溶液配制

LB固体培养基（液体培养基不加琼脂）

胰蛋白胨 1g

酵母提取物 0.5g

NaCl 1g

琼脂 1.6g

加蒸馏水水容至100 mL，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，在15psi高压下蒸汽灭菌20min. （1.05kg/cm3）。

一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。

LB固体培养基倒板

1.配制：100ml LB培养基加入1.5g琼脂粉

2.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。

1

琼脂糖凝胶

H2O 50 ml

50×TAE 1 ml

琼脂糖 0.5 g

EB 2.5 ul（胶不热时加入）

微波炉加热30 s，倒入制胶盒。

D-PBS

杜氏磷酸盐缓冲液(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，D-PBS)也是一种磷酸盐缓冲液，与常规PBS的不同之处在于磷酸盐的含量稍低些，并含有 钙镁离子。D-PBS主要用于胚胎学方面的研究，多用于胚胎的冲洗液、冻存液和培养液。

NaCl 0.8g

KCl 0.02g

Na2HPO4 0.115g

KH2PO4 0.02g

CaCl2.2H2O 0.0133g

MgCl2.6H2O 0.01g

D-glucose 0.1g

溶解至100 ml ddH2O中，过滤除菌。

2

胰酶（0.125%）

胰酶 0.25g

EDTA 0.02g

PBS(1×) 200 ml

4℃过夜，0.22 um微孔滤膜过滤，分装。

摇菌时抗生素浓度

氨苄工作浓度50 ug/mL，配50 mg/mL的，用时稀释1000倍

卡那工作浓度30 ug/mL，配30 mg/mL的，用时稀释1000倍

pH4.75 50 mmol/L的醋酸缓冲液（含4 mM EDTA）：

取27.22克NaAc·H2O溶于1000 ml蒸馏水，即为0.2M NaAc，用冰醋酸配制0.2 M醋酸，然后取410 ml 0.2M HAC和590 ml 0.2M NaAc混匀，测pH值调到pH4.75，然后每1000 ml溶液加入5.95g EDTA-Na2溶解即可。此溶液为200 mM pH4.75的醋酸缓冲液，EDTA为16 mM。使用时将该溶液1：4稀释（1份该溶液加3份蒸馏水）即成50 mM pH4.75 50 mmol/L的醋酸缓冲液，含4 mM EDTA。

刺激缓冲液：

在100 ml MEM培养基中加入IBMX 0.0111 g，加入MgCl2 6H2O 0.2033 g，70℃加热溶解约1 h，至无絮状漂浮物。冷却至37 ℃备用。

3

双抗的配制：

1. 所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。

2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。

3.使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位＝1微克。可分别取4ml青链霉素配成混和液，这样青链霉素的浓度各为10万单位/ml,然后将8ml溶液稀释十倍，青链霉素的浓度各为1万单位/ml，用时可向培养液中加入1%的双抗，即可达到终浓度为100单位/ml.

4

第二篇：2-DE配制溶液总结

2-DE所需溶液配制

1.Bradford法测蛋白浓度

1）Bradford工作液：95%乙醇25ml； 98%磷酸43ml; 考马斯亮蓝G250 50mg；用水定容至500ml. 先用乙醇溶解考G250，再加磷酸，最后定容于棕色瓶中，过滤。外加油皮纸保存。

2）配制1mg/ml BSA(牛血清白蛋白)

2.水化液的配制

水化上样缓冲液

尿素(Urea) 8M 4.805g

CHAPS 4% 0.4g

DTT(二硫苏糖醇) 50mM 0.077g(现加) 1ml+7.7mg

20%Bio-Lyte（pH3-10两性电解质） 0.20% 100μl(现加) 1ml+10μl 溴酚蓝 0.0002%20μl（0.1%的溴酚蓝储液）

注意：尿素要先溶解于5ml水中，再加其它试剂，以MilliQ水定容至10ml，分装成10小管，每小管1ml，－20℃冰箱保存。水化上样缓冲液一旦融化，不可再冷冻

3.平衡母液100ml

名称终浓度加入量

尿素 6M 36g

SDS 2% 2g

1.5M Tris-HCL ,PH8.8gel buffer 0.05M 3.3ml

甘油 20 % 4.21ml(95%甘油) 以MilliQ水定容至100ml，分装成10管，每管6ml，－20℃冰箱保存。

1)平衡液A（DTT平衡缓冲液1）：可还原蛋白巯基，使用前现配现用，在平衡母液中加入DTT使终浓度为2%（120mg/6ml），用时取出1管加入DTT120mg，充分混匀，现用现配（因为DTT在室温的半衰期很短）。

2）平衡液B：使巯基烷基化，当胶条进行第一次平衡时，在母液中加入碘乙酰胺，使之终浓度为2.5%（150mg/6ml），用时取出一管加入碘乙酰胺150mg,充分混匀,现用现配（因为碘乙酰胺在室温的半衰期很短）。

4. 1.5MTris-HCL (PH8.8)

Tris 90.75g 45.375g

双蒸水 400ml 200ml

HCl约16ml 约8ml 自己调成8.8

双蒸水定容至 500ml 250ml

4度冰箱保存。

5. 12%SDS-PAGE胶配制方法

去离子水 13.2ml

30%丙烯酰胺溶液 16ml

1.5MTris-HCL 10ml

10%SDS 0.4ml

10%AP 0.4ml

TEMED 0.016ml

1)30%聚丙烯酰胺储液

丙烯酰胺 150g 75g

甲叉双丙烯酰胺 4g 2g

去离子水定容至 500ml 250ml

该溶液需要滤纸过滤，棕色瓶4度冰箱保存。

2)10%SDS

称1gSDS加10ml水溶解

3）10%AP

称0.1g,用时加水1ml溶解，溶解后4度保存。

6. 10x电泳缓冲液(pH=8.3)

试剂质量或体积

TriS碱 30.3g 15.15g

甘氨酸 144g 72g

SDS 10g 5g

双蒸水定容至 1000ml 500ml

注意：用时加去离子水稀释10倍

7. 0.5%琼脂糖凝胶

称琼脂糖0.25g，加8μl 1%溴酚蓝，加SDS-PAGE缓冲液50ml，微波炉煮沸备用。

8.考染液

试剂质量或体积

考马斯亮蓝R-250 1g

甲醇 400ml

乙酸 100ml

双蒸水定容至 1000ml

9.脱色液

甲醇400ml

乙酸 100ml

双蒸水定容至 1000ml

10. 1%溴酚蓝配好后于4度保存

溴酚蓝 10mg

Tris Base 6mg

水 1ml

11.银染液的配制

（1）

（2） 固定液（40%甲醇，10%冰乙酸）：25ml冰乙酸，100ml甲醇，加Mill-Q水至250ml，300ml敏化液（30%甲醇，0.2%Na2S2O3，6.8%无水乙酸钠）：90ml甲固定时间>1h或过夜。 醇,33.8gNaAc?3H2O，0.9g Na2S2O3?5H2O（临用前现加），加Mill-Q水定容至250ml，敏化30min。

（3） 银染液（0.25%硝酸银）：先配置20%硝酸银储液，用时取储液3.75ml，加Mill-Q水至300ml，银染液（临用前现配），银染20min。

（4） 显影液（2.5%碳酸钠与0.0074%甲醛混合）：7.5gNa2CO3，225μl37%甲醛（临用前现加），以Mill-Q水定容至300ml，显色在3min以内，时间较短，注意观察，立即终止，防止染过。

（5）

（6） 终止液（1.46%EDTA Na2 ?H2O）7.3gEDTA Na2?H2O，加Mill-Q水至500ml。 保存液（10%甘油）：25ml甘油，加Mill-Q水至250ml。

（7） 银染脱色储存液Ⅰ（30mM K3[Fe(CN)6]）:0.99g K3[Fe(CN)6]溶于100ml超纯水中。

（8） 银染脱色储存液Ⅱ（100mM Na2S2O3）:1.58g Na2S2O3或2.48g Na2S2O3?5H2O溶于100ml超纯水中。

注： 实验当日按所需量将储存液Ⅰ和Ⅱ按1:1混合成银染脱色工作液（15mM K3[Fe(CN)6]：50mM Na2S2O3）