Tie2的转基因小鼠进行了莫他昔酚诱导条件的摸索以及肿瘤移植后的分析，这为本研究奠定了坚实基础。

课题的难点在于，利用CRISPR／Cas9构建稳定敲除Ang1的肿瘤模型。本室已构建好了带荧光素酶Luc标记的肿瘤细胞系为进一步的研究提供了很好的材料。CRISPR／Cas9技术是最近几年兴起的基因敲除技术，具有高效、便捷的特点，然而本团队在此方面的经验不足。申请者之前学习所在的西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室有专门的团队进行相关研究，所以希望通过合作，为课题的顺利完成提供理论和技术的指导。

因此，总体来说本项目具有实施层面的良好技术可行性。

申请者所在单位依靠苏州大学唐仲英血液学研究中心的有力支撑，拥有完成本项目的所有大型仪器和设备，如激光共聚焦显微镜、小动物体视显微镜、免疫组化需要的切片机、用于基因转录水平检测的实时定量PCR仪等；本中心有完善的分子生物学实验平台、细胞生物学平台、组织学实验平台以开展常规的实验；实验室拥有转基因显微注射平台，可以自行制备转基因敲除小鼠； 苏州大学医学部拥有大规模的SPF级动物房，可以饲养和保存实验需要的动物。

本项目所需的试剂与耗材均可通过商业渠道购买。课题所需要的培养基及实验相关试剂均能从国内外试剂公司购买。申请者所在本研究中所需的最关键的转基因条件敲除小鼠在前期的研究中均以获得。另外，本实验室保存了丰富的肿瘤细胞系，便于进行基因编辑实验开展。

（4）本项目的特色与创新之处。

本课题以团队的前期研究工作为基础，探讨Ang1-Tie2信号通路对肿瘤的转移机制，具有以下特色及创新之处在于：

a) 本课题提出假设，Ang1在肿瘤的转移过程中一方面通过自身高量的表达Ang1促进自身血管系统的稳定，为向其他组织转移做好保障；

b) 另一方面在机体内血管和淋巴管是肿瘤转移的两个关键途径，血管和淋巴管Ang1-Tie2信号通路的破坏为肿瘤的转移提供了突破口；

c) 同时，血小板中储存较高量的Ang1对于血小板在体内的存活、生理作用以及肿瘤的转移起非常重要的作用。

这一假设提出并验证将对Ang1-Tie2信号通路在调节肿瘤生长和转移过程发挥的作用有更深入而全面的理解。

（5）年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）

5.1年度研究计划

2015．3-2015．12

a) 制备血管内皮细胞、淋巴细胞和巨核细胞诱导敲除Tie2基因的小鼠模型；

b) 分析血管内皮细胞、淋巴细胞特异诱导敲除Tie2基因的小鼠表型； c) 分析血管内皮细胞、淋巴细胞特异诱导敲除Tie2基因的小鼠对肿瘤生长和转移的影响；

2016．1-2016．12

a) 分析巨核细胞特异诱导敲除Tie2基因的小鼠血小板的结构、数量、功能的影响；

b) 分析巨核细胞特异诱导敲除Tie2基因的小鼠对肿瘤生长和转移的影响； c) 利用CRISPR/Cas9系统构建Ang1基因敲除的肿瘤细胞；

2017．1-2017．12

a) 分析Ang1缺失的肿瘤细胞在被植入小鼠中形成肿瘤块，及肿瘤的转移的影响；

b) 项目总结与论文撰写，完成数据整理、论论撰写与发表，查漏补充实验，并完成结题报告，拓展后续实验研究。

5.2预期研究结果

发表高质量论文2—3篇。

2. 研究基础与工作条件

（1）工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）

目前取得与本项目直接相关的初步的研究进展如下：

a） 本团队已获得供课题顺利开展的各种Tie2条件性敲除小鼠模型：Tie2 Flox/Flox、Tie2+/-、Apelin-CreERT2、 Prox-1-Cre ERT2、PF4-Cre;

b） 成功构建了血管内皮细胞敲除Tie2的小鼠模型，并将其利用于肿瘤分析：将转基因小鼠Tie2+/-; Apelin-CreERT2小鼠与Tie2Flox/Flox交配，产生Apelin-Cre ERT2; Tie2Flox/-（用于实验组）与Apelin-CreERT2; Tie2Flox/+（用于对照组）小鼠；他莫昔酚诱导敲除后，分析肿瘤血管内皮细胞中Tie2的表达：结果如图2所示，实验组肿瘤血管内皮细胞中Tie2的信号与对照相比明显减弱。这说明该模型构建成功，并可以用于分析肿瘤的血管生成的。后续的淋巴管内皮细胞敲除Tie2小鼠模型以及巨核细胞敲除的小鼠模型在此基础上进行，这为本课题的顺利开展奠定了基础；

图2. 血管内皮细胞敲除Tie2小鼠模型建立

（2）工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门开放实验室等研究基地的计划与落实情况）

本项目的研究工作将在苏州大学唐仲英血液学研究中心完成。该中心是美国唐仲英基金会捐资，江苏省政府和苏州大学联合出资共同兴建的，以江苏省血液研究所为基础，以卫生部血栓与止血重点实验室和血液和血管疾病诊疗技术教育部工程研究中心为依托，以为临床诊疗服务为宗旨的科研创新平台。平

台拥有激光共聚焦显微镜、小动物呼吸系统、高分辨率小动物超声系统、小动物活体成像系统等大型仪器，并拥有常规的正置、倒置荧光显微镜、冰冻、石蜡切片机、细胞培养间等等。另外，苏州大学医学部拥有规范化管理的SPF级动物房，可饲养常规的实验小鼠和转基因小鼠。本课题平台负责人掌握了完善的转基因小鼠、基因敲除技术。平台研究生已熟练掌握常见的组织学技术、细胞学实验及分子生物学实验技术。

申请人在家蚕基因组生物学国家重点实验室的6年硕、博士学生生涯中，熟练掌握专业知识和分子克隆、细胞水平实验技术。该研究所拥有良好的研究设备和学术环境, 能够从事分子/细胞生物学、生物化学和遗传学等多领域的研究工作，并与本团队有良好的合作关系，为保证本课题的顺利完成提供技术后备支持。

（3）承担科研项目情况（申请人正在承担或参加科研项目的情况，包括国家自然科学基金的项目。要注明项目的名称和编号、经费来源、起止年月、与本项目的关系及负责的内容等）

a) 国家重点基础研究发展计划“973”项目 参与者

项目名称: 家蚕关键品质性状分子解析及分子育种基础研究

项目编号：No. 2012CB114600

经费来源：国家拨款

起止年月：2012.1-2016.12

负责内容：发现在家蚕中，卵黄原蛋白在卵形成，胚胎发育过程中是必不可少的营养物质。

b) 国家高技术研究发展计划“863”项目 参与者

项目名称：家蚕分子育种技术创新与高产优质抗病新品系培育

项目编号：No. 2011AA100306

经费来源：国家拨款

起止年月：2011.1-2015.12

负责内容：筛选了一个在家蚕蛹期特异高量表达的启动子（卵黄原蛋白启动子），并探索利用该启动子构建可以在家蚕蛹期特异致死的“家蚕永久蛹”转基因品种。

c) 国家自然科学基金 主要参与者

项目名称：家蚕卵黄原蛋白的合成及转运机制

项目编号：No. 201410032096.X

经费来源：国家拨款

起止年月：2011.1-2015.12

负责内容：主要从卵黄原蛋白基因的性质、基因的转录和蛋白合成的规律、激素对该基因的组织、时期特异性的转录调控机理等多角度研究。

（4）完成国家自然科学基金项目情况（对申请人负责的前一个已结题科学基金项目（项目名称及批准号）完成情况、后续研究进展及与本申请项目的关系加以详细说明。另附该已结题项目研究工作总结摘要（限500字）和相关成果的详细目录）

无

3. 资金预算说明

购置单项经费5万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。

4. 其他需要说明的问题

四、 研究成果

主要论著（近5年来已发表的与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况，按以下格式填写）

（1）期刊论文：①发表学术论文情况要求列出全部作者姓名（按照论文发表时作者顺序）、论文题目、期刊名称、发表年代、卷期以及起止页码（摘要论文请加以说明）。②共同第一作者均加注“#”字样，通讯作者及共同通讯作者均加注“*”字样。③投稿阶段的论文不要列出。

例1：郑丹，中国癌症地图解析，决策与信息，2010,2（3）：120-125。

（#）（#）例2：Diane D. Shao, Wen Xue, Elsa B. Krall, Arjun Bhutkar,

Federica Piccioni, Xiaoxing Wang, Anna C. Schinzel, Sabina Sood, Joseph Rosenbluh, Jong W. Kim, Yaara Zwang, Thomas M. Roberts, David E. Root, Tyler Jacks（*） ，and William C. Hahn（*），KRAS and YAP1 Converge to Regulate EMT and Tumor Survival, Cell, 2014, 158(3): 171-184。

五、附件（逐项上传）

1．代表性论著扫描文件。