哈尔滨工业大学

本科生毕业设计（论文）书写范例

说明：

规范中所引用的示例，只作为论文书写格式的示范，并不代表论文研究内容的示范。

毕业设计（论文）

题 目

专 业 学 号 学 生 指 导 教 师 答 辩 日 期

哈尔滨工业大学本科毕业设计（论文）

摘 要

摘要是论文内容的高度概括，应具有独立性和自含性，即不阅读论文的全文，就能获得必要的信息。摘要应包括本论文的目的、主要研究内容、研究方法、创造性成果及其理论与实际意义。摘要中不宜使用公式、化学结构式、图表和非公知公用的符号与术语，不标注引用文献编号，同时避免将摘要写成目录式的内容介绍。

关键词：关键词1；关键词2；……；

关键词6

（内容及关键词用小4号字）

I

哈尔滨工业大学本科毕业设计（论文）

Abstract

Externally pressurized gas bearing has been widely used in the field of aviation, semiconductor, weave, and measurement apparatus because of its advantage of high accuracy, little friction, low heat distortion, long life-span, and no pollution. In this thesis, based on the domestic and overseas researching……

Keywords: keyword 1, keyword 2, keyword 3, ……, ……,

keyword 6

英文摘要与中文摘要的内容应一致，在语法、用词上应准确无误。关键词间用逗号相连。

（内容及关键词用Times New Roman 小4号字）

II

哈尔滨工业大学本科毕业设计（论文）

目 录

摘要 ………………………………………………………………………………..Ⅰ Abstract …………………………………………………………………………….Ⅱ

第1章 绪论

1.1 课题背景及研究的目的和意义……………………………………………….1

1.2 气体润滑轴承及其相关理论的发展概况…………………………………….1

1.2.1 气体润滑轴承的发展…………………………………..............................1

1.2.2 气体润滑轴承的分类……………………………………………………..1 …….

1.2.5 多孔质气体静压轴承的研究 …………………………………… …….3 .......

1.4 本文的主要研究内容………………………………………………………….3

第4章 基于FLUENT软件的轴承静态特性研究

4.1 引言…………………………………………………………………………….4 .......

4.3.2 边界条件的设定…………………………………………………………..4

4.3.3 FLUENT仿真结果分析…………………………………………………...4

4.4 本章小结……………………………………………………………………….4

第6章 局部多孔质静压轴承的试验研究

6.1 引言…………………………………………………………………………….5

6.2 多孔质石墨渗透率测试试验………………………………………………….5 .......

6.5 本章小结……………………………………………………………………….6 结论………………………………………………………………………………..…7 参考文献………………………………………………………………………….…8 致谢………………………………………………………………………………….. 9 III

第1章 绪 论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

发展国防工业、微电子工业等尖端技术需要精密和超精密的仪器设备，精密仪器设备要求高速、……

……

1.2 气体润滑轴承及其相关理论的发展概况

气体轴承是利用气膜支撑负荷或减少摩擦的机械构件。……

……

1.2.1 气体润滑轴承的发展

1828年，R.R.Willis[3]发表了一篇关于小孔节流平板中压力分布的文章，这是有记载的研究气体润滑的最早文献。……

根据间隙内气膜压力的产生原理，气体轴承可以分为四种基本形式：

1. 气体静压轴承 加压气体经过节流器进入间隙，在间隙内产生压力气 膜使物体浮起的气体轴承，结构如图1-1 a)所示。当……

1.2.2 气体润滑轴承的分类

根据间隙内气膜压力的产生原理，气体轴承可以分为四种基本形式，其结构如图1-1所示。

1. 气体静压轴承 加压气体经过节流器进入间隙，在间隙内产生压力气 膜使物体浮起的气体轴承，结构如图1-1 a)所示。……

……

- 1 -

a)

c)

b)

d)

图1-1 气体润滑轴承的分类

b) 气体动压轴承

d) 气体压膜轴承

a) 气体静压轴承 c) 气体动静压轴承

（也可以按照下图范例书写）

a) 气体静压轴承

b) 气体动压轴承

c) 气体动静压轴承

d) 气体压膜轴承

图 1-1

气体润滑轴承的分类

- 2 -

1.2.5 多孔质气体静压轴承的研究

由于气体的压力低和可压缩性，……。

1.2.5.1 多孔质静压轴承的分类

轴承工作面的整体或……。

1.2.5.2 多孔质材料特性的研究

材料的主要特点是具有一定的……。

（1）孔隙特性 多孔质材料是由……。

……

1.4 本文的主要研究内容

本课题的研究内容主要是针对局部多孔质止推轴承的多孔质材料的渗透 率、静压轴承的静态特性、稳定性及其影响因素进行展开， ……。

- 3 -

第4章 基于FLUENT软件的轴承静态特性研究

4.1 引言

利用现成的商用软件来研究流场，可以免去对N-S方程求解程序的…… ……

4.2.3 边界条件的设定

本文采用……，则每一个方向上的……由公式(4-1)、（4-2）求得：

2Dp?3

?? (4-1) 1501??2

C2?3.5?1??? (4-2) Dp?3

式中 Dp——多孔质材料的平均粒子直径（m）；

?——孔隙度（孔隙体积占总体积的百分比）；

?——特征渗透性或固有渗透性（m2）。

……

4.4 本章小结

……

- 4 -

第6章 局部多孔质静压轴承的试验研究

6.1 引言

在前面几章中，分别对局部多孔质材料的渗透率……

6.2 多孔质石墨渗透率测试试验

……

1号试样的试验数据见表6-1。

表6-1 1号试件渗透率测试数据(温度：T=16℃ 高度：H=5.31mm)

供气压力 Ps (MPa) 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45

流量测量 M′(m3/h) 0.009 0.021 0.039 0.097 0.136 0.171 0.202

流量修正值M (m3/s) ×10-4 0.02312 0.04584 0.07413 0.16747 0.21753 0.25485 0.28467

压力差 ΔP (Pa) 46900 96900 146900 196900 246900 296900 346900

lgΔP 4.67117 4.98632 5.16702 5.29424 5.39252 5.47261 5.54020

lgM -5.63601 -5.33876 -5.13001 -4.77606 -4.66248 -4.59372 --

- 5 -

……如果表格超过一页时，可采用续表的形式移入下一页：

表6-1试件渗透率测试数据

供气压力 Ps (MPa) 0.15 0.2 0.25 0.3

流量测量 M′(m3/h) 0.009 0.021 0.039 0.097

流量修正值M (m3/s) ×10-4 0.02312 0.04584 0.07413

0.16747

压力差 ΔP (Pa) 46900 96900 146900 196900

lgΔP 4.67117 4.98632 5.16702

5.29424

lgM -5.63601 -5.33876 -5.13001

-4.77606

表6-1（续表）

供气压力 Ps (MPa) 0.35 0.4 0.45

流量测量 M′(m3/h) 0.136 0.171 0.202

流量修正值M (m3/s) ×10-4 0.21753 0.25485 0.28467

压力差 ΔP (Pa) 246900 296900 346900

lgΔP 5.39252 5.47261 5.54020

lgM -4.66248 -4.59372 --

6.5 本章小结

……

- 6 -

结 论

学位论文的结论作为论文正文的最后一章单独排写，但不加章标题序号。 结论是对整个论文主要成果的总结。在结论中应明确指出本研究内容的创新性成果或创新点（含新见解、新观点），并指出今后进一步在本研究方向进行研究工作的展望与设想，上述各项用（1）.（2）.??????表述，不要将结论写成论文的摘要。结论字数一般在2000字以内。

- 7 -

参考文献

[1] 林来兴. 空间控制技术[M]. 北京：中国宇航出版社，1992：25-42.

[2] 辛希孟. 信息技术与信息服务国际研讨会论文集：A集[C]. 北京：中国科学

出版社，1999.

[3] 赵耀东. 新时代的工业工程师[M/OL]. 台北：天下文化出版社，1998

[1998-09-26]. http://www.ie.nthu.edu.tw/info/ie.newie.htm（Big5）.

[4] 谌颖. 空间交会控制理论与方法研究[D]. 哈尔滨：哈尔滨工业大学，1992：

8-13.

[5] KANAMORI H. Shaking Without Quaking[J]. Science，1998，279（5359）：

2063-2064.

[6] CHRISTINE M. Plant Physiology: Plant Biology in the Genome Era[J/OL].

Science，1998，281：331-332[1998-09-23]. /cgi/ collection/anatmorp.

……

- 8 -

致 谢

衷心感谢导师×××教授对本人的精心指导。……，他的言传身教将使我终生受益。

感谢×××教授，以及实验室全体老师和同窗们的热情帮助和支持！ 本课题承蒙××××基金资助，特此致谢。

…

- 9 -

第二篇：优秀本科生毕业论文示例

本科生毕业论文（设计）

题 目 肾移植患者普乐可复血药浓度与多药耐药基因

学生姓名 罗佳（Ud0101225）

指导教师 聂新民

学 院 湘雅医学院医学检验系

专业班级 医学检验系2001级01班

完成时间 20xx年6月

中南大学

本科生毕业论文

题 目：肾移植患者他克莫司血药浓度与多药耐药基因

C3435T多态性的关系

学生姓名：罗佳

指导老师：聂新民（副教授）

学 院：湘雅医学院医学检验系

专 业：医学检验专业2001级

实习单位：中南大学湘雅附三医院检验科

完成时间：20xx年6月

本毕业论文受如下课题资助：

湖南省科技厅科技计划重大项目（03GZ3072）

中国博士后科学基金(2004035206)

国家自然科学基金（30300383）

MDR1

中南大学

本科生毕业论文（设计）任务书及成绩评定表

题 目 肾移植患者他克莫司血药浓度与多药耐药基因 学生姓名 _ 罗佳（Ud0101225） ___ 指导教师 __ 聂新民 _____ 学 院___ 湘雅医学院医学检验系 专业班级___ _ 医学检验系2001级01班 __ _____

教务处制

中 南 大 学 毕业论文（设计）任务书

毕业论文（设计）题目：肾移植病人他克莫司血药浓度和多药耐药基因MDR1 C3435T多态性的关系 题目类型[1] 题目来源[2] 毕业论文（设计）时间从 20xx年5月8号 至 20xx年5月_ 毕业论文（设计）内容要求： 本研究是湖南省科技厅科技计划重大项目；中国博士后科学基金；国家自然科学基金。其具体任务和目标是探讨和研究肾移植病人他克莫司（Tacrolimus）血药浓度与多药耐药基因MDRI C345T 多态性的关系。以便于根据MDRI基因不同基因型药物代谢的特点，有针对性的调整临床应用的剂量，将有利于器官移植病人的个体用药，目前，在多药耐药基因MDRI上已发现一些单核苷酸多态性（SNPs）其中一部分可以影响P-糖蛋白的表达和功能，从而影响其药物在人体内血药浓度。到目前为止，研究表明在MDR1第26外显子的3435位点上发生的隐性突变是引起P-糖蛋白在人类组织中表达的多态性的主要原因。

本研究旨在探讨他克莫司（Tacrolimus）血药浓度/剂量比个体差异与多药耐药基因MDR1 C3435T多态性的关系。本研究观察66例口服他克莫司（Tacrolimus）的肾移植病人体重、他克莫司（Tacrolimus）剂量及血药浓度，并利用PCR-限制性片段长度多态性的方法检测患者多药耐药基因MDR1 3435位C/T多态性，分析药物浓度/剂量比与基因型的关系。 分析病人连续的药理学参数变化时，基因型被认为无条件独立参数，采用非参数统计法分析病人服用他克莫司（Tacrolimus）的日剂量和血药浓度，两组之间比较使用Mann-Whitney U检验，P<0.05被认为有统计学意义，最后的论文成稿应在8000字左右，另有一篇3000字左右的文献综述和一篇3000单词以上的译文（与论文相关）。

[1]题目类型：⑴理论研究⑵实验研究⑶工程设计⑷工程技术研究⑸软件开发

[2]题目来源：(1)教师科研题(2)生产实际题(3)模拟或虚构题(4)学生自选题

2.主要参考资料

[1] Simpson D,Noble S.Tacrolimus ointment a review of its use in atopic dermatitis and its clinical potential in other inflammatory skin conditions[J]. Drugs, 2005, 65(6): 827-58. [2] MacPhee IAM , Fredericks S, Tai T. Tacrolimus pharmacogenetics: polymorphisms associated with expression of cytochrome P4503A5 and P-glycoprotein correlate with dose requirement[J]. Trans-plantation, 2002,74(11): 1486-89.

[3] Neylan JF. Racial Differences in renal transplantation after immunosuppression with

tacrolimus versus cyclosporine[J]. Transplantation, 1998,65(4): 515-23.

[4] Frank M, Denton M, Alexander S, et al. Briscoe D: Specific MDR1 P-glycoprotein blockade inhibits human alloimmune T cell activation in vitro[J]. J Immunol, 2001,166(4): 2451-59.

[5] Hoffmeyer S, Burk O, von Richter O. Functional polymorphisms of the human multidrug-resistance gene: multiple sequence variations and correlation of one allele with P-glycoprotein expression and activity in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97(7): 3473-78. [6] Schaeffeler E, Eichelbaum M, Brinkmann U. Frequency of C3435T polymorphism of MDR1 gene in African people[J]. Lancet, 2001,358(9279):383-84. [7] Putnam WS, Woo JM, Huang Y. Effect of the MDR1 C3435T Variant and P-Glycoprotein Induction on Dicloxacillin Pharmacokinetics[J]. J Clin Pharmacol,2005 ,45(4):411-21.

[8] Cascorbi I, Gerloff T, Johne A. Frequency of single nucleotide polymorphisms in the P-glycoprotein drug transporter MDR1 gene in white subjects[J]. Clin Pharmacol Ther, 2001,69(3): 169-74.

3.毕业论文（设计）进度安排

指导教师（签名）___________________ 时间： ______________ 教研室(所)主任(签名) ______________ 时间： ______________ 主管院长（签名）___________________ 时间： ______________

中 南 大 学 毕业论文（设计）成绩评定表（一）

指导教师评语

罗佳同学在湘雅三医院检验科进行毕业实习及毕业论文工作的过程中，能积极参加科室的日常工作及科研活动，工作认真负责，组织纪律性强，实验思路清晰，学习认真刻苦，具有较强的独立工作能力，善于分析和解决问题，能熟练地应用计算机，具有一定的写作能力与综述能力。

罗佳同学毕业论文题目来源于中国博士后科学基金项目，采用分子生物学方法PCR-RFLP检测患者多药耐药基因MDR1 C3435T多态性，分析药物浓度/剂量比与基因型的关系。研究表明MDR1第26位外显子3435位点上的隐性突变是造成血药浓度差异的分子差异原因。该课题选题新颖，具有一定的理论及临床应用价值。科研设计合理，方法先进，所得结果可靠，结论及分析客观可信。罗佳同学毕业论文写作书写规范，格式正确，图表清晰，语句流畅，是一篇优秀的学士学位论文，建议进行本科生毕业论文答辩。

建议成绩：优秀 指导教师

______年___月___日

中 南 大 学 毕业论文（设计）成绩评定表（二）

论文（设计）评阅人评语

该论文选题源于指导老师博士后科学基金，是湖南省科技厅计划重大项目，具有科学性和实用意义。

他克莫司是一种治疗窗狭窄，个体之间效果差异非常大的常见免疫抑制剂。该同学用指导老师提取DNA的标本，抓住不同个体间药物反应和浓度/剂量关系存在的差异，采用PCR-RFLP方法检测C3435T（第26外显子）单核甘酸多态性及其与他克莫司血药浓度/剂量比的关系。结果显示：是有助于选择制定安全有效的用药剂量和药物的最优化治疗的。

该生论文选题新颖、实用，实验设计合理，方法成熟正确，实验数据可信。该生论文写作符合论文书写基本要求，是一篇优秀的本科生毕业论文。

论文（设计） 建议成绩：_优秀__ 评阅人_____________ ______年___月___日

中 南 大 学 毕业论文（设计）成绩评定表（三）

答辩记录及意见

问题：除了论文中提到的MDR1基因，是否还看到过别的有关这方面报道的基因？ 回答：参考文献中提到另一个基因CYP3A5，它也是编码P-糖蛋白的一个基因，国外的这个研究显示了它的多态性是影响Tacrolimus代谢个体差异性的主要原因。但他们的研究人群仅为高加索人种，且在他们的研究中未发现MDR1在高加索人种中对Tacrolimus代谢产生影响。

答辩意见：该同学论文选题新颖，研究方法先进，实验数据可信，统计方法正确，分析讨论全面。该同学答辩流利，回答问题正确，思路清晰。经答辩委员会表决，一致通过答辩，建议授予学士学位。

答辩成绩：___优秀____ 答辩委员会（小组）负责人___________ ______年___月___日 学院领导小组审查意见：

成绩评定：___________ 负责人：___________

______年___月___日

目 录

中文摘要??????????????????????????????1 ABSTRACT??????????????????????????????2 缩略词???????????????????????????????3

一 前言?????????????????????????????? 4

二 材料和方法???????????????????????????6

2．1 材料???????????????????????????6

2．2 方法???????????????????????????6

2．2．1 血标本基因DNA提取????????????????????6

2．2．2 多态性鉴定?????????????????????????6

2．2．3．血药浓度测定???????????????????????7

2．2．4 统计学分析????????????????????????7 三 结果??????????????????????????????8

3．1 基因型鉴定????????????????????????8

3. 2基因型与他克莫司血药浓度/剂量比的关系?????????????8

四 讨论 ?????????????????????????????10

五 结束语?????????????????????????????12

六 参考文献????????????????????????????13 论文英文版………………………………………………………………15 综 述???????????????????????????????22

肾移植患者他克莫司血药浓度与多药耐药基因MDR1 C3435T

多态性的关系

中文摘要

目的：他克莫司是一种治疗窗狭窄，个体之间治疗效果差异非常大的常见免疫抑制剂。本试验试图探讨肾移植患者他克莫司血药浓度与MDR1基因C3435T多态性的关系。

方法：本研究观察了66例口服他克莫司的肾移植患者的体重、他克莫司剂量及血药浓度，并利用PCR—限制性片断长度多态性的方法检测患者MDR1基因3435位C/T多态性，分析浓度/剂量比与基因型的关系。

结果：发现MDR1基因C3435T多态性与他克莫司血药浓度之间具有相关性，CC型的患者血药浓度低于携带T等位基因的个体（CC或TT型），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

结论：根据MDR1基因不同基因型药物代谢的特点，有针对性的调整剂量，将有利于器官移植患者个体化用药治疗。

关键词：他克莫司，多药耐药基因，基因多态性

Tacrolimus Dosing in Chinese Renal Transplant patients

Is Related to MDR1 Gene C3435T polymorphisms

ABSTRACT

Objective Tacrolimus is an immunosuppressive drug with narrow therapeutic range and wide interindividual variation in its pharmacokinetics. The aim of this study was to evaluate whether the C3435T polymorphism was associated with tacrolimus concentration /dose ratio or not.

Methods Sixty-six Chinese renal transplant patients were enrolled in this study. Their body weight, dosage and concentration of tacrolimus were observed. MDR1 genotype was determined by polymerase chain reaction followed by restriction fragment length polymorphism analysis.

Results The result showed that a statistical significance was found between tacrolimus levels per dose/kg/day and MDR1 gene C3435T polymorphism（p＜0.05）. The CC patients had a low tacrolimus level per dose than the CT/TT patients.

Conclusions Pharmacogenetic methods could be employed prospectively to help the dose selection and to individualize immunosuppressive therapy according to the result.

KEY WORDS Tacrolimus, Multi-drug resistance gene, Gene polymorphism

缩 略 词

MDR1: multi-drug resistance gene

CsA: cyclosporine

P-gp: P-glycoprotein

SNP: Single nucleotide polymorphism

HGP: Human Genome Program

PCR: Polymerase chain reaction

RFLP: Restriction fragment length polymorphism多药耐药基因 环孢素A P-糖蛋白 单核苷酸多态性 人类基因组计划 聚合酶链反应 限制性片断长度多态性

一 前 言

免疫抑制剂在器官移植中起着极其重要的作用。由于众多高效、低毒免疫抑制剂的开发应用,使近年来器官移植的成功率大大提高。19xx年,Fujisawa公司从筑波链霉菌的发酵液中分离得到一种新免疫抑制剂。当时实验命名为ＦＫ506,后正式命名他克莫司,商品名为普乐可复(Prograf)。虽然其结构与环孢素A(CsA)迥然不同,但其免疫抑制特性与CsA类似而且效率更强。它的出现,是器官移植的一重要进展[1]。

他克莫司进入细胞后先与受体蛋白FKBP12结合为FK506 FKBP12,此复合物再与钙调磷酸酶高亲和性结合并抑制其活性,最终抑制IL-2的转录,阻断Ca2+依赖性T细胞的活化途径,T细胞因而受到抑制,从而发挥强大的免疫抑制作用[2]。

美国多中心肝脏和肾脏研究显示:他克莫司较CsA在肝移植方面有明显优势,可显著降低急性、耐激素 难治性排斥和慢排的发生。在肾移植方面,他克莫司也较CsA更明显降低急性排斥和耐激素急性排斥,移植肾失功情况较少,而不良反应及感染发生率并未增加。

他克莫司一般是口服给药,很少需静脉用药,必要时可鼻胃管给药,主要在小肠吸收,一般全血或血浆浓度在0.5～6ｈ达峰,口服生物利用度约25%。他克莫司的血药浓度可用MEIA法监测,其适宜范围为:术后1个月:(13.0±2.1) μg·L-1,2～3个月:(9.4±1.6) μg·L-1,3个月后:(6.5±1.3) μg·L-1。他克莫司的代谢主要通过P450酶,凡能抑制该酶活性的药物都可能减少他克莫司的代谢,导致血药浓度增高;反之增加该酶活性的药物均引起他克莫司代谢增加,血药浓度减低[3]。

他克莫司与CsA相比,最大的优势是肝脏毒性小,特别适用于肝功能异常的移植患者以及CsA中毒时的转换治疗和难治性排斥反应。他克莫司的主要不良反应是神经毒性、糖耐量降低和肾功能减退,一般减少剂量后,症状可以缓解。

在临床治疗中，病人对相同的药物反应不完全相同，甚至大相径庭，以前认为是个体差异所致。“人类基因组计划”（HGP）的研究表明，这些差异都是由于药物相关基因变异，即单核苷酸多态性(SNP)引起的。事实上，不同个体的表型差异主要在于SNP,由于SNP改变了个体对药物的代谢及药物结合的受体蛋白的特性，因而决定某种药物是否对个体有效，是否会引起不良反应，这对于临床医生按个

体化用药有重要的意义。

他克莫司是广泛应用于器官移植术后抗免疫排斥反应的一种重要免疫抑制剂

[4-5]，但是其血药浓度显著的个体差异和狭窄的治疗范围是他克莫司在临床应用中

[6-7]的两个重要影响因素。P糖蛋白是多药耐药基因MDR1编码的蛋白，在他克莫司

的吸收和代谢中起着重要的作用。MDR1基因多态性影响着P糖蛋白的表达和活性从而影响到他克莫司的吸收和代谢[8]。

目前，临床实践中仍采用传统的经验用药方式，采用这种给药方式，临床医生需要多次调整，才能找到每例患者的合适剂量，而以药物基因组学为基础的靶向治疗则不同，医生可以通过对患者的遗传学状况进行分析后，一开始就可以制订出最佳药物剂量。器官移植患者免疫力低下，为防止他克莫司用量不足而发生排斥反应或免疫抑制过度引发感染，寻找影响他克莫司用药相关基因的多态性标志非常具有临床意义[9]。

近来，在多药耐药基因MDR1上已经发现有几个单核苷酸多态性（SNPs），其中一部分可以影响P-糖蛋白的表达和功能[10]。到目前为止，研究表明多药耐药基因MDR1第26外显子的3435位点发生的隐性突变是引起P-糖蛋白在人类组织中表达的多态性的主要原因。本研究旨在探讨他克莫司血药浓度/剂量比个体差异与多药耐药基因MDR1 C3435T多态性的关系。

二 材料与方法

2.1 标 本

患者血标本收集：本研究经过中南大学湘雅三医院人权委员会的同意，经患者或其家属的同意，从湘雅三医院器官移植研究院标本库收集到20xx年11月至20xx年7月之间的66个肾移植患者的血标本，每个患者收集抗凝静脉血3-7ml。

2.2 方 法

2.2.1 血标本基因组DNA抽提

采用上海飞捷公司DNAfast500―小量基因组DNA极速抽提试剂盒抽提DNA。操作步骤如下：

（1）． 取1-500μl抗凝全血或骨髓放入1.5ml eppendorf管中，加入DE1液 1ml，

颠倒混匀3-5次，离心1min，充分吸弃上清，留下底部细胞团块。

（2）． 加入DE1液100μl，以手腕充分用力振荡10次，确保形成均一的细胞悬液。

（3）． 加入DE2液 600μl，以手腕充分用力振荡20次，室温静置8-10min，中间

振荡1次。

（4）． 将样本裂解物吸入或直接倒入内套管，离心2min。

（5）． 弃去外套管中液体，内套管中加入500 μl洗液，离心1min。 再重复此过程洗一次。

（6）． 取出内套管，弃去外套管中液体，仍然套回内套管，不加洗液，离心1min。

（7）． 将内套管取出，放入新的eppendorf管中，在膜中央加入洗脱液50μl-100μl。

（8）． 室温放置2min后，离心1min，获得基因组DNA。

2.2.2 C3435T多态性的鉴定：

采用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性（PCR-RFLP）来检测C3435T（第26外显子）单核苷酸多态性（SNPs）。PCR引物中设计根据已知序列（Genbank accession No：AC005068）设计：正引物5＇-TTG ATG GCA AAG AAA TAA AGG-3＇；负引物5＇-CTT ACA TTA GGC AGT GAC TCG-3＇。PCR反应条件为：94℃预变性4分钟，然后94℃30秒、56℃30秒、72℃30秒进行35个循环，随后72℃延伸5分

钟；PCR反应体系为50μl。扩增的PCR产物经琼脂糖电泳分离，紫外灯下目测结果。

2.2.3 血药浓度的测定：

患者于晚8时服用他克莫司，12h后再次服药前抽血1ml，150g/L乙二胺四 乙酸抗凝。手术6个月后的患者血药浓度用半自动微粒子酶标法IMX分析仪(购自美国雅培公司)测定。统计时将血药浓度结果变换为浓度/剂量比进行分析，即以血药浓度除以每日每公斤体重的他克莫司的剂量。

2.2.4 统计学分析：

分析患者连续的药理学参数变化时，基因型被认为无条件独立参数。分析患者服用他克莫司的日常剂量和血药浓度时采用非参数统计方法，两组间的比较使用Mann-Whitney U检验， P＜0.05为差异有统计学意义。

三 结 果

3.1 基因型鉴定 ：

由于有的患者的标本问题如DNA的含量太低或抽提DNA时的操作问题等原因，66位肾移植患者中用来成功进行MDR1 C3435T基因分型的只有63份，PCR限制性片断长度多态性分析结果见图1

图1.PCR-RFLP对MDR1 C3435T多态性分析的电泳图谱.

1.2.5：杂合子CT;3：野生型纯合子CC;4：突变型纯合子TT

Fig.1 Electrophoresis patterns for MDR1 C3435T polymorphism evaluated by PCR-RFLP based assay. 1, 2, 5: heterozygous CT; 3: homozygous for wild-type CC; 4: homozygous for mutant-type TT.

3.2基因型与他克莫司血药浓度/剂量比的关系:

当患者口服相同剂量的他克莫司时，我们发现MDR1基因型为CC型的患者血药浓度明显低于CT型及TT型患者。（P＝0.01），结果见表1和图2。

表1 基因多态性与他克莫司血药浓度/剂量比的关系

Table 1 correlation between the gene polymorphism and tacrolimus concentration

基因 基因型 n 血药浓度/剂量比 P 值

(ng/ml)/(mg/kg) (Mann-whitney U 检验) MDR1 CC 18 72.1±36.7

CT/TT 45 128.4±81.3 0.01

图2 63个肾移植患者移植手术6个月后的他克莫司血药浓度（ng/ml）/剂量（mg/kg/day）与MDR1 C3435T

基因型的对应关系（水平线表示平均值。CC型患者的血药浓度明显低于CT/TT型患者（P=0.01）） Fig.2 Between the tacrolimus level in blood (ng/mL) per dose (mg/ kg/day) at 6 months post transplantation in the 63 renal transplant patients and their MDR1 C3435T CC and CT/TT genotypes.（The horizontal line represents the mean value. The CC patients have a significantly lower tacrolimus level/dose than the CT/TT patients at 6 months (p = 0.01)）.

四 讨 论

19xx年金塞特和科伯特提出了药物基因组学（Pharmacogenomics）这一新概念，它与药物遗传学类似，其目的是研究药物疗效和安全性变化的分子遗传基础，但是药物基因组学拓宽了药物遗传学“某一时刻单基因”的研究方式，它涵盖了人类基因组包括DME，药物靶标和第二信使等基因在内的所有基因 。随着人类基因组计划的深入研究和完成，以及药物基因组学在医药领域得到广泛的应用，必将给21世纪的医药学发展带来深刻的变革。

药物基因组学与合理用药—临床药物基因组学，药物基因组学将基因的多态性与药物效应个体多样性紧密联系在一起，将功能基因组学用于合理用药，利用药物基因组学的技术和方法增加药物的疗效性和安全性，减少不良反应，改善公众健康，实现个体化，可预测及可预防的医疗。这就称为临床药物基因组学（clinical pharmacogenomics），它在临床治疗用药中起着决策性的作用，其目的就是制定出高效、安全、经济的给药方案。由于遗传基因的多变性，任何两个人之间即使年龄、性别以及体重等条件都相同，不同个体对同一剂量的同一药物也可以有不同的反应。用药物基因组学的理论，指导临床合理用药，不仅弥补了只根据血药浓度测定结果，进行个体化给药的不足，而且又为当前无法解释的药动学现象找到了答案，也进一步为临床个体化给药开辟了一个崭新的途径[12-13]。 编码药物代谢酶和转运器的基因多态性的发现，对于理解不同个体间药物反应和浓度/剂量关系存在的差异，有着十分重要的意义。对重要的单核苷酸多态性（SNPs）的研究包括对药物代谢酶和转运器生理功能的改变以及与临床效果之间的关系，可以用于制定安全而有效的用药剂量。这种基因的多态性同样可以引起不同人种间对药物反应和毒性的差异。MDR1的功能性SNPs的鉴定，可以有助于选择同是P-gp底物的药物的最优化治疗。

有报道称，MDR1基因存在一些SNPs，影响那些以P糖蛋白作为底物的药物的生物利用率。整个MDR1基因的系统扫描已经完成，有15个（SNPs）被检测出来[14][11]。MDR1的第26外显子C3435T是一个不稳定的位点，出现在这个位点上的SNPs被发现具有影响其功能的重要作用。进一步的研究揭示，C3435T SNPs与P糖蛋白的摄取相关而且在不同人种之间有明显的差异[15-16]。

本研究中，我们发现肾移植患者体内的他克莫司血药浓度/剂量比与MDR1 C3435T的多态性有着重要的关联。CC型的患者体内血药浓度/剂量比较低，表明这种患者需要增加药物剂量才能达到与CT/TT型的患者相同的药物浓度水平。

需要强调的是，这些研究结果来自于相对数量较少的患者，MDR1 C3435T SNP 与他克莫司需求量之间关系的确认，还需要大量的样本以及的不同人种的参与。为了增加我们对单核苷酸多态性（SNPs）在临床抗免疫治疗中的认识，今后的研究将必须进行大量的关于基因型与表现型之间相互关系的试验。

五 结束语

当毕业论文设计手稿完成之际，我要衷心地感谢我的指导老师聂新民博士，感谢他在从事临床检验一线工作的同时，抽出大量休息时间来指导我的毕业论文设计。他对事业孜孜不倦追求的精神，大胆的创新意识，严谨的科学精神，敏捷的学术思维，广博的知识造诣以及和蔼近人的人格魅力，使我终身受益。

感谢检验系李登清教授、柳永和教授，徐克前教授，李闻文教授，彭剑雄教授，王晓春教授等全体领导、老师在我五年的学习和实习中给予的无私的关怀和指导。

感谢检验系龚道科老师在我完成本论文设计过程中给予的指导和热情帮助。感谢湘雅三医院检验科全体老师对我的帮助。

我还要感谢我的父母的养育之恩，我的朋友刘耕砚给我的支持，以及我的同学们的鼓励，是他们使我一次次战胜困难，顺利完成学业。

最后再一次感谢所有关心、鼓励和帮助过我的人。

六 参考文献

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Tacrolimus Dosing in Chinese Renal Transplant patients

is Related to MDR1 Gene C3435T polymorphisms

Luo Jia1) , Nie Xin-Min2) Peng huai-yan2)

( 1)The XiangYa Medical School of Central South University, 2)The Third Xiang-Ya Hospital of Central South University ) *

Abstract Tacrolimus is an immunosuppressive drug with narrow therapeutic range and wide interindividual variation in its pharmacokinetics. P-glycoprotein(P-gp) plays an important role in the absorption or metabolism of tacrolimus. The polymorphism C3435T of MDR1, the gene coding P-gp, could influence the expression and activity of P-gp. The aim of this study was to evaluate whether the C3435T polymorphism was associated with tacrolimus concentration /dose ratio or not. Sixty-six Chinese renal transplant patients were enrolled in this study. Their body weight, dosage and concentration of tacrolimus were observed. MDR1 genotype was determined by polymerase chain reaction followed by restriction fragment length polymorphism analysis. The result showed that a significant association was found between tacrolimus levels per dose/kg/day and MDR1 gene C3435T polymorphism（p＜0.05）. The CC patients had a low tacrolimus level per dose than the CT/TT patients. Pharmacogenetic methods could be employed prospectively to help the dose selection and to individualize immunosuppressive therapy according to the result.

Key words tacrolimus, MDR1, gene polymorphism

[摘要] 普乐可复是一种治疗窗狭窄，个体之间效果差异非常大的常见免疫抑制剂。P-糖蛋白是有多药耐药基因MDR1编码的蛋白，在普乐可复的吸收和代谢中起着重要的作用。MDR1基因C3435T多态性影响着P糖蛋白的表达和活性。目的 研究肾移植病人普乐可复血药浓度与多药耐药基因MDR1 C3435T多态性的关系。方法 本研究观察了66例口服普乐可复的

肾移植患者的体重、普乐可复剂量及血药浓度，并利用PCR-限制性片断长度多态性的方法检测患者MDR1基因3435位C/T多态性，分析浓度/剂量比与基因型的关系。结果 发现MDR1基因C3435T多态性与普乐可复血药浓度显著相关（P＜0.05），CC型的病人血药浓度明显低于携带T等位基因的个体（CC或TT型）。结论 多药耐药基因MDR1 C3435T多态性影响普乐可复血药浓度，根据MDR1基因不同基因型药物代谢的特点，有针对性的调整剂量，将有利于器官移植病人个体化用药治疗。

[关键词] 普乐可复；多药耐药基因；基因多态性

Tacrolimus, a widely used immunosuppressant, plays a key role in organ transplantation. However, marked individual diversity and a narrow therapeutic range of blood tacrolimus concentration are critical issues in the clinical setting[2-3]. Since a low blood concentration of this drug is one of the factors responsible for acute rejection, while a high blood concentration induces adverse effects such as hypertension, hyperglycemia, and nephropathy, it is important to determine the appropriate tacrolimus dose, particularly in the early stages of transplantation.

Tacrolimus is a substrate for P-glycoprotein (P-gp), the product of the multidrug resistance (MDR1) gene. P-gp acts as a transmembrane efflux pump involved in energy-dependent export of xenobiotics from inside the cells[4]. It is present in intestinal epithelial cells, in biliary canalicular cells, in the blood-brain barrier, in lymphocytes, and on the luminal surface of proximal tubule kidney cells. P-gp affects the absorption of drugs from the gut and their distribution among the body’s compartments and also their metabolism and excretion.

Recently, several SNPs have been identified in the MDR1 gene, some of which affect the P-gp expression and function[5]. To date, the most studied polymorphism that affects P-gp expression in human tissues is the silent mutation at position 3435 in exon 26 (3435C＞T). The objective of our study was therefore to examine the correlation between the tacrolimus [1]

dose, as expressed as the blood level /dose/kg/day, and C3435T polymorphisms of MDR1 gene in renal transplant patients.

1 Materials and Methods

1．1 Materials

1.1.1 Patients and DNA samples The study was approved by Human Rights Committee of The third Xiang-Ya Hospital of Central South University. Between November 2002 and July 2004, 66 recipients were enrolled in this study. Informed consent was obtained from each patient. A sample of 3-7ml anti-coagulated venous blood was obtained from each patient and DNA was extracted by a standard phenol/chloroform procedure.

1.2 Methods

1.2.1 Identification of C3435T polymorphism A polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism was used for the detection of C3435T (exon 26) SNPs. The primer sequences for exons 26 were obtained from known sequences (Genbank accession no: AC005068) Left: 5＇- TTG ATG GCA AAG AAA TAA AGC -3;Right: 5＇- CTT ACA TTA GGC AGT GAC TCG -3＇.The PCR conditions consisted of a denaturation step at 94℃ for 4 min, then 35 cycles of denaturation at 94℃ for 30 s annealing at 56℃ for 30 s and elongation at 72℃ for 30 s, followed by a final extension at 72℃ for 5 min. The amplified reaction products were purified using Qiagen PCR purification kit (Qiagen,USA) followed by digestion with specific restriction enzymes MboI. The digested PCR products were analysed by electrophoretic separation on agarose, followed by direct visualization under ultraviolet light.

1.2.2 Measurement of drug concentrations The blood concentration of tacrolimus of sixty-six renal transplant patients at 6 months post

transplantation was determined 12h after the evening dosage using a semiautomated microparticle enzyme immunoassay (IMX, Dainabot Company,Japan).

1.2.3 Statistical analysis For analysis of continuous pharmacologic variables, patient genotypes were used as categorical independent variables. For the analyses of daily tacrolimus doses, blood tacrolimus levels, and tacrolimus concentration/dose ratios, groups were compared using nonparametric tests. We used the Mann-Whitney U test for comparisons between two groups and the Kruskal-Wallis test for comparisons among several groups. P＜0.05 was considered significant.

2. Results

2.1 Genotype identification

Sixty-six renal transplant patients were assessed for MDR1 genotypes. Due to technical problems or limitation in DNA availability, MDR1 C3435T genotyping was performed on 63 patients. Restriction fragment length polymorphism analysis of MDR1 C3435T was showed in figure 1

.

Fig.1 Electrophoresis patterns for MDR1 C3435T polymorphism evaluated by PCR-RFLP based assay. 1, 2, 5: heterozygous CT; 3: homozygous for wild-type CC; 4: homozygous for mutant-type TT.

2.2 Association of genotype with tacrolimus level/dose

When the patients were treated with tacrolimus at the same dosage, we

found that the tacrolimus blood level per dose for patients expressing CC was less than CT/TT (p＜0.05). The data was showed in table1 and figure2.

Table 1 correlation between the gene polymorphism and tacrolimus concentration

Gene Genotype n Concentration/dose ratio P value

(ng/ml)/(mg/kg) (Mann-whitney U test)

MDR1 CC 18 72.1±36.7

CT/TT 45 128.4±81.3 0.01

Fig.2 Between the tacrolimus level in blood (ng/mL) per dose (mg/ kg/day) at 6 months post transplantation in the 63 renal transplant patients and their MDR1 C3435T CC and CT/TT genotypes. The horizontal line represents the mean value. The CC patients have a significantly lower tacrolimus level/dose than the CT/TT patients at 6 months (p = 0.01).

3. Discussion

The discovery of genetic polymorphisms in genes encoding drug metabolizing enzymes and transporters has contributed significantly to the understanding of the inter-individual variability in dose-concentration relationships and drug response. Knowledge of important SNPs that alter functional capacities of metabolic enzymes and transporters, as well as their associations with clinical outcomes, can be useful in designing dosage regimens that are safe and effective. These

genetic polymorphisms are also responsible for interethnic differences in drug response and toxicity. The identification of functional SNPs in MDR1 may provide a useful tool for optimizing therapy with drugs that are common substrates for P-gp.

It was reported that several single nucleotide polymorphisms (SNPs) exist in the MDR1 gene that have contributory roles on the bioavailability of drugs that are P-gp substrates. A systematic screen of the entire MDR1 gene was performed and 15 SNPs were detected[5-6]. Of these, the SNP in exon 26 (C3435T) of the MDR1 gene, which occurred at a wobble position, was found to be of functional importance. Further studies revealed that the C3435T SNP was associated with enhanced uptake of P-gp substrates and varied significantly amongst different ethnic populations[6-8].

In the present study, we investigated the C3435T SNP in Chinese renal transplant patients. In our study, a significant association was found between tacrolimus levels per dose/kg/day in renal transplant patients and MDR1 gene C3435T polymorphism. The CC patients had a low tacrolimus level per dose, indicating that they required more drug to achieve the same tacrolimus target levels than the CT/TT patients. It should be highlighted that these results have been obtained from a relatively small number of patients. The confirmation of the association of the MDR1 C3435T SNP with tacrolimus requirements is needed in a larger and more diverse population. Large-scale genotype-phenotype correlation trials are required to increase our knowledge of the effects of SNP on clinical immunosuppressive therapy.

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综 述

PCR 技术应用的新进展

罗 佳1 综述 聂新民2 审校

（1.中南大学湘雅医学院2001级检验系， 2.中南大学湘雅附三医院检验科）

[摘要] PCR技术自19xx年建立以来,发展之迅速、应用之广泛,表明其具有强大的生命力.近些年来,基于PCR的基本原理,许多学者充分发挥创造性思维，对PCR技术进行研究和改进，使PCR技术得到了进一步的完善，并在此基础上派生出了许多新的基于PCR技术为基础的新的方法，使得PCR技术得到了广泛的应用。现将目前主要的应用研究新进展做简要综述。

[关键词] 聚合酶链反应PCR；定量PCR；核酸杂交；支链DNA技术；荧光探针定量PCR法

1 方法

1.1 聚合酶链反应（PCR）：即传统PCR法。细胞中的DNA复制是一个复杂的过程。参与复制的有多种因素，PCR是在试管中进行的DNA复制反应，其基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对简单。PCR反应体系中含有耐热的TagDNA聚合酶，化学合成的寡聚核苷酸引物（primer），4种dNTP，以及合适的缓冲体系。PCR反应是重复进行DNA复制的过程因而需要重复进行DNA模板解链，引物与DNA结合，DNA聚合酶催化新生DNA的合成（引物延伸），这些过程都是通过控制温度来实现的，即通过改变温度引起变性，退火，和延伸过程，使DNA得到复制[1]。由于近年来对逆转录病毒和逆转录酶的认识，在PCR的基础上，逐渐发展了RT-PCR技术，用于目标RNA和逆转录病毒的检测。

1.2 定量PCR: 以HBV为例。 聚合酶链反应(PCR)技术应用于临床检测以来，对HBV感染的研究提供了一种快速而敏感的有效手段。然而，PCR临床应用亟待解决不能定量和污染所致的假阳性等问题。随着分子生物学的飞速发展，PCR检测不仅能定性，且也能定量检测，从核酸分子杂交到定量PCR技术检测HBV DNA，其灵敏度和特异性不断提高。

1.2.1核酸杂交法

利用病毒基因作为探针，进行核酸杂交。其基本原理是：具有互补序列的两

条单链核酸分子在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及复性过程中各分子间键的形成和断裂等。杂交的双方是待测序列和已知核酸序列，在杂交体系中已知的核酸序列被称为探针（probe）。作为探针的病毒核酸通常用同位素或非放射性核素标记，用探针杂交后，为检测核酸杂交体，可用放射自显影法或用生物素-亲和素系统进行检测。核酸分子杂交有几种基本类型：鉴别DNA靶分子的杂交称为Southern印迹杂交（Southern blot），其中待测核酸为DNA片段；鉴别RNA靶分子的杂交称做Northern印迹杂交（Northern blot），其中待测核酸为RNA；由Southern和Northern印迹又可衍化出斑点杂交、原位杂交、核酸酶保护实验等。由于该法敏感低，且过程繁琐，现已很少用于定量检测。

1.2.2 支链DNA技术

Chiron公司推出的支链DNA(bDNA)技术是一种通过在固相微孔板进行一系列特异的杂交反应来扩增信号并以化学发光方法进行定量的技术。微孔板上包被的捕获探针捕获样本中靶DNA后，加入的靶探针与靶DNA杂交结合，再加入合成的bDNA扩增分子与靶探针杂交。由于bDNA分子上有几十个呈梳状排列重复的核苷酸序列，每个核苷酸序列上结合有3个碱性磷酸酶，而使得信号充分扩大。加入发光底物并测定发光强度，可定性定量检测HBV DNA该方法灵敏度为20×10拷贝/ml。

1.2.3 荧光探针定量PCR法

自Mullis19xx年发明PCR技术以来，PCR技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，荧光定量PCR(fluorescence quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)[2] 是19xx年由美国PE(Perkin Elmer)公司研制出来的一种核酸定量技术。该技术较常规PCR具有简便、灵敏、准确等优点，在临床具有广阔的应用前景。FQ—PCR的分子生物学基础是按常规PCR方式进行体外基因扩增，即在PCR 反应体系中加入一荧光标记的探针，该探针能与扩增基因的某一区域的序列发生特异性结合，探针5?端标以荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素，荧光发射峰值518rim处)，近3?端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明，荧光发射峰值582nm处)，探针末端被磷酸化，以防止探针在扩增过程中被延伸。探针完整时因为淬灭基团的存在使荧光报告基团的活性被抑制，当进行PCR扩增时，利用Taq酶5?→3?端的外切酶活性，将探针5?端荧光报告基团切断释放出荧光信号，而每进行一次扩增，

就有一个荧光发射基团被释放，因而游离荧光信号的强弱与PCR产物成正比关系。通过测量反应体系中荧光的强度即可推算出起始模板DNA或RNA的量从而达到定量的目的。

FQ-PCR具有高灵敏度、高特异性、高准确性及简便特点，已被广泛应用于临床各种病原体的检测以及疗效的评估[3]。

1.2.4 AcuGen Amplisensf HBY法

由美国Biotronics公司建立的一种新型HBV DNA定量检测法。它属外参标定量PCR技术。基本原理是通过荧光素标记的引物在扩增中能量的转换而定量检测初始HBV DNA模板数。该技术用套式PCR扩增，先扩增HBV DNA S区中241片段，经20～25循环后，加入信号引物继续扩增241bp片段中64bp片段，并于每3个循环中测定1次信号引物能量转换情况，结合标准品曲线可计算出靶DNA初始模板数。此方法使用计算机自动分析定量．不需要传统电泳，因而污染机会减少,也有研究将这种方法称之为能量转换方法(QPCR)。该法灵敏度为50拷贝/ml

1.2.5 其他用于HBV DNA定量的方法还有滴度定量法，竞争性PCR等方法 滴度定量法的影响因素较多，因此难以标准化，精确度也受到影响，况且每份标本都要检测多个稀释度，花费甚大，已很少使用；竞争性PCR方法没有除去影响PCR扩增率的诸多因素，结果不够精确，故也很少使用[4]

2 应用

2.1 基因检测

病毒基因检测（斑点杂交法，系一种固相杂交技术。将含有HBV DNA的样本点在硝酸纤维膜上，再与特异性探针进行杂交，经放射性自显影或酶促反应后在底片或膜上呈斑点，直接对膜上的斑点进行放射性计数(cpm)或测定斑点光密度(OD)，与根据不同已知量标准品HBV DNA杂交昕得的标准曲线比较，可定量分析样本初始HBV DNA量。）吴侯柏[5]认为“近年来采用聚合酶链(PCR)结合Taqman荧光探针技术(FQ—PCR)者血清中HBV的含量是预测干扰素治疗是否有效的重要因素。目前临床普通使用实时荧光定量(PCR)法，它具有良好准确性和重复性，但进口试剂、设备都较贵，它利用扩增和产物检测一步完成。检测过程无需打开扩增管，造成产物污染的可能性少，可在国内临床推广使用。当然和进1∶3的COBAS，Ampticor法是有一定差距。实时荧光定量方法的线性回归系数(Log10)达到了0.957，不同

含量样本的批内变异均小于15％ ，而两种方法的临床样本检测结果显示：普通检测方法有弱阳样本漏检，其它样本与实时荧光定量具有良好的相关(r=0．817)。实时定量荧光法检测范围宽，可达1O个数量级。这些都可表明使用实时荧光定量法测定具有良好的应用前景。

2.2 基因分型

在流行病学调查和临床应用中，微生物的感染是我们目前遇到的最多也最复杂的问题之一，以夏云等人的研究为例，应用重复序列PCR技术对嗜麦芽窄食单胞菌进行基因分型[6] ,采用肠杆菌科细菌基因间重复一致序列设计引物的聚合酶链反应(ERIC—PCR)对嗜麦芽窄食单胞菌进行分子流行病学调查，取得满意效果。研究表明在大肠埃希菌、伤寒沙门菌等肠杆菌科细菌基因中存在一种间隔分布的重复DNA序列,称肠杆菌重复基因保守序列(enterobacterial repetitive intergenic

consensus)，该序列大小约126bp，位于染色体上非编码转录区，遗传性稳定,在不同种间仅有拷贝数和在染色体中的位置变化，以ERIC片段为靶来设计引物进行PCR扩增，能产生多种独特的扩增产物(50～3000bp)，具有种特异性甚至株特异性。由此可根据扩增产物的电泳条带来区分细菌的株(型)。该技术称为重复PCR指纹。采用重复PCR指纹技术对嗜麦芽窄食单胞菌进行基因分型操作简便，重复性好，DNA模板制备较简单，不需要复杂的仪器设备，完全能够在临床实验室建立，且该方法还可应用于其他革兰阴性菌的基因分型，是医院感染分子流行病学调查中较理想的分析方法。

2.3 基因诊断

聚合酶链反应(PCR)技术问世20年来，已经成为致病基因分析的重要手段。但是，多年来PCR一直很难直接用于临床疾病的常规诊断，其原因主要是PCR常规实验中存在的污染问题难以解决。最近刘敬忠[7]等建立的Q—PCR用SYBR Green 1染料法是一种可以与双链DNA小沟结合的染料，结合后荧光信号增强。在PCR循环连续进行中，双链DNA产物不断与染料结合并释放荧光信号。因此，在试管内信号强度代表双链DNA分子的数量。这些方法的不利之处是特异性不强，染料可以和任何DNA双链结合，但通过熔解曲线分析可以排除非特异性结合所产生的干扰。只要有合适的引物和模板，SYBR Green 1法不需荧光标记探针即可对任何基因进行定量分析，且价格便宜，是值得推荐临床应用的Q—PCR技术。在肿瘤研究方面则尚属起步阶

段，但最近又有文献报道将该技术应用于妇科肿瘤及脂肪肉瘤等肿瘤研究，却得到了良好的检测结果[8-9]。荧光定量PCR是新近出现的核酸定量方法，在肿瘤诊断上，定量PCR技术不仅能有效检测基因的突变，而且能够准确检测出肿瘤相关基因的表达量，据此进行肿瘤的早期诊断、分期、分型以及发现早期转移、判断预后。另外，应用定量PCR检测外周血中的肿瘤标志物数量及原癌基因异位导致融合基因的形成量都为临床早期诊断、判断疗效、制订治疗方案提供更为可靠的依据，必将在肿瘤研究中发挥更加重要的作用。

2.4 基因治疗

由于人们对于基因的认识日益丰富，大量的疾病被发现和基因的异常表达有重要关系，比如一些遗传病和肿瘤的发生。于是人们不满足于治疗疾病临床症状本身，而开始着手于从源头找到治疗的方法。PCR可以帮助人们找到变异的基因，以及其他我们感兴趣的靶基因，从而方便我们进行基因诊断和基因治疗。正如以上所述，人们可以直接获得基因组，核酶、tRNA及其他功能性RNA和DNA，还可以获得用于脱氧核酶剪切的底物mRNA，为RNA和DNA结构和功能的进一步研究提供了一个操作简便，可靠的技术平台，将必定会在分子生物学和细胞生物学研究领域得以更广泛的应用和发展。

综上所述，随着时间的推移，PCR技术将更加广泛地应用于分子生物学、遗传学、医学、微生物学等研究领域，PCR技术将更加科学、更加完美和实用。

参 考 文 献

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