交联于蛋膜上的纳米颗粒增强的尿酸酶传感器
陈燕花
化工与资源环境学院 化学工程与工艺专业
指导教师：伍 林
1前言
随着生命科学的发展进入分子水平，有人预言21世纪将是检验医学的世纪，即从分子水平对疾病进行诊断和治疗。这就要求临床生物化学检验准确、快速、简便、标本微量化、方法标准化、且经济实用。生物传感器正是在此要求下出现的一类跨领域、多学科的前沿诊断仪器。
国内外对生物传感器展开了广泛深入地研究，已经研制出了葡萄糖生物传感器、乳糖生物传感器、尿酸酶生物传感器、DNA生物传感器、BOD生物传感器、测酚生物传感器等多种类别的生物传感器，来满足人们在临床检验、环境监测和生化分析[1-3]等领域中的需求。
本实验将纳米二氧化硅凝胶和尿酸酶紧贴于蛋膜上，将酶膜紧贴于普鲁士蓝（PB）修饰的玻碳电极表面，然后以自制铂片电极为对电极、甘汞电极为参比电极，组成三电极体系，制成尿酸酶生物传感器。当体液中的尿酸通过酶膜时，与酶进行反应，检测出该处产生的反应电流，然后将其换算成尿酸浓度加以显示。应用尿酸酶传感器测定人体血和尿中尿酸的浓度，是一种准确、快速、简便的方法，可帮助诊断肾炎、白血病和肿瘤等疾病。
2 尿酸酶生物传感器的工作原理
尿酸酶生物传感器的工作原理是：尿酸在尿酸酶作用下，被分子氧氧化成尿囊素，并产生二氧化碳和过氧化氢。根据反应前后氧的消耗，我们用电极监测溶液中氧的变化，就可推算出尿酸的浓度，其工作机理[4]如图2：
图1尿酸在尿酸酶作用下的反应机理
Figure1 Principle of uric acid under the uricase
3 实验部分
3.1 仪器与试剂
试剂：尿酸酶（4.6units/mg， Sigma公司），牛血清白蛋白（BR），戊二醛（CP），磷酸氢二钠，磷酸二氢钾（AR），氯化钠(AR)，鸡蛋，气透膜，实验用水为二次蒸馏水。
仪器：玻碳电极（天津兰力天仪器有限公司），铂电极（自制，铂片长×宽×厚为5×4×0.25mm），甘汞电极（上海雷磁），CHI600型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。
3.2 尿酸酶电极的制备
取新鲜鸡蛋壳小心剥离蛋膜，依次用NaCl溶液、蒸馏水清洗；称取12.5mg牛血清白蛋白（BSA）溶于250μL 10g?L-1尿酸酶溶液中；将蛋膜铺于洁净的玻片上，小心裁取直径为1cm的圆形膜；在膜上依次滴加25μL尿酸酶-牛血清白蛋白混合溶液、改性纳米二氧化硅凝胶液、5μL 2%戊二醛溶液，室温放置3~4h，置4℃冰箱冷藏过夜；过夜后的蛋膜用磷酸缓冲液(PBS)漂洗数次；将酶膜紧贴于PB修饰的玻碳电极表面，覆盖气透膜，即制成尿酸酶电极[5,6]。
实验流程如图2所示。
图2 纳米颗粒增强的尿酸酶电极制作示意图
Figure2 Manufacture flow chart of nanoparticles strengthen uricase electrode
3.3 实验方法
采用三电极体系进行检测：饱和甘汞电极为参比电极，制作的尿酸酶电极为工作电极，自制铂片电极为对电极，底液为0.1mol ·L-1的KCl 磷酸盐缓冲溶液，在一定的温度下进行检测。测量时，先将三电极置于缓冲溶液中，加一电压于工作电极(0.4ＶvsSCE)，当背景电流值减小至一恒定值时，将电极放至被测尿酸溶液中，分别记录不同时间的电流响应值，扣除初始背景电流值，即为被测尿酸离子浓度的电极电流响应值。
4 影响因素分析
4.1 尿酸浓度的影响
测量不同浓度尿酸的响应信号，使得电极响应与尿酸浓度成很好的线性关系，酶电极在不同浓度的尿酸中的循环伏安如图3所示。确定尿酸酶生物传感器检测尿酸浓度的线性响应范围，如图4 所示。实验测定尿酸浓度的线性响应范围为7.5×10-6~1.5×10-4mol·L-1。
图3酶电极在不同浓度的尿酸中的循环伏安图 图4尿酸浓度与响应电流线性关系图
Fig3 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor Fig4 Linear relationship’ chart of difference of urate standard in different concentration of uric acid current response solutions on the urate biosensor
(a.112.5μg/mL, b.75μg/mL, c.37.5μg/mL, d.7.5μg/mL, e.0μg/mL)
4.2 尿酸酶浓度的影响
向尿酸溶液中多次加入尿酸酶，以测定不同浓度尿酸酶对氧化峰电流的影响。电流响应随着尿酸酶浓度从零到某浓度的增加而增加。综合考虑电流响应和经济因素，选择最适宜的尿酸酶浓度1.5U。
4.3 纳米二氧化硅的影响
酶电极的性能是由酶的催化活性、酶活性中心和导电基质之间电子交换速率决定的。纳米颗粒比表面积大、表面自由能高，吸附能力较强，把纳米颗粒引人到传感器研究中，可以使更多的酶分子可以固定在纳米颗粒表面。另外，由于纳米颗粒尺寸很小，有可能与酶内部的FAD亲水基团发生作用，从而引起酶构型上的变化。这种变化使得酶的活性中心FAD更接近底物，提高了酶的催化效率。改性纳米SiO2颗粒对生物分子具有很好的选择吸附性，可望实现纳米颗粒与酶分子活性中心及电极之间的直接电化学作用，大大增强生物传感器的灵敏度。本实验对不添加纳米二氧化硅、添加纳米二氧化硅、添加改性的纳米二氧化硅，所制备的尿酸酶生物传感器进行了比较，实验证明纳米二氧化硅有增强电流响应信号的作用。
4.4 缓冲溶液pH值的影响
缓冲溶液pH值对酶催化反应速率和酶的活性有较大影响，如图5所示。尿酸酶最适宜pH范围较宽。综合考虑酶的活性以及响应电流的最大的灵敏度，选择最适宜的pH值6.5。
图5 pH值对酶生物传感器响应信号的影响 图6 温度对酶生物传感器响应信号的影响
Fig5 Effect of pH on the current response Fig6 Cyclic voltammograms of the uricase biosensor
of the enzyne biosensor in different temperature
(a.25℃, b.20℃, c.30℃, d.35℃, e.10℃)
4.5 温度的影响
温度的变化将影响酶的活性及酶催化反应速率。在10~35℃范围内考察氧化峰电流与温度的关系，如上图图6所示。氧化峰电流随温度的升高而增大。考虑温度较高时酶易变性失活，选择最适宜的温度25℃。
4.6 工作电极的影响
将酶膜分别固定在铂电极、玻碳电极、石墨电极上，观察响应电流的灵敏度，选择最适宜的固定电极-玻碳电极进行实验。
5 结论
本方法研制的尿酸酶生物传感器具有操作简单、分析速度快、灵敏度高、所需试样少的特点，通过进一步研究后，有望应用于临床，帮助诊断肾炎、白血病和肿瘤等疾病。
参 考 文 献
[1] 潘涛. 生物传感器的概述和研究进展[J]. 江苏广播电视大学学报, 2002, 6(12): 55-56.
[2] Mukhopadhya K, Phadtare S, Vinod V P, et al. Gold nanoparticles assembled on amine-functionalized Na-γzeolite: A biocompatible surface for enzyme immobilization[J]. Langmurir, 2003, 19: 3858-3863.
[3] Sbrana F, Parodim T, Ricci D, et al. Langmurir films of thiolated gold nanoparticles transferred onto functionalized substrate: 2-D local organization[J]. Material Science and engineering C, 2002, 22: 187-191.
[4] 铃木周一. 生物传感器[M]. 科学出版社, 1988.
[5] 邓健, 廖力夫, 袁亚莉, 等. 乳酸氧化酶共价交联于蛋膜上制备乳酸传感器[J]. 分析试验室, 2002, 21(6): 64-66.
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Nanoparticles Strengthen Uricase Biosensor Utilizing
Covalently Bond on Egg Membrane
Chen Yan-hua
College of Chemical Engineering, Resources and Environment
Wuhan University of Science and Technology
Abstract: In the experiment, BSA(bovine serum albumin) and glutaraldehyde were taked as cross linking reagent, and nanoparticles gel and uricase were cross-linked on egg membrane. The three electrode system which composed of two platinums electrodes act as working electrode and counter electrode respectively, saturated calomel electrode acts as reference electrode, and execut uricase biosensor. The concentration of uricase, nanoparticles, pH value of solution, temperature were studied emphatically. The 1.5U uricase in pH6.5 solution at the temperature 25℃ were appropriate conditions. The linear range of the biosensor is 7.5×10-6~1.12.5×10-4μg/mL.
Keywords: uricase; egg membrane; nanoparticles; biosensor
第二篇：写字论文
低年级学生规范书写习惯养成之我见
通伸小学 李 莉
现在的小学生从一年级开始很多就养成不良的书写习惯，严重影响身心健康，影响一生的发展。从低年级的写字教学中就严格要求，规范写字，是非常必要的。在长期的摸索和实践中，我独创了写字五部曲规范练字的过程。
第一步 析字形
析字形就是当学生提笔写字前，对所写的字进行观察、分析、学会临习、学会看帖、读帖，从真正意义上进行模仿。模仿需要发现范字的基本特点和内在规律，包括字的笔画、间架结构以及章法气势，因而必先作一番细致的观察分析。
教师可以通过打比方、编顺口溜等方式，激发学生兴趣，帮助学生记住字的特点。如在“太阳”一词的书写指导中，一开始我故意把“太”字写得很大，把一撇、一捺写得很开，使它们超出田字格，然后问学生：“老师的‘太’字写得好吗？”在学生的回答中，我及时进行总结：“对呀，同学们观察得可真仔细，其实汉字的每一笔，每一画在田字格里的位置都是规定好了的，老师的‘太’字写得出了格，多像不守纪律的同学，坐没坐相，站没站样。它和其他字放在一起显得不那么协调，不那么好看，有损于汉字整体的形象。”又如临帖写“言”字时，对于主笔“横”的指导，教师引导学生想象人走在钢丝上，伸长手臂，可以起到平衡作用，因此“横”要写得长一点，这样，有利于学生产生浓厚的写字兴趣，便于把握“言”字的特点。通过生
动讲解分析可以使枯燥的写字教学变得生动、形象起来。 第二步 记位置
当学生记清字形后，要引导学生仔细观察田字格里的范字。哪些笔画长，哪些笔画短；还要看清字的布局、间架结构。在仔细观察了范字后，引导学生静下心来，并在范字上用手指描写。
还要让学生掌握汉字结体的一般规律。例如：水、木、米、来??这类字中撇捺的收笔位置总是比竖（或竖钩）的收笔位置高，就像伞骨与伞柄的关系——伞柄总比伞骨长。在一个字中，竖画如果落在竖中线上，要写得挺直；如果竖落在字左边，可略左斜；如果竖落在字的右边要略右斜，就像板凳腿，呈梯形，这样字才平稳，如：同、周等。再如一个字中有几个横画，像：言、其、真、是??横画间隔要匀，要注意突出某一横??像这类规律是很多的，教师要敏于发现，举一反三，学生才能触类旁通。
第三步 写端正
在学生完成前两个环节之后，即可引导学生仿写，写时要求学生集中注意力，看准田字格，不随便下笔。一旦下笔，力争一次就把字写正确，写端正，写整洁。在学生仿写时，教师要注意随时矫正学生的写字姿势、握笔方法、运笔情况，字的结构搭配等。对于多数学生存在的问题，在评价时要集体矫正；而个别问题应个别辅导，不能轻易放过。
第四步 比好坏
评字是整个写字教学中至关重要的一步，是写字指导的延续和提
高。因此，在教学中，要充分调动学生的主观能动性开展自评、互评、点评，建立良好的评价机制、激发学生的写字兴趣。
①自评。这一环节最好是在学生仿写的过程中。当写好一个字后，随时和范字对照，找出不足之处，以便在写下一个字前加以改进。当然自评也可以是在小组互评时，看着小伙伴们写的字，跟他们的作品对照，面对面地展开自评。这样可以增强孩子敢于发现自己缺点和不足的勇气，培养其诚实的品格，陶冶其情操。
②互评。在仿写后，积极组织学生互相评议，或选取几份作为例子，集体评议。评议时，教师要给学生提供评价的标准及评价原则。如“书写是否正确，结构是否合理，主要的笔画是否突出，运笔是否到位，字面是否整洁，要善于发现别的长处等。”当学生有了评价的准绳之后。评价就能有的放矢。同时，在互评时，教师要鼓励学生对照自己的书写善于发现别人的长处，学习借鉴，以便改进。通过互评不仅能训练口语交际能力、观察分析佳力，也能使学生潜移默化地受到熏陶和感染，使他们不骄不躁，能正确全面地看待人和事物。
③点评。在点评过程中，教师的点评往往起到关键作用。有时教师的一句点评可以增强学生写好字的信念。这就要求教师的点评要恰当准确，要善于捕捉孩子的闪光点；对孩子写得不足的地方，可以委婉地指出，帮助其改进。
通过评字，学生对字从整体结构到部件、笔画，有了初步的感知，强化了识记，提高了识字的准确性；通过评字，强化了学生的参与意识，提高了写好字的自觉性；通过评字，学生经过自身的实践活动，
提高了观察分析能力，开发了智力；通过评字，学生感知美、欣赏美，陶冶了情趣。
第五步 改完美
写字教学最后一点应归结到改上去，而且应是及时地让学生在评字之后，一个字一个字，一笔一画地再发现、再改进。改的过程是再完善、再提高的过程。学生一旦养成认真细致地习惯，就会终身受益。 经过写字五部曲的规范练习，学生的写字能力得到很大的提高。
4、激励强化，多种方式促规范
（1）开辟专栏
把全班好的写字作品展示出来，更好的营造一种写字氛围。
（2）定期比赛
定期在班里进行隆重、规范的班内书法比赛，并对优秀者进行奖励，评出“小小书法家”、“写字小能手”，让人人都参与到其中来，在全班掀起写字的热潮。
（3）改进评估的方法。
利用“圈”点法肯定学生的点滴进步，部分笔画好的打小圈，整个字好的画五角星，特别好的画双星等形式。同时配以简明的评语，如：“好样的”、“你真棒”、“继续努力”、“再接再厉”、“没有最好，只有更好”??以此来激励学生。
（4）加大评估力度
把写字纳入学生的综合评价之中，渗透到各个学科之中，体现在单元测试、期中、期末考试之中，并加大相对分值。
（5）齐抓共管
在各任课教师和各位家长的大力支持和配合下，学生规范书写习惯的养成将更快、更好。
5、及时总结，分析得失思规范
两个学期以来，教师、学生的共同努力下，写字教学的效果十分明显。全班80%的孩子通过了写字的过关考核。二十多名孩子的字真正做到“书写规范、端正、整洁”，获得了优秀等级。学生不再感到写字是负担，真正感受到写字的乐趣，增强学习和做人的信心。写字还促进了学生的全面发展，观察能力、综合分析能力、记忆能力、思维能力和动手实践能力都得到了进一步的加强。学生做事更细心了，学习成绩也提高了。写字还使得学生的审美能力和审美水平大幅提高。看到孩子们取得的成绩，我的心中便又增添了无穷的力量和信心。 虽然课题研究已取得一定的成果，但还有很多地方值得我们去思考、去探索，如写字教学的评价体系需要进一步完善。教学研究的最终目的是将研究成果转化为教学效率，大面积提高教学质量，如何将研究成果推广运用，覆盖面更大一些，是本课题需要继续研究和解决的根本问题。
方方正正的汉字凝聚着中华民族的聪明才智，承载着中华民族的文化和文明史，蕴含着中华民族的美好追求和气节。我自知在写字方面我自身还存在着许多的不足，平时还要多读帖、勤练字，将写字教学研究进行到底，让每个孩子都能写一手漂亮的汉字；让横平竖直的方块字越写越传神；让中华民族的优秀文化传统代代相传。